丹参素对糖皮质性骨质疏松症的影响研究

　　丹参素(DSS)是一种水溶性酚性芳香酸类化合物,主要来源于唇形植物丹参和甘西鼠尾草的根，始载于《神农本草经》。丹参素是一种天然活性产物且具有清除氧自由基、降解过氧化物及抗氧化特性,其抗氧化活性强于维生素C。

　　目前对OP防治的研究有增加BMD和改善骨质量两个方面，而检测骨质量变化最直观的方法之一便是骨形态计量学分析，检测结果对OP具有特殊的价值和意义。骨组织形态计量学是生物医学组织中形态计量学和体视学的一个分支，是依据骨组织的生理结构，以视觉原理为基础，通过目标图像的分析测量来计算实验数据，获得骨组织微结构的相关参数。其与BMD检测技术相比，骨形态计量学分析除了定性分析骨组织形态变化情况外，还可以对皮质骨的厚度和孔隙率、骨小梁面积与宽度和新骨组织生长速率等骨的微结构特征进行定量分析，从客观上衡量骨组织的生理学特性。虽然骨组织形态计量学有诸多的优点，但其也具有准备工作繁琐、制作过程对样本造成破坏、影响后续研究等缺点。而且传统的静态二维测量忽视了骨小梁各项特异性特征，基于二维参数推导出的三维结构也很难真实的反映骨的微观结构。随着针对无损材料检测和三维微聚焦计算机断层扫描摄影技术（Micro-CT，μCT或者显微CT）的出现，为骨微结构的三维分析和定量计算提供了更方便的检测方法和更精确的测量结果[77,78]。所以，二维分析结合Micro-CT分析将更为准确的表述骨组织的形态，为OP骨组织研究提供更加准确的结果。

　　5月龄雌性SPF级wistar大鼠30只，体重为(300±20)g，由中国人民解放军兰州总医院动物实验科提供，动物检验合格证编号：SYXK(军)2012-0029。饲养室温度(22±2)℃，湿度为(55±5)％，不限制饮食饮水，饮用水为纯净水，SPF级大鼠饲料喂养，普通饲养笼中饲养。

　　丹参素（上海麦克林生化科技有限公司）；水合氯醛（北京通县育才精细化工厂）双能X线骨密度仪（XGE）公司；AG-IS型电子万能试验机（日本岛津公司）；炔雌醇(中国食品药品检定研究院,ID:GAJ7-N8RF,纯度≥99.5％)，LD4-2A低速离心机(中国，北京医用离心厂)，酶标仪（XBioTek公司）；骨钙素试剂盒（英国IDS）公司。SP1600硬组织切片机（德国，LEICA公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒（英国IDS）公司

　　将30只大鼠随机分为三组，空白对照组、雌二醇组、丹参素组，每组10只，编号后记录体重。雌二醇组采用雌二醇灌胃，灌胃浓度为0.21mg/ka;丹参素组采用丹参素灌胃(12.5mg.kg-1.d-1)；空白对照组采用蒸馏水灌胃，调整灌胃体积与丹参素组等量，每周一测定员次体重，每周的灌药量根据周一体重做相应调整，灌胃时间为早上10：00-10：30。

　　分别在灌胃4、8、12周后，用10％的水合氯醛以3.5ml/kg的剂量腹腔注射麻醉后置

　　于双能X线骨密度仪测量大鼠全身骨密度；12周后处死，将大鼠左侧股骨和腰椎分离，测定离体骨密度。

　　将大鼠右侧股骨分离，置于万能力学实验机进行三点弯曲试验，跨距设置为15mm，加载速度为2mm/min,测定最大载荷(N)和弹性模量（N/mm2）、屈服强度（N）和断裂点载荷（N）。取第4腰椎，剔除多余的软组织，修剪为近似圆柱体，加载速度为2mm/min,测定最大载荷和弹性模量。

　　用采血针抽取大鼠腹腔静脉血液，置于离心机4000r/min离心机20min取上清-80℃保存；ELISA试剂盒测定血清TRAP-5b、OC水平，按说明书绘制标准曲线，于酶标仪405nm和450nm处测定吸光度值，计算其含量。

　　将大鼠处死，将分离出来的右侧胫骨保存于70％的乙醇中，不脱钙塑料包埋法包埋，硬组织切片机切，用砂纸膜片，后行苏木素碱性品红-苦味酸染色，观察骨组织形态。

　　统计分析均采用SPSS20.0软件完成，所有检测数据以均属±标准差（）表示，不同组间采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验法。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　如图1所示，三组大鼠喂养12周后，体重比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

　　如表1所示，丹参素组灌胃后全身骨密度及离体骨密度高于空白对照组，低于雌二醇组，雌二醇组灌胃8周后全身骨密度及离体骨密度均高于空白对照组（P＜0.05，P＜0.01）

