贵州两种苦丁茶黄酮含量及抗氧化活性比较

　　苦丁茶(Rubus coreanus Maq.Var.corweanus)（Rosaceae）悬钩子属（Rubus Linn）多年生灌木，是药食两用植物。苦丁茶味甘、酸、性温，富含多种营养成分，具有较高的营养价值[1]。插苦丁茶果实、根、叶均可入药，具有补肾固精、平肝明目、活血止血、祛风除湿、明目、除湿解毒等功效，主治阳痿、不孕、目生翳障、风湿痹痛、跌打损伤、骨折、月经不调等疾病。插苦丁茶中含有插苦丁茶甙[2]、覆盆子甙[3]、黄酮[4]等多种生物活性物质。黄酮类化合物具有清除血栓、降血压、降血脂、促进脑部、心脏的血液循环等功效[5]，可用于治疗冠状动脉硬化、预防血液疾病等，可抑制肿瘤、消除体内自由基延缓衰老，可作为天然色素、甜味剂等食品添加剂[6]。黄酮类化合物的提取方法主要有：有机抗氧化活性提取法、微波提取法、超声波提取法、碱性稀醇或碱性水提取法和酶法等[7-11]。微波提取法设备较贵，超声波提取法提取率相对较低，碱性稀醇或碱性水提取法影响因素较多，酶法试剂相对较贵。与其它方法相比，有机抗氧化活性回流提取法，提取率高，设备简单，试剂较便宜，影响回流提取的因素少，可操控性强，更容易实现从试验室到工厂化生产。

　　Lascombe等[17]在研究尿路上皮细胞肿瘤发现正常尿路上皮组织中不表达苦丁茶黄酮类活性成分，但是随着肿瘤病理分级的增高，E-cadherin表达会减少而苦丁茶黄酮类活性成分表达会增加，证实了钙黏蛋白转换在肿瘤进展过程中起关键作用，可以作为肿瘤进展及预后的一种标志物。Jaggi[18]等对44例抗氧化活性标本进行检测，结果显示苦丁茶黄酮类活性成分阳性率为45%，且肿瘤Gleason grade级别越高，苦丁茶黄酮类活性成分阳性率越高。N-cadherin的反常表达使得它可以成为检测侵袭性抗氧化活性的生物标记物。

　　苦丁茶是具有多种保健功效的药用资源。目前人们对苦丁茶的认识还远远不够，其应用主要还停留在冲泡直饮方面，药用价值方面的利用还不够。苦丁茶中黄酮类化合物具有抗菌、消炎、清热解毒、镇静、利尿等作用外[7],它是大多数氧自由基的清除剂,对冠心病、心绞痛等疾病的治疗效果显著。苦丁茶及其提取物具有降低血压、调节血脂、改善心脑血管的血液循环、杀菌消炎等诸多功效[8]，是一种具有良好开发利用前景的饮用植物。苦丁茶实际上是一类代茶用植物的统称，目前市场上销售的苦丁茶制成品有大叶苦丁茶和小叶苦丁茶之分，两者的原植物品种有较大差异。特别是抗自由基和抗癌、防癌的作用,使黄酮类化合物的研究进入了一个新的阶段.[9]黄酮类化合物安全、无毒,在医药、食品加工等方面已被广泛应用。在苦丁茶植物资源、化学组成、药理作用等方面的研究已经取得了一些进展，但是在不同品种的苦丁茶化学成分对比、化学成分与药理作用的关联研究等方面的研究报导甚少[10]。黄酮类化合是广泛分布于各种植物的一类次生代谢产物，是药用植物的主要活性成分之一[11]。

　　苦丁茶是我国南部及西南部民间的传统饮品，具有有利祛湿、消炎退热、清心明目、提神醒脑的功效[8]。苦丁茶的植物来源可以分为冬青科冬青属（Ilex）和木犀科女贞属（），其中冬青属的植物有冬青Nex kudingcha C.J.Tseng、大叶冬青I.latifolia Thunb、枸骨I.cornuta Lindl.et part.等[12]。而木犀科来源的苦丁茶多见于我国南部及西南部地区，原植物有紫茎L.purpurascens Y.C.Yang、丽叶女贞、女贞、粗壮女贞.等[13]。经学者考证，贵州产苦丁茶的原植物以女贞属植物粗壮女贞为主[14]。苦丁茶中含有萜类、黄酮类、多酚类、苯丙素类、挥发油等多种化学成分[15]。黄酮类物质是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物，具有多种生物活性功能，如抗氧化、抗菌抗炎、抗病毒、抗过敏、以及血管舒张作用，还具有抑制脂质过氧化等作用[16]。由于黄酮类化合物种类繁多且结构复杂，并具有抗菌消炎、抗氧化、消除人体自由基、抗癌、调节心血管系统、内分泌系统、免疫系统等多种明确的药理作用，一直以来都是国内外研究的热点。

