白菜矮化突变体cd1生理特性及初步定位

摘 要

白菜是我国原产蔬菜，具有悠久的栽培历史，拉丁文学名为Brassica pekinensis（lour）Rupr，属十字花科芸薹属，二年生的草本植物，是中国各地广泛栽培食用的蔬菜之一。

本试验以课题组以构建好的EMS诱变突变体库中的矮化突变体cd1与野生型为试验材料，通过对它的表型以及生理指标鉴定、细胞学鉴定、外源喷施激素处理、花粉活力鉴定等进行分析，然后对cd1进行初步定位、候选基因的鉴定以及表达量分析，主要研究结果如下：

1、白菜矮化突变体cd1表型以及花粉活力鉴定分析表明：突变体cd1植株明显矮化，与野生型相比较，cd1生长缓慢、下胚轴极短，叶片颜色加深、有刺毛且伴有叶裂性状、叶面积变窄、叶脉突出、根的伸长明显受到抑制，侧根数目明显减少，总根数也显著降低。当突变体cd1抽薹开花时，我们发现cd1的花瓣中雄蕊明显花粉较少。醋酸洋红染色结果显示cd1中未发现有活力的花粉粒，说明花粉无活力。

2、生理指标鉴定结果发现：突变体cd1叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量都比野生型要高，因为其中叶绿素的含量比较高，从而导致突变体cdl的光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度也高于野生型，可以说明，颜色加深有助于光合作用，由于蒸腾速率低于野生型，说明突变体cd1对外界环境的适应能力较强。

3、细胞学鉴定结果表明：观察叶片发现，细胞数目明显减少，且排列不规则。因此，推测叶片表型的不同是由于细胞数目减少和细胞不规则排列造成的。观察茎秆发现，茎秆组织的薄壁细胞和中柱细胞未能在纵向上正常伸长，这表明cd1主茎细胞分裂过程受抑制，从而导致细胞数目减少。从而影响茎秆变短。

4、外源喷施赤霉素结果表明：外源施加赤霉素的矮化突变体cd1在株高上出现恢复现象，其他性状比如叶片，在叶长、叶宽以及叶片起伏程度上都无明显变化。所以，矮化突变体cd1对于赤霉素外源激素处理具有一定的敏感性，并推测突变体cd1株高变矮的原因是因为激素合成缺陷导致的。

5、通过对BSR-Sep的结果进行验证与分析，确定目标基因的位置。然后通过大白菜3.0数据库，利用Primer5软件展开SSR引物设计，有效选取出具备多态性的引物以及相关突变体cd1基因并完成了相应的连锁标记，从而最终确认矮化突变体cd1基因的位置在引物L06-09与L06-14之间（物理位置21621766-24683923）。

6、本研究对其候选基因进行差异表达分析，最终确定三个候选基，分别为：BrA06g031210.3C、BrA06g034110.3C、BrA06g033010.3C，这三个候选基因将在后续精细定位中进一步验证。

　关键词：表型鉴定；生理指标分析；细胞学分析；初步定位；候选基因

第一章 文献综述

1.1 农作物矮化突变体的研究进展

玉米，小麦与水稻等在国内外都被广泛种植，是很重要的粮食作物。伴随世界人口的数目日益上升，人们对于蔬菜以及相关粮食的需求量也不断增加;同时全球气候逐渐恶化并且耕地面积也不断减少。这些负面影响对农作物的产量产生了较大影响。从而，如何满足人们对蔬菜和粮食的正常需求，如何将土地资源的利用率最大化，以及如何尽可能的提高农作物的产量便成了育种界研究的重中之重。农作物的植株产量都会多多少少受各种农艺性状的影响，同时农艺性状也被用来衡量农作物的品质。一个理想植株的衡量条件包括植株密度、叶片夹角、植株的紧密程度等。植株株高较矮，抗倒伏能力就强；植株的紧密程度可以适当改善种植密度，更加合理化去利用光能，也可进一步确保相关农作物总产量显著提升。

植株高度可以归结为农艺性状重中之重指标之一。其中理想化株型在一定程度上能够显著增加农作物产量（李祖亮 2015）。20世纪中叶，水稻的半矮杆品种经过大力的选育和推广，使得水稻单产提高了25%左右，这被誉为全球范围内水稻作物上的‘绿色革命’。育种学家发现半矮化品种能够提高产量后，将矮化/半矮化基因引入到重要的农作物中，通过降低农作物的高度进一步培育出相对较为理想化的株型，进一步有效缓解高产以及易倒伏之间的矛盾(Hedden P. 2003, Salamini Fet al.2003)。

目前，育种科学家在粮食作物玉米、小麦、水稻、大麦中(Ashikari Met al.1999，白丽君2014，Huang H X et al.1998)以及园艺作物豌豆、黄瓜、番茄、西瓜中以及拟南芥等其他植物中已经分离出矮化突变体。(Yan J Det al.1998，虞慧芳2002) 经研究表明，这一系列的基因在一定程度上能够针对DELLA相关蛋白展开有效编码，相应的DELLA蛋白可归结为凭借赤霉素进行信号转导的负调控因子，还能起到抑制植株发育的效果，展开实验的过程中，首先对其亚细胞展开定位，进一步得知其位于细胞核当中，其具体N端结构包括：17个氨基酸序列以及5个相应的DELLA蛋白，可将其归类为转录因子。其在各种形式的作物当中均呈现出一定的保守性，需要注意的是，相应的N端特征相对较为丰富，故能够有效彰显出生物效应的差异性。