　　如表2所示，丹参素组和雌二醇组股骨弹性模量、最大载荷和腰椎最大载荷、屈服强度均高于空白对照组（P＜0.01），丹参素组生物力学性能指标均低于雌二醇组，

　　如表3所示，丹参素组和雌二醇组TRAP-5b水平均低于空白对照组，OC水平高于空白对照组，（P＜0.01），丹参素组TRAP-5b水平高于雌二醇组，OC水平低于雌二醇组（P＜0.01）。

　　如表4所示，胫骨组织中，丹参素组和雌二醇组骨小梁数量明显密集，骨小梁分离度明显低于空白对照组，雌二醇组骨小梁数量高于丹参素组，雌二醇骨小梁分离度低于丹参组。

　　骨质疏松的特点是骨量减少进而增加骨折的风险性，骨质量受损，骨强度降低是骨质疏松发生的重要因素，丹参素常被中医用于理气止痛、活血化瘀、增加机体代谢和免疫力以及心脑血管疾病的治疗。研究表明，丹参素对大鼠的TNF-a的生成来抑制炎症反应，防止破骨细胞的产生，从而减少骨丢失。崔燎等的研究报道，丹参水提取物可以有效预防糖皮质激素引起的骨质疏松症，其机制与促进成骨细胞活性和骨机制形成、抑制骨吸收有关。此外，研究表明，丹参素能够促进成骨细胞活性，可用过减少骨丢失、促进骨细胞生成，抑制骨吸收，近年来，中成药被用于治疗骨质疏松的效果已被证实，但用于青年大鼠峰值骨量的研究较少。本研究通过对青年大鼠灌胃丹参素，用雌二醇作为阳性对照组，来研究其对青年大鼠峰值骨量的影响。本实验结果显示，雌二醇、丹参素灌胃12周以后，骨密度明显高于空白对照组，但丹参素组低于雌二醇组，研究表明雌二醇和丹参素都能明显提升青年大鼠峰值骨密度，但雌二醇因其直接补充雌激素，骨密度提高更显著，说明雌激素是影响骨密度的直接因素，丹参素虽能抑制炎症反应，但其并不能发挥直接雌激素的作用。

　　骨生物力学是评价骨强度和骨质量的可靠方法，骨生物力学反映骨本身的强度和韧性，与骨骼矿物质含量和骨密度相关，且不受形状大小的影响。本研究结果显示，雌二醇组和丹参素组股骨弹性模量、最大载荷和腰椎屈服强度、最大载荷均高于空白对照组，但丹参素组股骨弹性模量和腰椎最大载荷要比雌二醇组较低，提示灌胃丹参素和雌二醇能改善股骨质量，增加股骨骨强度、腰椎屈服强度和最大载荷、改善结构力学性能，但丹参素效果不如直接补充雌激素效果好。

　　血清生化指标直接反映了大鼠体内骨代谢的状态，能够客观的反映大鼠骨吸收和骨形成的作用。TRAP-5b是血清中骨吸收相关因子，OC是血清中骨形成的相关因子，促进骨形成，降低骨吸收是增加骨量的最有效途径。本研究结果显示，丹参素组和雌二醇组TRAP-5b水平均低于空白对照组，OC水平高于空白对照组，丹参素组TRAP-5b水平高于雌二醇组，OC水平低于雌二醇组。研究表明丹参素和雌二醇都可以通过增加血清骨形成相关因子OC的表达，同时能够降低骨吸收相关因子TRAP-5b的表达而影响代谢，但丹参素效果不如雌激素效果好。

　　骨形态计量学将揭示骨组织生理性病变机能的改变与组织定量学研究的有机结合，可以有效的评价骨转化和骨结构。与BMD检测相比，骨形态计量学虽然操作复杂，但是其指标敏感度非常高，能直观和形象的对皮质骨和松质骨进行定量和定性分析[85]。通过对骨重建、骨结构和骨量变化的研究，对于解释和评价电磁场对骨组织作用效果的研究具有重要的意义。XFDA要求，对具有全新的抗OP药物和治疗手段的效果研究中，必须提供骨形态计量学研究的相关资料[86]。通常，我们使用骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁面积百分比（Tb.Ar%）和骨小梁分离度（Tb.Sp）等作为对骨质量测量和判断的参数。一般情况下，骨小梁宽度一定时骨小梁数量越多则认为骨量越高。