　　苦丁茶中包括黄酮苷和苷元的总黄酮已成为判定苦丁茶产品质量的标志性物质。由于苦丁茶日常主要用水泡服,苦丁茶水泡液中的黄酮应以亲水性黄酮苷为主,但目前常用于提取苦丁茶总黄酮的方法为95%乙醇回流提取2次[17],得到总黄酮后，计算出两种苦丁茶总黄酮含量，比较它们黄酮含量差异，用DPPH法测定两种苦丁茶中总黄酮的抗氧化活性得到结论。

　　研究同时发现，采用现行的黄酮含量分析方法，贵州大叶苦丁茶叶中的黄酮含量比贵州小叶苦丁茶含量多，差距不是太大[18]。产生这种差别的原因尚有待深入研究，但作者推测，产生的主要原因是品种的差异，本实验中，采用紫外分光光度法分析苦丁茶中的黄酮含量虽然比较简便，但是，容易带来分析误差的因素很多，如标准对照品的选择、样品的前处理、苦丁茶叶中其他成分的干扰等。所以，苦丁茶中黄酮含量的测定方法尚有待进一步研究。

　　目前对贵州两种苦丁茶中总黄酮含量及抗氧化活性比较研究比较少，吕雨晴，许海单，鲍洁以艺福堂大叶苦丁茶（杭州产）分别采用超声提取法，微波辅助提取法，索氏提取法，回流提取法，提取了大叶苦丁茶中的总黄酮。对DPPH自由基清除率的测定，对ABTS自由基清除率的测定，对黄酮还原能力的测定得出了对苦丁茶中黄酮抗氧化活性数据，以苦丁茶中的黄酮含量考察超声法，回流法，索氏法对苦丁茶中总黄酮的影响，以对DPPH自由基清除率的测定，对ABTS自由基清除率的测定，对黄酮还原能力的测定，得出了对苦丁茶中黄酮抗氧化活性能力的强弱，得出了不同方法对苦丁茶中黄酮含量差异的影响，以料液比1:40（g:ml）加入溶剂，浸渍提取黄酮大于回流提取大于超声提取大于微波提取大于索氏提取的结论，可以参考选取提取黄酮的方法，同时他也得到了超声提取黄酮的抗氧化活性是最强的方法，所以参考前人们的科研成果，我得到了提取黄酮的方法。

　　范东翠，丁晓雯测定了山苍子果实的无水乙醇提取液的抗氧化活性，实验结果表明，苦丁茶提取液在5ml时，其清除率可达87.5%。程超等以山鸡椒为原料，通过超声波辅助水蒸气蒸馏法对山鸡椒挥发油进行提取，利用邻苯三酚自氧化法和Fenton系统对自由基的清除作用，结果发现山鸡椒挥发油粗提物对羟自由基和超氧自由基具有明显的清除作用[20]。

　　倪峰等以木姜子根为原料，提取了木姜子根中的多糖，以宫颈癌U14为细胞模型并用木姜子根多糖提取物进行体内和体外对瘤细胞直接作用，结果显示研究发现，当木姜子多糖在150mg/kg浓度，有显著的抗肿瘤作用，多糖可以直接抑制HL60细胞的增殖[20]。

　　1.6对心血管疾病的作用

　　孙学惠等利用大果木姜子油对离体心脏平滑肌和血管平滑肌进行试验研究，结果发现大果黄酮对心脏平滑肌和血管平滑具有松弛作用；并利用猫急性心肌缺血的保护试验，结果也发现大果木姜子油对猫的动脉血管条亦有收缩作用[21]。这些证明木姜子对心血管疾病具有治疗作用。

　　1.6结语

　　综上所述，苦丁茶化学成分复杂，且具有多种生物活性，具有很高的药用价值，但是，目前对木姜子的开发研究还不够，大大限制了木姜子在药物方面的应用，因此，加大对木姜子的研究力度，对木姜子的开发利用是很有必要的。

　　2.1.1研究目的

　　贵州是遵义余庆栽培面积最大、栽培历史最悠久的地区之一。贵州苦丁茶子早已销往全国各地，受到消费者好评，尤其是在调料方面应用最广泛。但目前关于贵州苦丁茶中活性成分的研究报道较少，这大大阻碍了苦丁茶产品的发展。如果能够通过研究明确黔产木姜子中活性成分的含量及其作用，便可根据现代食品药品的需要，开发出贵州苦丁茶的产品。为了更好的开发利用贵州苦丁茶这一药食两用农业资源，造福人类，本研究对贵州两种苦丁茶中的总黄酮含量进行了进行了比较，而且比较了它们抗氧化活性的强弱。目的在于确定贵州大叶苦丁茶及小叶苦丁茶中总黄酮的含量和抗氧化活性的强弱。

