基于COⅡ基因的我国海域4个长蛸群体的遗传变异研究

　　长蛸(Octopus variabilis)是我国沿海重要的海洋头足类，又名马蛸、长腿蛸、大蛸，属软体动物门（Mollusca）头足纲（Cephalopada）蛸科（Octopodidae）蛸属动物，分布于我国黄海、渤海、东海和南海海域。长蛸肉味鲜美，营养丰富，具有补气养血，收敛生肌的作用，经济价值高，是畅销国际国内市场的水产品，也一直是我国重要的海洋捕捞种类之一。但近年来，由于我国沿海头足类资源的大力开发，捕捞强度日益加大，其资源量也日趋衰退。为了更有效地保护和管理我国的长蛸资源，维持其可持续采捕，同时也为今后长蛸资源更合理的人工开发，有必要对其种群结构和遗传变异作深入的研究，从而为我国长蛸资源的保护和管理提供必要的指导。

　　目前关于长蛸遗传多样性的研究资料还非常少，在国内外仅见于等位基因酶的遗传变异研究[9]，鲜有从线粒体DNA上研究长蛸的遗传多样性。线粒体DNA(mtDNA)作为细胞中的相对独立的核外遗传物质，广泛的存在于生物体的各种组织细胞中，由于其具有分子量小、分子结构简单且稳定、母性遗传、一级结构进化速度快、突变率高、均一、无组织特异性等特征，易于分离纯化[10]，重复性好，已成为研究动物起源进化，群体遗传分化及系统发育的理想研究材料[11]，在渔业资源研究方面得到广泛应用[12]。目前，随着DNA测序技术和分子信息学的快速发展，线粒体DNA作为一种优良的标记技术广泛的用于生物的遗传变异研究[13,14,15]。线粒体细胞色素氧化酶亚基II(Cytochrome oxidase II,COⅡ）是mtDNA 13个蛋白质编码基因之一,该基因的产物是细胞色素氧化酶亚基II,后者是细胞色素氧化酶的重要组成部分。与其他线粒体蛋白质编码基因相比,COⅡ基因的进化速率较快,常被用来研究亲缘关系较近的种、种下分类单元以及地理种群之间的关系[16（2）]。

　　本文利用PCR扩增产物直接测序的方法对来自山东青岛、浙江温州、浙江舟山、福建东山的89个个体的COII基因片段序列进行了测定和分析，从线粒体DNA水平分析我国不同海域长蛸群体的遗传变异情况，期望为开展长蛸群体的资源评价、物种保护及分子标记育种提供遗传学资料，同时与其他海域长蛸群体的序列进行了比较，为其种质资源的保护、管理以及对物种的起源进化及长蛸群体结构和遗传分化的研究提供基础资料。

　　长蛸成体样本89尾，于2008年采自4个不同自然海域（青岛群体21尾、舟山群体23尾、温州群体22尾、东山群体23尾），全部野生。长蛸规格体长大约在15-27cm，体重约100克，健康状况良好。经鉴定后冰镇活体空运回实验室，取肌肉3-5g立即冻存于-70℃冰箱中备用。

　　1.2.1实验所用的基本试剂

　　去离子水：实验室自制

　　琼脂糖：中国医药上海化学试剂公司

　　氯仿：国药集团化学试剂有限公司

　　NaCl：国药集团化学试剂有限公司

　　浓盐酸：国药集团化学试剂有限公司

　　无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司

　　乙酸钙：国药集团化学试剂有限公司

　　冰乙酸：国药集团化学试剂有限公司

　　酚：国药集团化学试剂有限公司

　　异戊醇：国药集团化学试剂有限公司

　　蛋白酶K：宝生物工程（大连）有限公司

　　乙二胺四乙酸（EDTA）：北京鼎国生物技术发展中心

　　三羟甲基氨基甲烷（Tris）：国药集团化学试剂有限公司

　　十二烷基硫酸钠（SDS）：宝生物工程（大连）有限公司

　　以上试剂均为国产分析纯；

　　10×buffer（Mg2+free）、MgC12、dNTP、Taq酶、DL 2000 DNA Marker、引物(COI、16S rRNA)均购自上海捷瑞生物工程有限公司。

　　1.2.2自配试剂

　　（1）5M NaCl溶液：NaCl 73.1g溶于200ml水中，定容至250ml，高压蒸汽灭菌，4℃保存；

　　（2）70%乙醇溶液：350ml无水乙醇与150ml水混匀；

　　（3）0.5M EDTA溶液：EDTA 146.12g溶于300ml水中，加入少量NaOH浓溶液，使之完全溶解，加少量浓盐酸调整PH至8.0，加水定容至1000ml，分装成500ml后，高压蒸汽灭菌，4℃保存；