　　本研究表明，胫骨组织中，丹参素组和雌二醇组骨小梁数量明显密集，骨小梁分离度明显低于空白对照组，雌二醇组骨小梁数量高于丹参素组，雌二醇骨小梁分离度低于丹参组。

　　综上所述，直接补充雌激素治疗骨质疏松效果要优于丹参素，但试验中发现，使用雌激素灌胃的大鼠出现了严重的脱毛现象，毒副作用较大，不适用于临床研究，而使用丹参素灌胃的大鼠并没有出现这种现象，大鼠状态基本正常，毛色光亮，肝脏切片无明显影响。药丹参素能够通过提高大鼠全身和离体骨密度、增强股骨生物力学性能、促进血清中骨形成相关因子、增强股骨生物力学性能、促进血清中骨形成相关因子的表达、调节成骨细胞数量等多个方面促进骨形成，因此，中成药丹参素有望成为治疗、预防骨质疏松的新药物

　　骨质疏松症分为原发性和继发性两大类，糖皮质激素性骨质疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是最常见的继发性骨质疏松症。GIOP的发病机制尚未明确。目前建立GIOP动物模型的方法多样，有灌胃、皮下注射或埋植、肌肉注射等，常用激素有波尼松、氢化可的松、地塞米松等。糖皮质激素对整体骨骼产生双方面的影响,一方面可以降低卵巢、皋丸、肾上腺的性激素合成与分泌,减少胃肠钙的吸收,增加肾脏钙的排泄,引起继发性甲状旁腺功能亢进;另一方面,直接抑制成骨细胞的功能,降低其更新转换率,缩短其寿命,并可直接刺激破骨细胞的活动,增加骨组织对甲状旁腺激素(PT H)和1.2 5-(OH)2-D3的敏感性等,而在总体上造成成骨作用减弱,破骨作用加强,加之肠钙吸收减少,尿钙排出增加,负钙平衡,渐至骨盐丢失、骨质疏松发生。由于引起GIOP的病因复杂,目前临床上并没有理想的治疗或预防的药物。已证明,应用糖皮质激素产生的药物性高皮质醇血症可引发多种骨损害,包括骨质减少、骨质疏松、骨坏死和骨折等,骨质疏松症是骨折的主要原因。糖皮质激素性骨质疏松症患者常常有全身骨痛,身高变矮,驼背等临床症状,由于患者体内的骨量明显减少,故骨骼脆性增加,很容易造成骨折,尤以腰椎、股骨等负重骨骨折最为常见,严重者致残,给患者家庭和社会带来极大的负担。的发病率仅次于绝经后妇女骨质疏松及老年性骨质疏松症而居第3位,据统计,在接受糖皮质激素治疗的慢性疾病的病人中,最终30%-50%发展为骨质疏松。病人在接受治疗头6个月骨丢失最快,以后每年骨丢失2%-5%,引起的骨折发生率是非接受糖皮质激素治疗患者的一倍。此外,糖皮质激素还有一常见的并发症是无菌性或血管缺血性骨坏死,由此可引起病人股骨头骨折和跌倒。而且在接受糖皮质激素治疗的病人只有其骨质疏松不良反应得到有效的治疗。因此是不容忽视的医源性疾病问题。丹参水溶性提取物丹参注射液在临床广泛用于防治心血管疾病,具有抗脂质氧化、扩张微循环和抗炎等作用,我们认为这些药理作用可能是对抗的理论依据。我们用肌肉注射地塞米松的方法建立OP动物模型，通过骨密度检测、骨生物力学、生物化学指标、骨形态计量学几个方面的实验研究来探讨丹参素对GIOP影响机制。

　　丹参素可预防GC引起的大鼠体重降低。实验结果表明,GC有明显抑制大鼠体重增长的作用。这种作用于给药后第二周即出现,本实验中的大鼠,体重至实验结束一直都再无增加。无论给予雌二醇或丹参素治疗,与模型组比较,体重明显增加,在实验期间大鼠的体重逐渐恢复,到实验结束时,体重几乎与正常对照组相近。有文献报道体外注射生长激素可对抗的这种作用,因此,可以推测糖皮质激素这种抑制生长的作用,与超生理剂量的对抗体内生长激素的作用有关。

　　丹参素可促进骨形成。降低骨吸收是增加骨量的最有效途径。血清生化指标直接反映了大鼠体内骨代谢的状态，能够客观的反映大鼠骨吸收和骨形成的作用。TRAP-5b是血清中骨吸收相关因子，OC是血清中骨形成的相关因子，研究表明丹参素和雌二醇都可以通过增加血清骨形成相关因子OC的表达，同时能够降低骨吸收相关因子TRAP-5b的表达而影响代谢。

　　丹参素明显增加大鼠松质骨骨小梁面积、骨小梁数目和骨小梁宽度,减少骨小梁间隙。在本实验中,对这些GC处理的大鼠,同时加以丹参素作预防治疗,能完全防止骨质的丢失,并提高其骨的力学强度。实验结果说明,丹参素不仅有效预防造成生长期大鼠所致的松质骨骨丢失,还能促进皮质骨骨形成,增强骨的力学荷载和抗弯强度。从形态学结果分析,这种作用,与它抑制破骨细胞功能,促进骨外膜骨合成有关。