　　2.1.2研究意义

　　苦丁茶中的黄酮已经被证实具有抗炎抗肿瘤等多种功效，还有其他生物碱，挥发油等多种化学成分也具有重要的药用价值。因此，苦丁茶在医药和食品方面有重大意义，市场上已经有各种的苦丁茶产品，如苦丁茶银杏片、苦丁茶等，但这些产品的原材料都是苦丁茶。贵州苦丁茶产量大、化学成分丰富、含量高，却只主要作为调料销售，这样一来就大大限制了销量，严重阻碍了贵州苦丁茶药物方面的发展。因此，取两种不同贵州苦丁茶研究它们黄酮含量差异及抗氧化活性差异，为苦丁茶作天然抗氧化剂的应用提供实验依据。

　　2.2.1研究内容

　　1.本试验以总黄酮含量及抗氧化活性为考察指标,以遵义的大叶苦丁茶及小叶苦丁茶为考察因素，通过比较两种苦丁茶中总黄酮含量及抗氧化活性差异得到结论。

　　2.采用超声波提取总黄酮方法，以芦丁为标准品，计算出总黄酮的浓度，利用公式计算出黄酮的总含量，用DPPH法测定苦丁茶中总黄酮的抗氧化活性

　　3.完成以上步骤，得出结论。

　　4.并利用紫外-可见分光光度计贵州两种苦丁茶中总黄酮的含量进行比较，最后通过DPPH自由基清除率实验测定贵州苦丁茶中总黄酮的抗氧化活性并进行比较。

　　2.2.2设计思路

　　2.2.2.1原料预处理

　　苦丁茶干品→干燥→粉碎→苦丁茶粗粉

　　2.2.2.2苦丁茶总黄酮的提取流程

　　2.2.2.3含量测定

　　1.本试验以总黄酮含量及抗氧化活性为考察指标,以遵义的大叶苦丁茶及小叶苦丁茶为考察因素，通过比较两种苦丁茶中总黄酮含量及抗氧化活性差异得到结论。

　　2.采用超声波提取总黄酮方法，以芦丁为标准品，计算出总黄酮的浓度，利用公式计算出黄酮的总含量，用DPPH法测定苦丁茶中总黄酮的抗氧化活性

　　大叶苦丁茶和小叶苦丁茶干品各250g；芦丁标注品20mg；DPPH20mg。

　　3.2.1仪器设备

　　表3.1仪器设备

　　名称型号厂家

　　恒温水浴锅四孔（AA605112）上海梅香仪器有限公司

　　旋转蒸发仪RE-52A上海亚荣生化仪器厂

　　循环水真空泵SHB-Ⅲ上海亚荣生化仪器厂

　　紫外-可见分光光度计

　　电子天平

　　电热鼓风干燥箱

　　超高速智能粉碎机722

　　MA110

　　101-2型

　　CS-1000上海欣茂仪器有限公司

　　上海良平仪器仪表有限公司

　　天津市泰斯特仪器有限公司

　　武义海纳电器有限公司

　　3.2.2主要实验试剂

　　表3.2实验主要试剂

　　名称分子式分子量纯度厂家

　　无水乙醇CH3CH2OH 46.07 AR

　　95%乙醇

　　3.2.3主要试剂的配制

　　5%亚硝酸钠溶液的配制：称取5g亚硝酸置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，既得5%的亚硝酸钠溶液，密塞待用。

　　10%硝酸铝溶液的配制：称取10g硝酸铝置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，既得10%的硝酸铝溶液，密塞待用。

　　4%氢氧化钠溶液的配制：称取4g氢氧化钠置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，既得4%的氢氧化钠溶液，密塞待用。

　　3.3.1标准曲线的绘制

　　3.3.1.1对照品溶液的配制

　　精密称取芦丁对照品20mg，用70%乙醇溶解，并定容至50mL容量瓶中，密塞备用，即可得到0.4mg/mL的芦丁标准溶液。

　　3.3.1.2标准曲线的制备

　　分别吸取芦丁对照液0ml、1mL、2mL、3mL、4.0mL、5mL至于5支25mL比色管中，加入5%亚硝酸钠溶液4mL，摇匀放置5min，加入10%硝酸铝溶液4mL，放置5min，加入4%氢氧化钠溶液16mL，再用70%乙醇稀释至刻度，放置0.5h，通过最大吸收波长扫描，芦丁标准品在505nm出有最大吸收值（如图3.3.1所示），故于505nm波长处以空白作对照进行比色测定。