　　（4）50×TAE缓冲溶液：Tris 242g，冰乙酸溶液57.1ml，0.5M EDTA（PH=8.0）100ml，加水定溶至1000ml；

　　（5）10%SDS溶液：电泳级SDS 25g溶于200ml水中（水浴加热至68℃），加少量浓盐酸调整PH至7.2，加水定溶至250ml，高压蒸汽灭菌，4℃保存；

　　（6）1M Tris-HCl溶液：Tris 121.14g溶解于500ml水中，加少量浓盐酸调整PH至8.0，加水定溶至1000ml；

　　（7）TE抽提缓冲液：5ml 1M Tris-HCl溶液，10ml 0.5M EDTA溶液，加水定溶至500ml，高压蒸汽灭菌，4℃保存；

　　（8）TE溶模板：5ml 1M Tris-HCl溶液，100ul 0.5M EDTA溶液，加水定溶至500ml，高压蒸汽灭菌，4℃保存；

　　（9）蛋白酶K（20mg/ml）：20mg可溶性蛋白酶K加入到溶解缓冲液（1ml 50mM Tris-HCl PH=8.0，加0.237mg乙酸钙，终浓度1.5mM）中，充分溶解混匀，用PCR管分装成每管100ul，-20℃冷冻保存；

　　（10）氯仿异戊醇（24:1）溶液：4ml异戊醇溶于96ml氯仿溶液中，混匀4℃保存；

　　（11）1.5%的琼脂糖凝胶：琼脂糖0.45g放入锥形瓶中，加入30ml 1×TAE缓冲溶液，置微波炉加热至完全溶解，取出混匀，则为1.5%琼脂糖凝胶液。

　　1.2.3琼脂糖凝胶板的制备

　　0.8%的琼脂糖凝胶板：取洗净晾干的制胶槽放置于一水平位置，并放好样品梳子，将冷却到60℃左右的0.8%琼脂糖凝胶液缓缓倒入制胶槽内，形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡），待胶凝固后取出梳子。

　　锥形瓶：容量250ml，中国医药（集团）上海化学试剂公司

　　烧杯：容量100ml，500ml，1000ml，国药集团化学试剂有限公司

　　量筒：容量50ml，100ml，250ml，中国医药（集团）上海化学试剂公司

　　广口瓶：容量250ml，500ml，国药集团化学试剂有限公司

　　移液器：容量2.5ul、10ul、20ul、100ul、200ul、1000ul，法国Gilson公司

　　立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-50S11型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂

　　电热恒温鼓风干燥箱：GZX-9070MEB型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂

　　电热恒温水浴锅：HWS26型，上海一恒科学仪器有限公司

　　电子天平：EL104型，上海梅特勒-托利多仪器有限公司

　　实验室PH计：FE20型，上海梅特勒-托利多仪器有限公司

　　美的微波炉：MM823ESJ-PA型，广东美的微波炉制造有限公司

　　离心机：GL-166-II型，上海安亭科学仪器厂

　　双稳定电泳仪：DYY-8C型，北京市六一仪器厂

　　BIO-RAD凝胶成像仪：GDXI型，X伯乐BIO-RAD公司

　　PCR仪：PTC-200型，X伯乐BIO-RAD公司

　　海尔冰箱（4℃、-20℃）：海尔BCD-539WF型，对开门，中国海尔集团

　　上菱冰箱（-70℃）：上菱BCD-123型，上海上菱电器制造有限公司

　　玻璃棒：购自江苏省泰兴市振科仪器厂

　　一次性PE薄膜手套：购自上海市医用卫生材料厂

　　20µl、200µl及1000µl Tip枪头：购自上海捷瑞生物工程有限公司

　　0.2ml、1.5ml及5ml Eppendorf管：购自XAxygen公司

　　1.5.1长蛸基因组DNA的提取

　　基因组总DNA的提取采用常规的“酚-氯仿”抽提法[22,23]。取保存于-70℃冰箱中的长蛸样品的少量肌肉组织100mg于1.5ml离心管中，加入475ul TE抽提缓冲液，将样品肌肉组织用医用剪刀剪碎（尽量细），加入25ul 10%SDS溶液，终浓度为0.5%，混匀后加入5ul 20mg/ml蛋白酶K至终浓度50ug/ml，55℃水浴消化约4h。水浴消化完全后取出冷却，加入500ul饱和酚（等体积），轻摇8分钟，12000转/分钟冷冻离心10分钟，用扩口吸头移出含DNA的上清液，重复上述步骤两次。加入等体积的饱和酚：氯仿（1:1），轻摇10分钟，12000转/分钟冷冻离心10分钟，用扩口吸头移出含DNA的上清液。加入等体积的氯仿异戊醇（24:1）溶液，轻摇10分钟，12000转/分钟冷冻离心10分钟，用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相。加入1/25体积的5M NaCl溶液（终浓度为0.1mol/L）和2倍体积的预冷的无水乙醇沉淀DNA，上下颠倒数次，可见白色絮状DNA，-20℃沉淀30分钟，12000转/分钟冷冻离心10分钟，弃上清液。用70%乙醇溶液300ml清洗沉淀一次，12000转/分钟冷冻离心10分钟，弃上清液。风干沉淀，加入100ul TE溶模板（PH=8.0）轻摇溶解，母液4℃冰箱保存备用[24]。