　　腰椎是含松质骨较多的部位,因此,我们还观察了大鼠骨形态结构及其力学强度关系的作用。结果显示，GC作用第6周，腰椎的力学性能无明显改变。在腰椎,GC并未造成骨小梁面积的明显下降。本实验并未发现大鼠椎腰的骨量减少,与人类不同,人体由于直立行走的原因,腰椎是承载重量的部位,而大鼠腰椎承重比四肢的少。在骨的组织结构有病理变化时,力的作用只能增加其骨折的发生率,临床上,GC引起骨质疏松性腰椎骨折较常见,原因是人体腰椎与承重有很大关系。因此，GC对大鼠腰椎的影响,仍需一进步探讨,特别对骨组织的不同部位的影响、的剂量、用药时间的影响等。

　　综上所述，丹参素能够预防糖皮质激素性骨质疏松症引发的体重降低，促进骨生成，降低骨吸收，使大鼠松质骨骨小梁面积、骨小梁数目和骨小梁宽度增加,减少骨小梁间隙，有望能够为治疗骨质疏松提供基础药物依据。

　　目前临床治疗OP主要以西药为主，其具有一定的疗效，但都有较大的不良反应，如CT在临床上出现了恶心呕吐、食欲减退、头晕乏力、面红发热的不良反应[43]。而中药正好具有副作用小的特点，因此，探索有效的中药临床治疗迫在眉睫。从中医理论角度出发，肾虚、血瘀和脾虚是造成OP的“三大元凶”，目前关于补肾预防与治疗OP的研究颇多，但是从血瘀和脾虚角度出发进行研究的很少。具活血化瘀作用的中药丹参具有多种生物活性，早已被广泛运用到医学领域中。丹参为唇形科植物丹参的干燥根,是著名的传统中药,具有抗氧化、改善微循环,防止血栓形成等多种作用,丹参的水溶性提取物丹参注射液广泛应用于临床治疗心脑血管病己达多年。蔡辉等[45]认为活血化瘀中药用于临床治疗骨质疏松症时具有效果明显，毒副作用小，靶点多的优点。因此探索活血中药单体丹参素来预防与治疗骨质疏松症无疑具有潜在价值。本研究就针对此问题得出以下主要结论：

　　一、肌肉注射地塞米松可成功建立GIOP的动物模型，简单易行，周期短。活体整体的骨密度和离体股骨的骨密度测定均可用于评价GIOP造模的结果，活体整体骨密度测定可能更适于评价骨质疏松造模的结局，有利于实验的顺利进行，为探讨GIOP的发病机制和药物作用等研究提供更好的实验基础。本实验用腹腔注射地塞米松造模成功，为今后研究GIPO提供了依据。

　　二、药丹参素能够通过提高大鼠全身和离体骨密度、增强股骨生物力学性能、促进血清中骨形成相关因子、增强股骨生物力学性能、促进血清中骨形成相关因子的表达、调节成骨细胞数量等多个方面促进骨形成，因此，中成药丹参素有望成为治疗、预防骨质疏松的新药物

　　三、丹参素能够预防糖皮质激素性骨质疏松症引发的体重降低，促进骨生成，降低骨吸收，使大鼠松质骨骨小梁面积、骨小梁数目和骨小梁宽度增加,减少骨小梁间隙，更能够说明丹参素对治疗糖皮质激素性骨质疏松症有很好的疗效，有望能够为治疗骨质疏松提供基础药物依据。

　　在本研究第三章下荧光素观察中为了得出更加准确地结果，使用了三种荧光素进行标记，而荧光素图片显示黄色较淡，而红色和绿色明显较粗，有些部位黄色甚至被红色覆盖，因此，在进一步研究时适当调整各荧光素的配置浓度，也许观察效果会更加明显，统计结果会更加准确。丹参酮ⅡA水溶性差，影响大鼠对药物的吸收，为了解决此问题，本研究在配置丹参酮ⅡA混悬液的时候将丹参酮ⅡA粉末置于研钵中，加入1-2滴吐温80助溶，再进行研磨并加定量蒸馏水制成混悬液，置于4℃冰箱内，因此，考虑将丹参酮ⅡA单体制成某种制剂使其药物溶解度提高，这不失为一种对未来临床使用丹参酮ⅡA的理想展望。另外，多种指标显示丹参酮ⅡA具有防治骨质疏松的作用，但从安全用药角度分析，丹参酮ⅡA在体内的代谢过程尚不清楚，因此，进一步探索丹参酮ⅡA对绝经后骨质疏松症的研究很有必要，从而为更具选择性与安全性的绝经后骨质疏松治疗新药的开发提供理论依据与实验基础。