经过科学家大量研究表明，大多数植物矮化形式的突变体与植物激素内部所含的赤霉素（Gibberellin，GA）以及油菜素内酯（Brassinolide，BR）有关，少数植物也与生长素（Indole-3-acetic acid，IAA）有关，此外，在生理方面，比如植株的细胞壁、细胞膜不正常发育或在细胞伸长、分裂过程中受到一定程度的干扰也会引起植株的矮化现象，还有一些矮化突变体是由某些同源异型盒相关基因的差异表达造成的（Sakamoto Tet al.2004，Kwon Met al.2005，王翠红 2016）。目前为止，科学家根据植物矮化突变体对喷施外源激素的反应情况来看，将其分为两类，一类为激素缺陷型（敏感型），另一类为激素不敏感型（王武全 2017，Cheng Wet al.2016）。敏感型矮化突变体通常是在编码激素过程中，相关酶基因的突变造成的，使矮化突变体的内源活性激素含量明显降低或痕量存在，当外源施加相应的激素后，突变体的矮化性状即可恢复。（Matusmoto Tet al.2016，Yu D Qet al.2018），激素不敏感型矮化突变体的内源活性激素含量与野生型相比较，有两种情况，一种为无显著性差异，另一种为显著高于野生型，并且外源施加相应的活性激素后没有恢复其株高。（王月华 等2006，Magda Pet al.2019，Gruszka Det al.2016）。

矮化突变体的来源有两种，分别是自然突变和诱导突变。自然突变的频率较低，但经过人工选择后，便可以得到更多优质的育种资源。诱导突变是凭借人工干预，让它的染色体畸变或者使它的植物基因组的DNA造成损伤，诱导突变的途径可以是化学诱变还可以是物理形式的诱变。其中物理诱变具体凭借物理方式，譬如射线、激光微束以及超声波等方式诱导植物体发生一定的基因变异;所谓的化学诱变可归结为利用一些可以造成 DNA 损伤的化学诱变剂去处理植物材料，在化学诱变剂中，研究和应用最为广泛的主要是烷化剂，目前，在植物突变体培育当中，其中最受相关学者欢迎的便是甲基磺酸乙酯(EMS)。在一定程度上可有效实现 DNA 碱基替换。譬如，叠氮化钠可归结为呼吸抑制剂，在进行呼吸途中可进一步切断电子流的传递，致使相应的呼吸途径产生一定的突变(刘平 等2010)。凭借叠氮化钠针对水稻种子进行处理，随相应的剂量的逐步提升，则造成一系列的矮化突变(张志胜 等 2005)。

　1.1.1玉米矮化突变体的相关现状

玉米在我国是种植面积最大的农作物，它在各个领域都有涉及，尤其在经济作物、粮饲和能源作物中占有重要地位，并且玉米的年产量和播种面积在农作物种植比例中都占有很高的比重（赵久然2018）。由于矮杆玉米本身的抗倒伏，可以对株型结构进行改善以及可以使光能的利用率得到提高，因此，它可以在玉米的种植方面能起到一定的改善作用。

最近几年来，对于合理密植玉米能够提高产量这一观点，已经得到社会的广泛认可。但是密植也有一定缺点，比如在提高产量的同时，也增加了倒伏的风险（张洪生2009，刘鑫2012）。种植密度过大就会导致玉米基部节间的直径变小，并且整体高度与穗位高度也会随之增加（黄海2014，程云2015，姚敏娜2013），也会减少茎粗系数，降低节间抗折压力。当大风雨天气来临时，从玉米拔节期至成熟期这整个阶段，大田中玉米的倒伏率就会显著上升（张洪生2018，勾玲2010，Chen Set al.2012）。但是矮杆玉米植株较矮、株型紧凑，并且它抗倒伏能力强、光能利用率较高，非常适合高密度的广泛种植。自从农业“绿色革命”起到现在，遗传育种相关人员逐步探究出多种形式玉米矮化突变体(Olejniczak J et al.1994),植株外观整体呈现出叶片相对较为窄小以及株型紧凑等，但是因为这一系列的突变体与很多不良的表型连锁，所以不能应用在实际的农业生产中。经遗传育种家们对这一系列突变体展开相应的表型分析，凭借QTL 以及图位克隆等方式进行了相关探究，最后有效获取到限制玉米株高的一系列相关基因。1935年，玉米br2基因被Emerson发现，它是玉米矮化的主效控制基因也是当前形势下运用相对较多的基因。其中br2基因可进一步降低玉米节间，在果穗下方相应的节间位点处尤为明显（Multani DS et al.2003）。20世纪60年代，相关学者基于种间杂交即“东风一号”的自交所呈现出后代里探究出矮生系植株，对此筛选出“南矮1 号”以及“龙696”、等形式矮生系。

基于更多的试验研究可知，植物激素在株高调控方面起主导作用，已经克隆的基因绝大部分均与激素合成、运输途径以及信号传导密切相关。这些植物激素具体可归结为赤霉素以及生长素等种类。截止到当前，绝大多数的玉米矮化突变体受植物激素中赤霉素的影响。玉米矮化突变可以大致凭借外源施加赤霉素是否可以令它恢复到野生型表型归结为以下几类：其一是赤霉素敏感型，其二是赤霉素非敏感型(Phinney B.Oet al.1982)。其中敏感类型相关突变体具体可包括：dwarf1（d1）,d2,d3,d5 以及anther ear1（an1）。这些基因，都是因为赤霉素展开合成的途径呈现出一定的缺陷，从而进一步导致植株矮化。(Spray C.Ret al.1996)，而且绝大多数可归结为隐性突变基因。非敏感类型突变体当前已被发现的可归结为：Dwarf8（d8）以及D9，且都是显性突变(Harberd N.Pet al.1989, Winkler R.Get al.1995)。基于现阶段相关研究结果可知，玉米内部的BELL基因，BLH12以及BLH14有效协同控制玉米节间的相关发育。

严建兵及其团队凭借玉米群体杂交中3×87-1的260个F2:3当作相应的材料，在其1、2、8、9号染色体上共定位到8个与株高相关的QTL位点（Ph1-1,Ph1-2,Ph3,Ph5-1 等）。其中有三个位点在玉米的整个生长发育过程中都可以检测出来。分别为 Ph1-1，Ph5和Ph8。然而由于这几个位点分别测于植株不同的生长阶段，结果发现不同位点控制的玉米表型也有很大的不同，所以，不同QTL位点控制的玉米株高在不同阶段的表达量是截然不同的(严建兵等2003)。当前绝大部分植株株高与QTL密切相关，而且其相应的遗传效应相对较小。虽然相应的微效多基因控制着数量性状，但是，性状表现的功效有着一致的方向，并且可以通过累加进而呈现出加性效应。由于数量性状易于受到外界相关环境的扰动，从而产生某些不可遗传的彷徨变异成分，因此利用数量性状对玉米矮化植株进行选择，其相应的效率仍然相对较低(Peiffer J.A et al.2014)。