　　1.5.2基因组DNA的检测

　　提取后的DNA用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，每一个DNA样品取5ul溶解的DNA母液和约1ul上样缓冲液混匀后小心上样，在另一加样孔加入DL 2000 DNA Marker 3ul作为Marker，在双稳定电泳仪上电压保持122V，1×TAE缓冲溶液中电泳分离25分钟左右。电泳结束后，用EB溶液染色20分钟左右，在X伯乐BIO-RAD公司的GDXI型凝胶成像仪下检测所提DNA是否完整，估计DNA的浓度和大小。

　　1.5.3基因组线粒体基因的扩增[25]

　　（1）PCR扩增引物

　　本实验选用线粒体DNA中的COII基因片段为目的DNA片段。基因片段扩增所选用的引物为曼氏无针乌贼的扩增引物[26]，引物由上海捷瑞生物工程有限公司代为合成。

　　COII基因片段扩增所用引物的核苷酸序列为：

　　COII r：5'-GTATAAATGAGTGRTTTGCWCCAC-3'；

　　COII f：5'-TGACCCAATGAGGACAATTAGG-3'。

　　（2）PCR反应体系

　　PCR扩增反应在X伯乐BIO-RAD公司的PTC-200型PCR仪上进行。在0.2ml PCR薄壁管内配制50ul反应体系，依次加入以下组分：

　　（3）PCR反应程序

　　按下面的循环程序进行PCR扩增反应：94℃预变性5分钟后，进行40个循环的扩增，扩增程序为94℃变性1分钟，51℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，全部循环完成后72℃再延伸5分钟，4℃维持。取不同的4个海域（青岛、温州、舟山、福建）长蛸群体进行群体扩增。

　　1.5.4琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物

　　PCR扩增结束后，每一个PCR扩增产物取5ul扩增产物和约1ul上样缓冲液混匀后在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，以DL 2000 DNA Marker作为Marker，在双稳定电泳仪上120V电压下电泳分离25分钟左右，电泳缓冲液为1×TAE缓冲溶液。电泳结束后，用EB溶液染色20分钟，在X伯乐BIO-RAD公司的GDXI型凝胶成像仪下观察和拍照，存图。

　　1.5.5扩增产物的序列测定和数据分析

　　对PCR扩增产物进行序列测定。测序由上海英俊生物科技有限公司完成。测序结果通过bioedit7.0，phylip3.5，MEGA3.1等软件工具[27]计算所得序列的碱基组成、遗传距离、颠换转换位点以及UPGMA系统树。再用DNAsp4.10（DNA sequence polymorphism）软件进行多态性位点、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数等遗传多样性参数的计算。用Arlequin3.01软件估算遗传变异在群体内和群体间的分布（AMOVA法），并计算群体间遗传分化系数Fst及显著性（重复次数1000），群体间基因流Nm由公式Nm=（1-Fst）/2 Fst计算而得。采用Fu’s Fs检验来检测中性假说是否成立,Fu’s Fs中性检验结果如为负值并且显著偏离中性，则可能是由于群体扩张引起的。

　　随机取89个不同海域（青岛21个、温州23个、舟山22个、东山23个）长蛸样品进行基因组总DNA提取，所得到的基因组总DNA用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，经EB溶液染色后，在BIO-RAD凝胶成像仪下观察到一条比较明显的DNA带（图1）。从图中可以看出：长蛸基因组DNA提取效果较好，有个别样品残留有较多的杂质。杂质残留的原因可能是因为消化不完全或抽提时间不充分而使RNA和蛋白质有残留。由于PCR扩增特异性很强，要求的DNA量也很少，所以RNA和蛋白质的残留一般不影响实验的结果。

　　M：DL 2000 DNA Marker

　　图1青岛长蛸群体基因组总DNA

　　Fig.1 DNA of Qingdao Octopus variabilis

　　利用曼氏无针乌贼的扩增引物对4个海域长蛸群体的89个个体的基因组总DNA进行了线粒体COII基因片段的PCR扩增，均获得了特异性很好的PCR产物，在BIO-RAD凝胶成像仪下观察到一条清晰的DNA带（图2）。从图上可以观察到，长蛸的线粒体COII基因片断为560bp左右。