　　图3.1最大吸收波长的测定

　　3.3.2贵州苦丁茶黄酮提取的研究

　　通过查阅相关文献了解到从木姜子中提取苦丁茶总黄酮的溶剂主要有甲醇及乙醇两钟，但考虑到实验室操作安全及回收利用等因素，本试验以乙醇为提取溶剂。

　　3.3.2.1乙醇提取两种苦丁茶黄酮含量比较

　　称取大叶苦丁茶和小叶苦丁茶粗粉各5g，加70%的乙醇，于70℃恒温水浴中回流提取2h，分3次提取。提取完成后抽滤，合并滤液，减压浓缩并定容至25mL，按照标准曲线的制备方法检测粗提物中黄酮的含量，平行测定三次，取其平均值。

　　表4.1总黄酮系列标准溶液的吸光度

　　芦丁液溶度（mg/ml）0.016 0.024 0.032 0.040 0.048

　　吸光值A 0.161 0.254 0.338 0.430 0.519

　　根据上表以横坐标为芦丁标准溶液溶度，纵坐标为吸光值绘制标准曲线图如下：

　　图4.1芦丁标准曲线图

　　4.2.1平行测定表一

　　表4.3不同苦丁茶溶液体积总黄酮的检测结果

　　苦丁茶体积（ml）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

　　吸光值A 0.371 0.481 0.513 0.501 0.497

　　总黄酮含量（mg/g）10.052 12.582 13.321 13.034 12.942

　　分析数据，作出对不同浓度大叶苦丁茶含量的图：

　　4.2.2平行测定表二

　　表4.3不同苦丁茶溶液体积总黄酮的检测结果

　　苦丁茶体积（ml）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

　　吸光值A 0.381 0.482 0.514 0.50 0.498

　　总黄酮含量（mg/g）10.053 12.583 13.322 13.034 12.934

　　分析数据，作出对不同浓度大叶苦丁茶含量的图：

　　由上图表可知，贵州苦丁茶和BHT对DPPH的清除率在不同浓度下清除能力不同，在本实验测定的浓度（0.002、0.004、0.005、0.008、0.01mg/mL），贵州苦丁茶对DPPH的清除率是低于对照组BHT的。但是其清除率随着贵州苦丁茶浓度的提高而呈现上升的趋势。这有可能是由于木姜子挥发油浓度的提高，其抗氧化活性物质含量也随之增加，从而提高了贵州苦丁茶对DPPH的清除率，也得到了贵州遵义余庆小叶苦丁茶清除率大于贵州大叶苦丁茶，即抗氧化活性也大于它。

　　1.通过单因素试验确定了黔产木姜子正交试验的因素范围，在单因素试验中初步确定薯蓣皂苷的提取条件为乙醇浓度70%，时间2h，料液比1:20，提取温度为70℃最佳。

　　2.对正交试验结果的分析，考虑多方面的因素，最终确定了黔产木姜子总黄酮的提取工艺。

　　4.采用可见分光光度法对木姜子粗提物进行分析，得黔产木姜子中总黄酮的含量。说明木姜子有很大的发展前景，不仅仅是停留在食品上，也可以向药品、保健品方向开发。

　　从木姜子中提取黄酮的方法有很多，由于条件因素的影响，本实验只选择了一种方法进行提取比较。而试验过程中提取部分由于时间和耗材的关系只做了两组平行，难免会存在误差。

　　木姜子性辛、苦、温，温补而微香，不仅是临床上一种常见的中药，也是一种广受欢迎的调料，对于一些体质不好的人来说，也是传统的保健食品。而对木姜子的研究还很少，随着研究的深入，明确木姜子的化学成分和生理活性作用原理，对其化学成分和分离方法进行研究，找到工艺环境友好，无污染的研究路线。那么，可以根据医疗和保健的需要开发产品，如木姜油、木姜子食物添加剂等。总之，木姜子在医药、食品等方面都会具有很好的应用潜力和研究价值。

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　　[19]苦丁茶及苦丁茶片暂行质量标准.苏卫药(81)准字82号

　　致谢

　　论文到此已圆满完成，在整个过程中从最初的确定题目到实验方案的设计、实验器材和试剂的购买、实验操作，再到完成实验、处理数据、撰写论文，每一个环节都凝聚着刘莹老师的关心和指导。论文初稿完成时有很多不规范的地方，感谢刘老师给予我宝贵的建议。刘老师对待知识和工作的态度深刻的影响着我，这几个月里我从刘老师那里学到了很多东西，也感受到了老师对待生活的乐观豁达。

　　论文到此结束，在此，我衷心的感谢刘老师对我的精心辅导和在方面给予我的关怀和教导。在这里，我真诚地向您说声“谢谢”；同时，我还要感谢我的班主任李卓林老师，感谢您四年来对我的帮助和教导；感谢张瑶、黎明月、黄光阳等同学在我整个实验过程中给予我的帮助和支持。

　　最后，向食品与制药工程学院所有关心和帮助过我的老师和同学表示诚挚的谢意！向论文的评阅人和答辩委员会的老师们表示最诚挚的谢意！