　1.1.2小麦矮化突变体的育种现状

19世纪，在日本地方品种达摩（Daruma）和赤小麦（Akakomugi）中发现了最早的小麦矮化基因，在1935年 ，“农林10号”在达摩矮源的杂交后代中培育成功。当前，生产当中运用相对较为广泛的就是源于农林10号（Nornl0）的Rht1（Rht-B1b）、Rht2（Rht-D1b）以及源于赤小麦（Akakomugi）当中的Rht8以及Rht9，全球绝大部分的矮化小麦品种均具备一定的矮源血统（Bǒrner et al.1993；Worland et al.1994；Ahmad and Sorrells et al.2002）。到了20世纪中期，矮化基因导入到小麦种植当中，全球范围内的产量均呈现出显著提升的趋势，逐步爆发出有史以来了第一次“绿色革命”，在解决世界温饱问题方面作出了较大贡献。紧接着，在70年代中期，英国逐步成功实现矮化基因导入到小麦种植当中，具体是Rht1（Rht-B1b）以及Rht2（Rht-D1b），进而确保其相应的产量仅历经10年便提升了将近55％；1980年左右，X所培育出的矮秆以及相应半矮秆品种数目高达95类，相应的种植面积已经覆盖0.08亿万公顷，单株产量大大提高；印度本身为小麦进口国，但是在引进矮秆基因 Rht1 和Rht2后，使其成为小麦出口国；在20世纪50年代，我国小麦矮化研究早就已开始，并于70年代初期，育种家就已培育出“矮丰3号”，并且成为有史以来第一个进行大面积推广的矮杆形式小麦植株，进一步确保国内相关小麦产量逐步显著增加，紧接着，我国又不断创新培育出一系列新型矮秆以及半矮秆类型的小麦。进一步促进了国内乃至全球范围内粮食产量的有效提升。

在小麦品种中，我国常用的矮秆基因有Rht1、Rht2以及Rht8（贾继增 等1992；康苏花 等 2009）。随着国内相关分子技术稳步前进与创新，有更多的矮化基因被发现和利用，针对矮化基因方面所展开的探究也逐步得到了相关部门与机构的高度重视。在1980年左右，相关学者基于矮秆基因对相关外源形式的赤霉素呈现出相对较为敏感的效果，将其归结为有效判定矮秆基因类型的依据（Galeet al. 1975），逐步加速了国内相关农业基因领域的深入研究。育种工作者把Rht1、Rht2逐步依次定位到4BS以及4DS染色体当中，由于Rht1以及Rht2在DELLA区单碱基的突变阻止了植株对赤霉素的响应，从而导致矮化（Penget al.1999；Pearce et al.2011）。与此同时，着手于其它类型小麦矮化基因而言，譬如Rht3、Rht8、Rht9以及全新的矮化基因Rht4、Rht5、Rht12等均获得了一定程度的进展。

全球范围内的相关育种人员还针对各式各样完成定义的矮秆基因展开了染色体定位。譬如，基于非整倍体材料以及相关细胞遗传学理论，逐步把矮秆基因Rht-B1b、Rht-D1b、Rht8以及Rht9依次定位在4B、4D、2B以及7D染色体当中。有效凭借双端体系统，针对矮秆基因Rht10以及着丝点之间的遗传间距展开了相对较为详尽的测定，相应的结果表明二者相距大约是32.21 个交换单位，进一步纠正了日前高于50个交换单位的设想(刘秉华 等1993)。利用缺-四体和双端体为试验材料，最后把Rht21有效定位于2AS染色体当中(杨天章 等 1993)。除此之外，有效凭借细胞遗传学相关学说，譬如春小麦圆柱形式的矮化基因，最终将其有效定位到2B、4B以及5D染色体当中（张京 等 1989)；其中原冬96矮秆形式的相关基因有效定位到2D以及6D染色体当中（孙荣锦 等 1993)；

目前为止，可进一步将小麦矮化基因具体归结为，Dn（草丛型矮杆基因）、Usn（独杆基因）以及 Rht（矮杆基因），虽然当前已知的小麦矮化基因多达26 个，但一般为Rht（矮杆基因），在一定程度上，导致遗传信息的局限性，阻碍了小麦育种任务的稳步持续前进 (Gegas V.Cet al.2010)。为确保小麦育种相关方面的任务逐步稳态前行，对于小麦矮化基因的开发并利用仍然是一项重要的工作。

　1.1.3水稻矮化突变体的育种现状

水稻矮化突变体以及相应的分蘖矮化突变体通常在分子水平，对水稻相关种植与生产具有重中之重的功效(McSteenPet al.2005)。其中株高可作为相对较为关键的性状之一，在一定程度上可决定植株自身的抗逆性(Gao Zet al.2009)。相应的水稻矮化突变体不单单具有一定的抗逆性，而且还能进一步促进产量的有效提升(Yang X C Hwa C.Met al.2008)。首次“绿色革命”当中，将水稻相应的半矮化植株命名为IR8，结合相关学者的文献探究，不难分析出矮化性状以及半矮化基因SD1之间存在紧密联系(Yamamuro C etal.2000)。其中SD1基因是编码植物激素中赤霉素合成途径的关键氧化合成酶 GA-20ox，催化GA53转化为GA20。sd1水稻突变体编码合成有缺陷的氧化酶 GA-20ox，影响了植物激素中赤霉素的生物合成，从而导致水稻株高的矮化早在1999年，Ashikari 等人就报道了关于水稻矮化基因的克隆 (Ashikari M et al.1999)。就是利用图位克隆的方法获得了第1个关于水稻矮化突变体基因 dwarf1（d1），截止目前已经报道90多个水稻矮化突变体，其中 d50、dwl1、tdd、ddu1、htd3、sad1、d14、afd1、dy（t）、sdt3、sds、bc88、sd-n、d162（t）、dtl1 是隐性突变体(Sato-Izawa K et al.2012, Rao Y C et al.2013, Li W et al.2015, Ren D Y et al.2016)，然而 KL908、Y98149、DS1、986083D、D1、DMF-1、Sdt97、D53、KA-902 是显性突变体(于永红 等 2005, Jiang L et al.2013, Zhou F et al.2013)。这一系列突变体的产生在一定程度上受限于赤霉素（GA3）以及相应的油菜素内酯（BR）。比如，水稻BR所呈现出的敏感突变体dlt，通常呈现出矮化特性(Tong H et al.2012, Tong H et al. 2010)。Iwata及其团队基于EMS进行有效诱导进而逐步获取NL8突变体，进一步定位到一个显性基因D-K-3。