　　M：DL 2000 DNA Marker D1～D22：温州长蛸样品COII基因扩增产物

　　M：DL 2000 DNA Marker D1～D22：samples are from Wenzhou

　　图2温州长蛸群体COII基因片段扩增产物

　　Fig.2 PCR amplyplified products of COII in Wenzhou Octopus variabilis

　　2.3.1长蛸COII基因片段的基本统计与分析

　　（1）碱基组成

　　对4个长蛸群体共89个个体的COII序列进行测定，经clustal w1.83软件编辑和比对后，获得了长度为560bp长度的同源序列，经Mega 3.1软件分析，该序列的T、C、A、G碱基含量分别为35.5%、19.0%、35.6%和9.9%。A+T含量（71.1%）大大高于G+C（28.9%）含量，符合一般头足类CYTB基因的序列特点，DNAsp4.10软件分析显示，89个个体共检测到235个变异位点，占分析位点总数的42.0%，其中单突变位点（Singleton varible sites）108个，简约信息位点(Parsimony informative sites)127个；变异均匀地分布于序列各个区域，但密码子偏好不明显，主要发生在编码区密码子的第3位上，占变异位点的43.4%，其它变异均发生在1和2位点上，分别占变异位点的30.6%和26.0%；

　　（2）遗传变异分析

　　用DNAsp4.10软件对各长蛸群体的遗传变异参数进行统计，结果如表2所示。89个个体共有28个单倍型，其中青岛群体8个，舟山群体7个，温州群体6个，福建东山群体7个；总群体单倍型多样性指数（H）0.884±0.018，核苷酸多样性指数（Pi）0.10640±0.00656，平均核苷酸差异数（K）57.348，显示出一定的遗传多样性。对4个群体的遗传变异参数进行比较，发现福建东山群体的遗传多样性相对较高，福建东山群体的的HD、Pi值和K值分别为0.522±0.124、0.02665±0.01999和14.443，其他3个群体的HD、Pi值和K值分别在0.407-0.790、0.00110-0.00233、0.619-1.305之间。

　　图4长蛸COII基因测序峰图

　　Fig.4 Gene sequencing-map of Octopus variabilis based the sequence of COII fragement

　　2.4长蛸群体的遗传分化与基因流

　　遗传参数统计表明，4群体在单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数等遗传参数上也存在较大的差异，如表2所示；对群体间分化系数（Fst）和基因流（Nm）进行检测表明，4个群体之间均具显著的遗传分化（p﹤0.05），其中温州群体与其他3个群体之间分化最为显著，分化系数均在0.910以上，基因流Nm均小于1；虽然4个群体之间的遗传分化系数比较大而且呈显著分布，但是4个群体之间仍有一定的基因流（Nm﹥1），结果见表3；AMOVA分析进一步显示长蛸群体间的遗传差异有6.84%存在于群体内部，93.16%存在于群体之间，进一步证实了长蛸群体间的分化。

　　(其中QD、ZS、WZ、FJ分别代表青岛、舟山、温州、福建)

　　Fig.5 UPGMA phyliogenetic tree of Octopus variabilis based the sequence of COII fragement

　　采用Mega 3.1软件对89个个体进行UPGMA聚类分析，结果表明，所有个体可以明显聚为2支，一支由青岛、舟山和福建群体的个体组成，另一支由温州群体的个体组成，如图2所示；根据4个群体的遗传距离进一步作群体聚类也表明，青岛、舟山和福建3个群体由于遗传距离较近首先聚为一支，而温州群体另聚为一支。遗传距离分析表明，两支间的遗传距离达到了0.204；对两类群进行Tajima’s D和Fu’s FS检验，结果表明温州群体可能经历过种群扩张（Tajima’s D﹤0，Fu’Fst﹤0，p﹤0.05）；而其它3个群体可能未经历过历史扩张事件（Tajima’s D﹤0，Fu’Fst﹤0，p﹥0.05）。

　　长蛸属软体动物头足纲动物，有关其DNA提取及分子生物学方面的研究还不多见，本文采用常规酚氯仿抽提法，对长蛸DNA进行了提取，结果发现，能很好地提取出长蛸的DNA，如本文图1所示，但DNA提取过程我们发现，虽然这种方法提取的DNA主带仍较明显，但却有较多残留杂质产生，这一方面可能是RNA造成的拖带现象，另外也可能是由于提取过程的碎片段造成的，这在本实验室其他同学和其它头足类（短蛸、曼氏无针乌贼）的提取中都有发现，但采用其它方法（实验室其他同学和老师的工作）却未有这么明显的拖带现象。同时实验还发现采用这种方法提取的DNA，会在胶孔位置留下较多的白色印记，可能是蛋白质，这些都是今后在长蛸DNA提取方面需要进一步完善的地方。

　　对于长蛸线粒体基因的扩增，如前所述，本文采用曼氏无针乌贼线粒体基因的扩增引物对长蛸的COII基因进行了扩增，结果发现，能得到特异性非常高的亮带，如结果中图2所示，将该引物与其它软体动物如贝类，甚至其它鱼类相比，发现相同的引物也能在这些海洋生物中扩增出基因来，该结果说明海洋头足类的线粒体基因可能与其它动物的线粒体基因之间同样存在较高的保守性，其它生物的线粒体基因引物可以在头足类中得到很好的应用，这为今后其它头足类线粒体基因的研究奠定了良好的基础。

　　本文采用线粒体COII基因对4个海域（青岛、温州、舟山、福建）长蛸遗传变异进行了研究。89个个体共有28个单倍型，其中青岛群体8个，舟山群体7个，温州群体6个，福建群体7个；总群体单倍型多样性指数（H）0.884±0.018，核苷酸多样性指数（Pi）0.10640±0.00656，平均核苷酸差异数（K）57.348，显示出一定的遗传多样性。对4个群体的遗传变异参数进行比较，发现福建群体的遗传多样性相对较高，福建群体的的HD、Pi值和K值分别为0.522±0.124、0.02665±0.01999和14.443，其他3个群体的HD、Pi值和K值分别在0.407-0.790、0.00110-0.00233、0.619-1.305之间。从实验结果来看，4群体在单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数等遗传参数上也存在较大的差异，变异均匀地分布于序列各个区域。

　　目前无脊椎动物线粒体DNA中A+T含量较高已被许多学者证实[30]，本实验引用的长蛸群体从COII基因片段获得的碱基组成看，该序列的T、C、A、G碱基含量分别为35.5%、19.0%、35.6%和9.9%。A+T含量（71.1%）大大高于G+C（28.9%）含量，符合一般头足类CYTB基因的序列特点，DNAsp4.10软件分析显示，89个个体共检测到235个变异位点，占分析位点总数的42.0%，其中单突变位点（Singleton varible sites）108个，简约信息位点(Parsimony informative sites)127个；变异均匀地分布于序列各个区域，但密码子偏好不明显，主要发生在编码区密码子的第3位上，占变异位点的43.4%，其它变异均发生在1和2位点上，分别占变异位点的30.6%和26.0%。

　　本实验中通过与青岛群体、舟山群体、温州群体和福建群体序列的遗传多样性参数比较，并进行聚类分析，构建分子系统进化树。结果表明，所有个体可以明显聚为2支，一支由青岛、舟山和福建群体的个体组成，另一支由温州群体的个体组成，根据4个群体的遗传距离进一步作群体聚类也表明，青岛、舟山和福建3个群体由于遗传距离较近首先聚为一支，而温州群体另聚为一支。表明温州群体可能经历过种群扩张，而其它3个群体可能未经历过历史扩张事件，关于我国海域4个长蛸群体遗传结构形成的具体原因还有待于今后研究的进一步证实。

　　长蛸由于其营养丰富，具有很高的经济的价值，它的养殖前景十分看好。本文的研究结果为进一步研究长蛸的遗传变异、种群遗传结构和系统进化打下基础，同时为开展长蛸群体的资源评价、物种保护及分子标记育种提供遗传学资料，为长蛸的进化研究积累资料。但是要想进一步了解其遗传背景还需其他分子生物学方面的资料，如线粒体其他基因、核基因组DNA等。当然传统的形态学研究可能也是今后进一步研究的重点。

　　本实验通过对4个不同海域（青岛、温州、舟山、福建）长蛸群体的COII基因片段的遗传变异研究，检测到4个群体之间均具显著的遗传分化，其中温州群体与其他3个群体之间分化最为显著。遗传距离分析表明，温州群体可能经历过种群扩张而其它3个群体可能未经历过历史扩张事件。就遗传多样性分析，福建群体的遗传多样性相对较高，个体间虽存在一定的遗传差异，但遗传差异程度很小，不存在明显的群体内分化。这一结果表明，群体间的遗传距离随地理位置的远近表现出一定的正相关关系：地理距离越近则遗传距离越小，遗传相似程度越高。

　　[1]凌去非,李思发,殷建国.丁鱥不同群体线粒体COⅡ基因序列分析[J].水利渔业,2007,(01).

　　[2]周明栋,王伟定,叶雅球,郑根仕,夏伟宏.短蛸人工养殖技术初探[J].渔业现代化,2007,(01):31-32.