虽然当前形势下水稻矮化突变体形式冗杂多样，但几乎都具有不良的性状，在具体实际的运用当中也没有得到相对较为广泛的关注。因此，要针对水稻矮化突变体方面展开深入探究，有效改善理想株型，逐步探究出相对较为新颖的矮化基因，始终是农业科学发展的重中之重。

1.2参与调控株高相关的植物激素

所谓的植物激素是具有活性相对较高并在植株内部占比相对较小的相关物质，在植株内参与一系列的发育过程，比如植株的生长、开花和结果等。结合相关文献进行切实有效分析可知生长素、赤霉素以及独脚金内酯等植物激素均会对植株茎秆的发育造成一定的影响，进而逐步影响株高。植物在正常生长发育情况下，如果缺失某种植物激素则会导致植株矮化性状的出现。除此之外，矮化突变体还进一步受限于个别转录因子所呈现出的功能缺失以及表达失真等情况(Griffiths J et al. 2006)。绝大多数水稻矮化基因与赤霉素、油菜素内酯的相关合成途径或信号传导途径密切相关（Yamamuro et al. 2000, Hedden et al. 2001）。绝大多数的拟南芥矮杆基因与相关生长素的合成存在相对较为密切的关系（Woodward and Bartel et al.2005）。植物激素独脚金内酯在一定程度上也能凭借细胞分裂进一步有效把控相关植物株高（Braun et al.2012）。

　1.2.1生长素

所谓生长素(Auxin)具体可归结为最早被探究出的一类植物激素，其存在的形式也呈现出多样化。其中吲哚乙酸-3-乙酸在植物中广泛存在。它能够促进维管束的形成与分化、茎节伸长以及细胞分裂，这些功能对植株生长发育起着关键作用。倘若生长素的有效合成以及相关信号传递途径中，有相关基因产生一定的突变，便会造成植株矮化(陈晶晶 等 2014)。生长素的合成部位为根、茎顶部以及鲜嫩叶片当中。有效凭借三种形式进行相应的运输（即横向、极性和非极性运输），通过运输方式进一步将其转运到各个需要它的部位。其中极性运输以单向、主动的方式运输。凭借该种形式运输的生长素在植物体内的占比相对不均匀，导致植株相应的表型造成一定的影响。一旦生长素运输受到一定的阻碍，便会造成矮化现象、多分蘖现象甚至无根等现象的产生（Maraschin et al.2009; Hayashi et al.2012）。

生长素的相关信号传递途径具体可归结为一系列调节蛋白以及相关受体蛋白 TIR1/AFB（Transport inhibitor resistant1/auxin signaling F-box）、SAURs（Small Auxin-Up RNAs）、生长素响应蛋白 Aux/IAAs（Auxin/Indoleacetic Acids）等构成。一旦相应的生长素占比相对较低，Aux/IAA蛋白以及相应的生长素在一定程度上便会与蛋白结合，致使ARFs不能与下游相关基因区域不能进行切实有效结合；直到其比例逐步上升至某一值，相应的生长素便能有效与相应的受体蛋白进一步结合，逐步形成相应的二聚体。该二聚体与泛素化酶结合形成复合体 SCFTIR1/AFB，生长素促使 SCFTIR1/AFB与 Aux/IAA 蛋白结合在一起，三者形成复合体，导致 Aux/IAA 蛋白被降解，消除了 Aux/IAA 对 ARFs 的抑制作用。ARFs 与下游目的基因结合，促进或者抑制其转录（图 1.1）。

相应的受体蛋白在 IAA 的信号转导中有着重要作用，受体蛋白产生突变的时候，致使其内部的蛋白结构产生一定的变化，有效抑制与IAA的结合，从而导致相关信号不能进行相应的跨膜转导，进而造成植株逐步趋向于矮化。比如在拟南芥作物中三突变体 tir1 afb2 afb3 和四突变体 tir1 afb1 afb2 afb3 出现根长变短、叶片变小呈卷曲状、下胚轴变短等表型（Overvoorde et al. 2005,Y et al.2005）。Aux/IAAs 在一定程度上也能对生长素信号传递起到一定的限制功效，并且其内部拥有4个相对较为保守的结构域（I、II、III 和 IV），相应的II 型结构区域具备保守程度相对较高的氨基酸序列（GWPPV）。在一定程度是与 Aux/IAAs 的稳定性密切相关。拟南芥中还存在许多因为GWPPV 序列发生突变最终导致矮化的突变体。譬如拟南芥突变体ax2-1，因为AXR2的相关基因序列产生一定的突变，致使Aux/IAAs不能进一步被泛素有效降解，进而致使植株呈现出矮化（Timpte et al. 1994）。

图 1.1 IAA 的信号转导途径（Guilfoyle 和 Hagen，2012）

Fig1.1 The signal transduction pathway of IAA（Guilfoyle and Hagen, 2012）

1.2.2赤霉素

所谓的赤霉素（GA）具体可归结为双萜类化合物的其中一种，经研究表明，在许多物种中已经发现约百种天然赤霉素（李合生等2012）。赤霉素在植株生长过程中起到决定性作用，但是当前形势下的具体作用机制还不够清晰。(Chen Met al. 2012, Nadeau C.D et al.2011,Singh D.Pet al.2002,White C.Net al. 2000)。