　　[3]张伟伟,雷晓凌.短蛸不同组织的营养成分分析与评价[J].湛江海洋大学学报,2006,(04):91-93.

　　[4]张学舒,人工环境中短蛸的繁殖行为和胚胎发生[J].浙江海洋学院学报(自然科学版),2003,(03):220-224.

　　[5]刘祖洞等.遗传学[M].北京:高等教育出版社,2001:257-260.

　　[6]张国范,张福绥.海洋贝类遗传多样性及其永续利用[J].海洋科学,1993,（5）:17-21.

　　[7]马克平等.生物多样性研究现状及发展趋势,生物多样性研究的原理与方法[M].北京:中国科技出版社,1994,1-13.

　　[8]陈灵芝.中国的生物多样性现状及保护对策[M].北京:科学出版社,1993,1-9,99-113,210-212.

　　[9]高强,王昭萍,王如才,郑小东.五个短蛸群体等位基因酶的遗传变异[J].海洋湖沼通报,2002,(4):46-50.

　　[10]闫华超,贾少波,许恒龙,齐桂兰.动物线粒体DNA提取简易流程及其优化[J].生物技术通讯,2007(1),18(1):95-97.

　　[11]廖顺尧,鲁成.动物线粒体基因组研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(5):508-511.

　　[12]苏天凤,江世贵,朱彩艳等.广西钦州湾养殖牡蛎线粒体16S rRNA基因片段序列变异分析[J].中国水产科学,2005,12(1):259-263.

　　[13]苏天凤,江世贵,朱彩艳,吴进锋.粤西镇海湾近江牡蛎线粒体16S rRNA基因序列变异分析[J].湛江海洋大学学报,2004,4(24):1-4.

　　[14]赵凯,李军祥,张亚平等.青海湖裸鲤mtDNA遗传多样性的初步研究[J].遗传学报,2001,23(5):445-448.

　　[15]唐文乔,胡雪莲,杨金权.从线粒体控制区全序列变异看短颌鲚和湖鲚的物种有效性[J].生物多样性,2007,15(3):224-231.

　　[16]卜云,郑哲民,郭昆.五种真蝽(Pentatoma olivier)mtDNACOⅡ基因序列分析及系统发育关系初探(半翅目:蝽科)[J].昆虫分类学报,2005,27(2):90-96.

　　[17]Wang CH,Li SF.Phylogenetic relationship of ornamental(koi)carp.Oujiang color carp and long-fin carp revealed by mi-tochondrial DNA COⅡgene sequences and RAPD analysis.Aquaculture,2004,131:83-91.

　　[18]王成辉,李思发.中国红鲤线粒体COI基因的遗传变异和亲缘关系[J].遗传学报,2004,31(11):56-60.

　　[19]郑小东,王如才,王昭萍.头足类遗传变异研究进展[J].水产学报.2001(01).

　　[20]Liu H,Beckenbach AT.Evolution of the mitochondrial cyto-chrome oxidase II gene among ten orders of insects.Mol.Phylogen-et.Evol,1992,(1):41-52.

　　[21]寇静,廉振民.基于mtDNA-COII基因部分序列探讨蟋蟀科五属的进化关系(直翅目:蟋蟀科)[J].昆虫分类学报,2006,(02).

　　[22]常林瑞,孙振兴,李莉,李云玲.刺参基因组DNA的提取及RAPD条件的优化[J].湖北农业科学,2007,(01):18-20.

　　[23]Kocher T D,Thomas W K,Meyer A,et al.Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals:amplification and sequencingwith conserved primers.PNAS,1989,86:6196-6200.

　　[24]Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular Cloning:a Laboratory Manual(second edition).Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,954～9551.

　　[25]魏群.分子生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1999,90-92.

　　[26]郑小东.中国沿海乌贼类遗传变异和系统发生学研究[D].青岛海洋大学,2001:36-50.

　　[27]Kumar S,Tamura K,Nei M.MEGA 3:an integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment.Brief Bioinformatics,2004,5(2):150-1631.

　　[28]王成辉,李思发,刘至治,龚小玲,黄雷,宋晓,赵岩.3种中华绒螯蟹群体线粒体COⅡ基因序列测定与进化分析[J].水产学报,2008,(01).

　　[29]Katugin O N,1993.Genetic variation in the squid Berryteuthis magister(Breey,1913)(Oegopsida:Gonatiade)[A].Okutani T,O dor R K,kubodera T,eds:Recent advances in fisheries biology[C].Tokyo:Tokai University Press,201-213.

　　[30]杨建敏,郑小东,王如才等.3种鲍16S rRNA基因片段序列的初步研究[J].青岛海洋大学学报,2003,33(1):36-40.

　　[31]马克平等.生物多样性研究现状及发展趋势,生物多样性研究的原理与方法[M].北京:中国科技出版社,1994,1-13.

　　[32]徐梅英,李继姬,郭宝英,吕振明,周超,吴常文.基于线粒体DNA 12S rRNA和COⅢ基因序列研究中国沿海7个长蛸(Octopus variabilis)野生群体的遗传多样性[J].海洋与湖沼,2011,(03).

　　本课题实验和学位论文是在指导老师吕振明博士的亲切关怀和悉心指导下完成的。吕振明老师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。

　　本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢。以及班主任刘雪珠老师在学习生活方面给予我很大的帮助，在此表示真诚的谢意!在实验过程中，李红梅师姐在数据处理方面给予了我很大的帮助，在此表示诚挚的感谢!

　　在四年的大学生涯里，还得到众多老师的关心支持和帮助，在此，谨向老师们致以衷心的感谢和崇高的敬意!

　　南非真蛸分子系统地理学再研究：

　　德班码头第二群系的鉴定

　　P.R.Teske A.Oosthuizen I.Papadopoulos N.P.Barker

　　动科与昆虫系，罗德斯大学，格雷厄姆6140，南非；分子生态和系统学组，植物学系，罗德斯大学，格雷厄姆6140，南非；南非国家公园，伊丽莎白港6031，南非；动科系，曼德拉城市大学，伊丽莎白港6031，南非

　　摘要：一项早期的研究表明，南非沿岸所有真蛸群体的细胞色素氧化酶Ⅲ基因测序是均一的，这个发现很奇怪，这是因为线粒体基因具有快速突变的特点，南非的许多海洋无脊椎生物均显示出了明显的遗传变异和遗传结构。我们再次采用细胞色素氧化酶Ⅰ基因（COⅠ）和大的核糖体亚单位16SrRNA对以往的样品进行研究，结果表明，这两个基因在真蛸群体间均显示出明显的遗传变异，因此，以前的结论即南非真蛸缺乏基因多态性是错误的，一些来自德班（非洲东南角）的真蛸样本基因型与别的地区显著不同（例如特里斯坦·达库尼亚和塞内加尔）。我们认为德班附近的真蛸群系是最近才引入的。

　　前言

　　海洋生物的遗传结构通常与其扩散能力呈负相关(Palumbi 1994)，最新的研究表明南非海岸自然分布的无脊椎生物具有明显的基因构型多态性，其中一些广布种存在2个或更多的群系（Ridgway 1998;Teske et al.2006;Zardi et al.2007）。相反，绝大多数主动扩散的生物则展现出了很少甚至无遗传结构(Tolley et al.2005;Klopper，2005;Norton 2006;but see Gopal et al.2006),，这表明南非沿岸物种的遗传结构在很大程度上与其扩散模式具有很大的关联性。之前的一个南非真蛸遗传结构的研究中，Oosthuizen et al.(2004)在从豪特湾（西海岸）到艾尔弗雷德港（南海岸）捕捉的35个真蛸个体中，只鉴别出了一个COⅢ基因型，这个结论是可以理解的，因为真蛸幼虫具有50～60天的浮游，而且成年真蛸也具有迁移能力。尽管如此，所有的序列都是相同的也还是有问题的，因为线粒体基因具有快速突变的特点，而且一个古老的生物族群应该显示出一些基因多态型。南非真蛸缺乏遗传结构可能有很多解释:（a）南非真蛸遇到了基因瓶颈或奠

　　基者效应；（b）真蛸的线粒体DNA进化得比别的海洋生物要慢很多；（c）取样误差（这一点不大可能，因为别的研究也是这么取样的）；（d）.基因扩增的时候有污染（这个也不大可能，因为我们得到的序列和沃纳克独立进行实验得到的序列是一致的[Warnke 1999])）；（e）之前得到的COⅢ基因并不是来自线粒体，而是假基因的扩增产物（线粒体假基因是线粒体DNA转移到核DNA中的片段），其具有比其同源线粒体基因低得多的突变率。我们得到的COⅢ序列并不含有终止密码子和移码突变的现象，这表明其可能是来自于一个无功能的假基因。而且如果转移是发生不久的，那也不会有足够的时间让其突变。

　　在本研究中，我们再次分析了Oosthuizen所研究的样本，通过测定16SrRNA和COⅠ的序列，观察其是否呈现出基因多态型，以确定以上哪种假设是其缺失基因多态性的最大可能，同时，我们还研究了南非其他地方的真蛸16SrRNA和COⅠ基因。

　　材料与方法

　　我们从之前Oosthuizen所研究的三个区域：豪特湾、Struisbaai、伊丽莎白港，分别采集了部分真蛸。同时，我们在南非东海岸取了8个样（德班7个、Umhlanga1个），在别的地区也采集了一些和南非真蛸具有密切血缘关系的真蛸样品，分别是特里斯坦·达库尼亚的南亚特兰蒂岛（3个种）、西亚的塞内加尔（3个种）和西班牙（雅特兰蒂海岸3个种、中海岸1个种）。