赤霉素本身可归结为一种植物激素，在一定程度上可有效把控各种器官的形成（Eriksson et al. 2006;王洪梅等 2011；左圆圆 等2011）譬如在一系列高等植物当中，相应的赤霉素能够对种子萌芽、茎秆延长、植株开花以及相应的侧枝生长具有重中之重的作用。(Winkler R.G et al.1995)。当前形势下在水稻以及小麦当中，绝大部分矮化突变体在一定程度上均与赤霉素存在一定的关系。相应的赤霉素对植株高度的影响具体可归结为两种，分别为赤霉素信号运输途径发生突变和合成途径编码某些霉的基因突变。经研究发现，前者外源施加赤霉素没有变化，后者外源施加赤霉素能够能其矮化突变体恢复表型。

在植物体当中，赤霉素占比受到严格调控，在一系列的生长时期具备重中之重的功效(Shani E et al. 2013, Ubeda-Tomás S et al.2008)。控制赤霉素在其生长组织中表达的基因机制与赤霉素合成酶有关(Ubeda-Tomás Set al.2009)。因此，赤霉素生物合成是控制植物生长发育的第一个阶段(Birnbaum, K et al. 2003, Hedden P et al.2003)。相应的赤霉素不仅能够在合成时期进行植株生长的限制，在相应的信号传递途中也呈现出关键性作用。除此之外，其也能与其他形式的激素进行结合，譬如BRs（油菜素内酯）以及JA（茉莉酸）等植物激素，共同参与植株生长发育。

基于赤霉素合成过程中相关催化反应进行的部位，进一步将其归结为：其一古巴焦磷酸合成酶（Ent-copalyl diphosphate synthase，CPS）和内根-贝壳杉烯合成酶（Ent-kaurene synthase，KS）在双牻牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate，GGDP）的催化下生成内根-贝壳杉烯（Entkaurene）；；其在质体中完成。其二逐步转化成GA12以及GA53。其具体在内质网中完成。其三是三种形式的双加氧酶（GA20氧化酶、GA3氧化酶和 GA2氧化酶）逐步针对GA12进行催化进而产生GAs（Hedden, 2001; Lange et al2005）（图 1.2）。在GA合成途径缺陷型突变体中，绝大多数矮化基因的产物均是一系列相关催化酶（Bömke et al. 2010）。譬如：在拟南芥作当中，相应的GA1的编译产物具体可归结为古巴焦磷酸合成酶（CPS），进行参与一阶段反应。一旦发生突变以后，相应的赤霉素合成便会受到一定的限制，进一步致使赤霉素占比下降，相应的植株呈现出矮化性状。（Winkler and Helentjaris et al. 1995; Helliwell et al.1999; Itoh et al. 2002）。

图 1.2 GA 的合成途径（Yamaguchi 等，2008）

Fig1.2 The synthesize pathway of GA（Yamaguchi et al.2008）

关于赤霉素信号传导途径对其突变体的影响，研究者凭借对拟南芥以及水稻等植株针对赤霉素非敏感突变体以及相关基因克隆展开了相对较为详尽的探究，不难分析出，其具体的传递途径是基于受体GID1蛋白、DELLA蛋白以及解除DELLA 蛋白抑制功效的相关调控因子构成。使有活性的GA与GID1蛋白进一步有效融合，进一步导致GID1蛋白内部的空间结构呈现出一系列变化，促成信号进行相应的跨膜转导。其次，便能够与相应的DELLA蛋白有效融合，再水解DELLA蛋白，使其不能与靶基因结合最终，前面提及的的转录因子与相应的目的基因有效结合，在一定程度上促使或抑制其转录（Davière et al. 2016）（图1.3）。

譬如：在水稻中进行编译GID1蛋白基因致使其进行一定的突变，进而限制信号有效传递，最后致使植株高度显著下降。之后对其外源喷施赤霉素发现，矮化突变体的植株高度没有明显变化(Ueguchitanaka et al.2005; Ueguchitanaka et al.2007）。在拟南芥当中也具备一定的与水稻GID1的同源的基因，具体可归结为AtGID1a、AtGID1b、AtGID1c，无论是功能层面还是结构上均具有一定的类似之处。经研究发现，三个基因参与并有效调节拟南芥的相关发育。虽然现阶段已经有效认知赤霉素完成信号传递主要依靠的转导元件，但其具体的作用机制仍需展开深入探讨。

图 1.3 拟南芥中 GA 的信号转导途径（Sun 等，2010）

Fig1.3 The signal transduction pathway of GA in Arabidopsis（Sunet al2010）

　1.2.2油菜素内酯

油菜素内酯最早发现于油菜花粉中，它能够促使植株进一步生长发育，特别是在茎部延伸当中相对较为显著。此后基于相应的分子结构进一步将其定义成油菜素内酯（brassinosteroid，BR）（Mitchell et al. 1970）。油菜素内酯在植物体内是含量极少的一类植物激素。一般与赤霉素相互作用共同调控细胞的分裂与伸长。而且它还可以提高植株的抗旱能力。（Li J et al. 1996）

经研究发现，油菜素内酯的合成或信号传导途径的调控因子一旦产生一定的突变，便会致使植株造成一定的矮化。譬如在拟南芥当中，凭借T-DNA插入进一步导致其相关合成受阻形成的突变体植株（dwf1、dwf4、dwf5、dwf7、cpd、det）呈现出株高变矮、育性下降、抗逆性降低等特征。以上突变体经过外源喷施油菜素内酯，突变体的相关表型能够进行一定的恢复（Feldmann et al. 1989; Szekeres et al. 1996; Choe et al. 1998; Choe et al.2010）。目前，在拟南芥中，已探究出的与油菜素内酯信号传递有关联的基因约20个左右。基于传递缺陷形成的相关突变体，其表型特征呈现出高度矮化的趋势、叶片颜色加深，育性较低或不育以及顶端优势减弱等特征。在拟南芥中首次被探究出的BR非敏感类型的突变体可归结为bri1，其特征可归结为下胚轴降低、高度矮化、以及雄性能力相对较为薄弱等。针对BRI1进行有效翻译所获取到的相关产物是BR的一类受体蛋白（Szekeres et al. 1996; Kinoshita et al.2005; Li and Jin. 2007）。