　　DNA提取和基因扩增采用Teske等的方法(Teske et al.2004,2006)。COⅠ基因扩增引物如下（Folmer et al.1994）：LCO1490：(5'
-GGT CAA CAA ATC ATAAAG ATA TTG G-3')和HCO2198(5'-TAA ACT TCAGGG TGA CCA AAA AAT CA-3'。16SrRNA引物如下（Palumbi，1996)：16SarL：(5'-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3')和16SbrH(5'-CGG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3'。

　　图1显示的是东大西洋的采样点。缩略语代表以下地方：GA,加利西亚（西班牙的大西洋海岸）;ME，地中海沿岸的西班牙；SE，塞内加尔；TC，特里斯坦达库尼亚；HB，豪特湾；SB，Struisbaai；PE，伊丽莎白港；DB,德班；UM,Umhlanga

　　数据分析

　　序列分析采用MEGA 3.1(Kumar et al.2004)，16SrRNA序列中含有一个短的微卫星序列，其不具有地域性特点，分析时应将其排除。16SrRNA和COⅠ序列综合分析采用Arlequin 3.1(ExcoYer et al.2005)。

　　为了确定是否真蛸线粒体DNA比别的生物慢，我们比较了真蛸和别的头足纲动物的COI和COIII的相对配对率。实验依据programme RRTree(Robinson-Rechavi andHuchon 2000)，测定了B4（4倍简并位点）的同义突变和Ka（非同义突变），实验所用的头足冈动物均具有基因多态性。实验比较了真蛸和剑尖枪乌贼及L.Plei的COI进化率，在GenBank上比较了真蛸和Sepia apama的COIII基因进化率，实验所用的序列如“Appendix 1”所示。

　　结果

　　本实验得到了23个COⅠ序列和24个16SrRNA序列，均提交给了GenBank(基因号DQ683205–DQ683251)，发现了18个16SrRNA(去掉gap的话是7个)和6个COⅠ独特的基因型，16SrRNA平均长度为508bp（真蛸），COⅠ平均长度为526bp。实验结果显示，南非5个地区采集的真蛸均具有1个独特的构型区（如图2所示）

　　图2综合南非、特里斯坦库尼亚、塞内加尔和西班牙的章鱼的COⅠ和16SrRNA序列，建立的基因网络图，小黑圈表示的是以上样本没有体现出的内部节点，缩略语意义如下：HB,豪特湾；SB，struisbaai；PE,伊丽莎白港；DB，德班；SE,特里斯坦达库尼亚；GA,加利西亚（大西洋海岸的西班牙）；ME，地中海沿岸的西班牙。

　　讨论

　　本实验所得到的南亚真蛸的COⅠ基因和16SrRNA的基因多态性，表明早前的实验所得到的COⅢ序列并不是假基因的扩增，并且也没有充分数据表明真蛸的线粒体基因比此地域的头足纲动物（其展现了很高的基因多态性）突变率低，这表明南非真蛸群体遇到了基因瓶颈或是新近才形成的。

　　然而，这也很难解释为什么在南非有两个真蛸群系的出现。1个全系占绝对优势沿着海岸线广泛分布，而另1个只有在德班才有发现，这一现象表明后者有可能是最近才形成的。它在南非最繁忙的港口附近才发现显示其可能是港口轮船所排出的压舱水中带有的，而且它和另一群系基因上紧密联系，地域上的远距离表明此亚种是最近才形成的。需要更进一步的研究才能确定德班的真蛸群系是从它处引入的（如果是此种情况，那么其他地域的真蛸应和其基因型一致）亦或是它是别的种属新近运动到德班的（如果是此种情况，它应和其他区域的真蛸基因型有差异）。BLASTN 2.2.14分析结果显示德班附近真蛸的COⅠ基因和16SrRNA和其余地方（欧洲、塞内加尔、南非、特里斯坦·达库尼亚、X、日本）均有显著差异，但仍需在另外地区采集更多的样品以进一步分析，例如东部非洲、印度和东南亚。

　　致谢

　　非常感谢Francisco Santaclara(Vigo,Spain)向我们提供西班牙和塞内加尔的真蛸组织。James Glass向我们提供特里斯坦·达库尼亚的真蛸样品。Pierre Pradervand提供了德班和Umhlanga的真蛸样品。我们也很感谢3位评审专家提出了非常有建设性的意见，感谢Claude Harris Leon基金为本实验提供的资金支持。本实验所进行的研究符合当前南非的法律。