结合近些年的研究成果，针对BR信号传递所展开的相关探究日益增多途，首次针对水稻进行有效克隆的相关基因是OsBRI1，其无论在功效方面还是在结构组成方面均与拟南芥的BRI1存在一定的相似点（Li and Chory, 1997; Yamamuroet al.2000）。tud1-2在一定程度上也可归结为BR信号传递途径受阻所形成的突变体，相应的表型呈现出高度矮化，基于组织切片进一步探究，发现其内部的细胞数量降低效果极为显著，进而造成其植株呈现出高度矮化的趋势（Clouse et al.2002）。

1.2.2独脚金内酯

所谓独脚金内酯（strigolactones，SLs）具体可归结为萜类化合物，其内部的分子量相对较小，具体的结构形式是一个三环以及D环（Cook et al1966; Waldieet al.2014）（图1.7）。早在1972年Cook及其团队针对棉花根部展开探究的过程当中，有效获取到独脚金内脂，接下来在玉米以及红三叶等作物中也相继获取到该化合物。（Hauck et al.1992; Yokota et al1998; Yasuda et al.2003; Akiyama et al.2005）。相应的独脚内酯具体的存在形式呈现出多样化趋势，到目前为止，有效获取出的独脚金内酯天然类别高达30余类，此外，凭借人工干预合成也获取到各式各样的独脚金纯相关物质（Zwanenburget al.2009;Kisugi et al.2013）。其不仅能有效促进种子发芽，在一定程度上还能有效提升根部以及相应的枝叶的生长效率。Umehara et al.2008; V et al.2008; Hu et al. 2010; Kapulnik et al.2011）。

独脚金内酯作为相对较新颖的激素，它的合成以及传导途径成为了全球探究的热点话题之一。基于对其导致的相关突变体展开切实有效的分析，当前形势下已经在合成以及相关信息传递过程当中进行了有效鉴定（Matusova et al.2005; Hao et al.2009; Alder et al.2012; Nakamura et al.2014）。

独脚金内酯是类胡萝卜素经过多种酶的催化产生的。在具体反应的中，类胡萝卜素异构酶D27（β-carotenoid isomeras）、类胡萝卜素裂解双加氧酶8（carotenoid cleavage dioxygenase 8，CCD8）、类胡萝卜素裂解双加氧酶7（carotenoid cleavage dioxygenase 7，CCD7）以及细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase，P450）起重要作用。首先凭借相应的异构反应将β-类胡萝卜素转为顺式，在 CCD7 参与的裂解反应中把9-顺式-β-类胡萝卜素转变为胡萝卜醛，其次CCD8进一步把3个氧原子转移到9-顺式-β-apo-10′-胡萝卜醛内部，进而获取到类似的合成物carlactone，紧接着引入一定的P450等酶进行相应的催化carlactone逐步产出5-脱氧独脚金醇，最终转化成SLs（图 1.8）。

图 1.7 SL 的结构（Kisugi T 等，2013）

Fig1.7 Structure of SL（Kisugi T. et al. 2013）

图 1.8 SL 的合成途径（Adrian 等，2011）

Fig1.8 The synthesize pathway of SL（Adrian et al. 2011）

在水稻以及拟南芥等植物当中，现阶段已经有效克隆出各式各样的关键酶基因，相应的水稻突变体dwarf27呈现出矮化、多蘖等性状，凭借有效喷洒独脚金内酯G2R，相应的突变体逐步衍生出野生型。不难分析出，dwarf27的具体产物可归结为异构酶，其有效参与到独脚金内酯的合成，一旦其产生一定的突变便会造成异构酶活性显著降低，进而造成其植株株高进一步变矮。（Hao et al.2009）。Warters及其团队对此展开一系列探究，逐步发现dwarf27在拟南芥中存在一定的同源基因，具体可归结为AtD27，并对此进行了试验验证，进一步证明其突变体能够在一定程度上致使植株逐渐变矮（Waters et al.2012）。拟南芥内部的独脚金内酯相关合成路径受阻所形成的的相关突变体（max1、max3、max4）在一定程度上都呈现出分枝数显著提升以及植株进一步变矮等形式的性状。（Stirnberget al. 2002; Bookeret al.2005）。

1.3研究目的及意义

　1.3.1研究目的

本研究是以甲基磺酸乙酯（Ethyl methyl sulfonate，EMS）诱变后得到的一个矮化突变体cd1为试验材料，本论文通过对矮化突变体cd1的表型等一系列特征进行分析，并在此基础上，对生理指标鉴定、细胞学鉴定、外源喷施激素处理、花粉活力鉴定等进行分析，最后对cd1进行初步定位、候选基因的鉴定以及表达量分析。

　1.3.2研究意义

对白菜矮化基因的定位以及分析，将为理解白菜株高形成的分子机制与创制适宜株高的白菜新品种奠定一定的理论基础。

第二章 突变体cd1表型测定与细胞形态学分析

诱变育种在一定程度上属于可遗传变异，涉及到的具体方法可归结为物理诱变和化学诱变。凭借射线、离子束、超声、微波等使得植株产生一定的变异，均在物理诱变范畴之内；凭借化学诱变剂作用导致变异的可归结为化学诱变，其中烷化剂相对较为常用。

目前，在植物突变体创建中，应用最多的烷化剂是EMS。

本文所展开的研究是利用EMS诱导白菜发生其变异，进而获取到白菜矮化突变体cdl，并将相应的突变体cdl当作本文的具体研究对象，对其相应的农艺性状、叶绿素含量、细胞形态学观察、基因定位、候选基因预测以及相关表达量分析等进行分析与研究，其目的在于有效认知植物矮化相关特性，充分认知其基因定位，为接下来的探究做好充分准备。

2.1材料与方法

　2.1.1材料来源与田间管理

本试验利用EMS诱变白菜‘Rapid Cycling Brassica Rapa’，进而获取到白菜矮化突变体cd1（chinese cabbage dwarf mutant1）。再凭借诱变所获取的突变体cdl与白菜型油菜‘Yellow Sarson’进行杂交，并成功获得F1代。将杂交所获取的F1代进行自交，进一步获取到F2 分离群体，对其分离群体进行表型鉴定及后续基因定位。

本试验材料均种植于具有相同生长位置，相同生长条件下的沈阳农业大学日光温室中，此过程中定期进行浇灌、施肥、防治等一系列常规管理。相应的生长过程具体可归结为：将亲代与F2代分离群体播种于32孔穴盘中，待其生长20天左右，将其进一步移植于营养钵中，需要注意的是，操作过程中要有效避免植株体损伤；直到生长到45天的时候，再将其转移到直径25cm花盆当中培育。

　2.1.2农艺性状调查与测量

由于要尽量避免因环境因素造成的误差，所以本试验将其突变体及相关材料统一播种在同一生长环境和状态下的沈阳农业大学日光温室中。待其植株生长至45天左右，选取同一时期长势相同的突变体cd1与野生型植株各10株，凭借数显游标卡尺对各植株的相关农艺性状展开相对较为详尽的鉴定与测量。具体的测量指标以及方式如下：

株高：植株基部至主茎顶部之间的距离。

叶长：植株叶片的基部至叶片顶端的距离。

叶宽：从叶片最宽的地方横向测量。

根长：主根长和侧根长长短及数量的测量。

　2.1.3生理指标测定与分析

2.1.3.1光合作用参数的测定

在植株第四片真叶完全展开后，选择一个天气晴朗的上午，分别随机选取同一时期长势相同的突变体cd1和野生型各3株，以第四片真叶为测量对象，使用Li-6400便携式光合系统(Li-COR公司，X)对六株植株分别进行植株的净光合速率（Pn）、气孔导率（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（E）、等参数展开相应的测定，重复三次测试，记录并对相关数据展开详尽分析。

2.1.3.2叶绿素及类胡萝卜素含量的测定

当植株第三片真叶完全展开后，选取同一时期生长且长势相同的突变体cd1和野生型各6株，选取第三片真叶进行检测。首先，凭借打孔器在选定的植株叶片上有效选取大约10个直径为0.1cm的圆片，分别置于事先预备好的相关试管内。其次，配制混合液（丙酮：乙醇=1:1），分别向10支试管中加入10ml混合液，将其试管放置避光处24h。最后，当采集的相关样品叶片完全褪色后，对得到的浸提液展开相应的吸光度测定，并记录汇总相关数据。DU800型紫外分光光度计使用方法为：用丙酮:乙醇=1:1混合液调零，然后分别在波长为663nm、645nm和440nm处测定吸光值，重复测定三次。

计算公式如下:

Chla（mg g-1）=（12.72OD663-2.59OD645）V/1000W

Chlb（mg g-1）=（22.88OD645-4.67OD663）V/1000W

Chl（a+b）（mg g-1）=（8.05OD663+20.29OD645）V/1000W

Car（mg g-1）=（1000OD440-3.27 Chla-104 Chlb）V/（229x1000W）

公式中：OD为测定波长下的光密度值；

V为叶绿素提取液总体积（ml）；

W为材料鲜重（g）。

2.1.3.3花粉活力的测定

花粉活力与植株的育性有着密切的关系，由于醋酸洋红染色法与其他测定花粉活力的方法相比较，它具有快速、准确的优点。所以，本试验利用醋酸洋红染色法测定花粉活力，具体的操作步骤如下：

1%的醋酸洋红：量取100mL45%的醋酸于烧杯内部，加热至完全沸腾。称取1g左右的洋红，缓缓引入到醋酸当中，再进行加热回流20h后，用滤纸进行过滤。向滤液中加入2%的铁明矾3滴，混匀，然后备用。

取样：于植株盛花期，上午采集当天开放的花药。

染色与镜检：取适量花粉于载玻片上，滴2滴1%醋酸洋红，接下来盖上盖玻片，需要注意的是操作过程中避免产生气泡，最后，在显微镜下仔细观察，每个样品三次重复。

2.1.3.4激素处理

取抽薹期突变体cd1和野生型植株各15棵，将其移栽到装有营养土的小钵中，对准叶片和茎尖，喷洒一定浓度的赤霉素GA（500mg/L），对照组喷洒一定量的清水，间隔一天完成一次喷洒。

　2.1.4细胞形态学观察

2.1.4.1茎秆、叶片组织的切片观察：

1.取样：选取薹期突变体cd1以及凭借喷施GA下相应的突变体cd1的茎节，进一步将其分割成1.2cmx1.2cm左右的块状。选取6周左右发育的突变体cd1以及完成GA处理的相应突变体cd1植株相同位置的叶片，顺着叶脉将其进一步分割1.2cmx1.2cm左右的块状。

2.固定：把前面提及的相关材料快速投入含有青霉素的瓶体内并利用FAA进行有效固定，再用注射器将瓶体逐步抽成真空状态，直到样品完全沉底。

3.乙醇梯度脱水：将相应的样品分别依托于30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇进行充分浸泡2钟头左右，接下来取少量100%的乙醇进行全面清洗，最后将其放置到100%的乙醇中，相应的温度环境为4℃，将其搁置过夜，进行相应的脱色。

4.透明：取一定量的二甲苯以及无水乙醇基于1:1的比例充分混匀，再把相应的样品投入到其中搁置2h左右，接下来把相应的样品取出，再次投入到二甲苯内部搁置3h左右。

5.浸碎蜡：进一步把样品投入内置充足碎蜡的盒子内部，确保其被完全覆盖，与此同时，引入一定的二甲苯。将其置于42℃恒温形式的烤箱内，待其搁置2天左右。要注意的是，必须确保相应的碎蜡始终保持半凝固状态。

6.浸蜡：把相应的样品投入表面存在一定数量小孔的盒子内部，引入大约50%左右的蜡液，将其置于42℃恒温形式的烤箱内，待其搁置2h左右将其取出，然后再将其投入至大约75%左右的蜡液当中，将其置于42℃恒温形式的烤箱内维持2h左右。最后将相应的盒子投入到纯度相对较高的蜡液内部，再将其置于42℃恒温形式的烤箱内维持3h左右。

7.石蜡包埋：把取出的相关样品投入到事先预备好的塑料模具内，引入60℃温浴处理过的纯度相对较高的蜡液，其次快速将其置于冰盒内确保相应的蜡液瞬时凝固。将其置于-20℃的环境当中，搁置大约2小时左右。

8.制作切片：利用刀片将其逐步分割成规则的梯形，并将其置于木块上，然后再把相应的木块放置到石蜡切片机上，不断调节木块以及切片机之间的角度直到相对较佳的位置处，再取厚度大约是10um的相关切片，进一步将其置于载玻片上，将其置于42℃恒温形式的烤箱内维持56h左右。

9.番红固绿染色：把相应的切片投入到装有番红染液的烧杯内进行2h的染色，其次充分清洗掉残余染料。再逐步将相应的切片投入到固绿染液内进行大约30-60s的染色，然后利用无水乙醇进行相应的脱水。

10.封片：往玻片表层引入一定的封片剂（中性树胶以及二甲苯基于1:1的形式完成充分混合），然后盖上盖玻片，需要注意的是，尽量避免相关气泡产出，最终将其置于37℃恒温形式的烤箱充分烘干。

11.显微镜观察：凭借显微镜针对石蜡切片展开相对较为详细的观察，并进行拍照记录。

　　2.1.5数据统计与分析

使用SPSS .18进行数据分析

2.2结果与分析

　2.2.1白菜矮化突变体cd1的表型及农艺性状的鉴定

矮化突变体是研究白菜株高调控基因的重要资源。为了研究白菜株高的调控机制，我们前期在EMS诱变过程中得到矮化突变株，该植株极度矮化，我们将突变株命名为cd1（chinese cabbage dwarf mutant1）。本试验主要对cd1进行表型描述和农艺性状鉴定。在植株整个生长期，突变体cd1出现明显的矮化性状。与野生型相比较，cd1生长缓慢、下胚轴极短，叶片颜色加深、有刺毛且伴有叶裂性状、叶面积变窄、叶脉突出（图2-1）。深入探究后不难分析出，cd1根的伸长效果受到相对较为显著的阻碍，相应的侧根数量明显降低，总根数也显著降低（图2-2、A和B）。

 

Fig.2-1 Wild type in the left and the mutant cd1in the right

在整个植株生长过程中，对突变体cd1和野生型植株的株高、叶长、叶宽等农艺性状进行表型鉴定，为了进一步了解突变体cd1的生长曲线，在植株第一片真叶展开、第三片真叶展开、抽薹期、抽薹五天、抽薹十天时对突变体cd1与野生型的植株高度进行了测定，结果表明，野生型株高在各个测量阶段都高于突变体的植株高度，然后，分别从植株第三片真叶起每隔5天测量一次突变体cd1和野生型植株的叶长和叶宽，结果表明，突变体cd1植株的叶长和叶宽都小于野生型植株的叶长和叶宽（如图2-3）。

图2-3 野生型（WT）与突变体（cd1）的生长曲线

Fig.2-3The growth curve of the Wild type and the mutantcd1

图2-3 野生型（WT）与突变体（cd1）的生长曲线

Fig.2-3The growth curve of the Wild type and the mutant cd1

图2-3 野生型（WT）与突变体（cd1）的生长曲线

Fig.2-3The growth curve of the Wild type and the mutant cd1

随后用SPSS.18分析软件进行统计分析，结果表明，突变体cd1株高均值在3.43cm，野生型株高均值为8.53cm，两者均值相差5.10cm，呈极显著差异（P＜0.01)。突变体cd1叶长均值在7.03cm，野生型叶长均值在8.17cm，两者相差1.14cm，呈极显著差异（P＜0.01)。突变体cd1叶宽均值为3.30cm，野生型叶宽均值为5.53cm，两者相差2.2.cm，呈极显著差异（P＜0.01)。这表明，突变体cd1植株矮小，叶片较短，叶宽较窄。（表2-1）

表2-1 突变体cd1表型测量

Table2-1 Measurements of phenotype of WTand cd1

	Plant height		Blade length of leaf	Blade width of leaf
Wild Type	8.53±0.31		8.17±0.06		5.53±0.21
Cd1	3.43±0.12**		7.03±0.15**		3.30±0.10**

注：*表示在0.05水平上呈显著差异；**表示在0.01水平上呈极显著差异

Note：*indicate that it is a significant difference at 0.05 level；** indicate that it is an extremely significant difference at 0.01 level

2.2.2生理指标分析

2.2.2.1光合速率、胞间CO2浓度、蒸腾速率、气孔导率分析

叶片在一定程度上可归结为光合作用集中的区域，对植物的生长能够起到相对较为显著的作用。植株的光合效率受到叶片形态以及叶绿素占比的影响，植株的蒸腾速率在一定程度上也会受到叶片气孔开度大小的影响，故对植株叶片的光合速率、胞间CO2浓度、蒸腾速率、气孔导率进行测定分析是很有必要的。本试验利用光合仪对光合作用的相关参数进行有效测定，并展开一系列分析。

基于相应结果，不难分析出突变体cd1的光合速率以及气孔导度要显著高于野生型。野生型胞间CO2浓度相对较高，表明野生型植株对CO2的利用率相对较为薄弱，因而相应的光合效率也相对较为低下。然而，突变体cd1蒸腾速率显著低于野生型，表明突变体具备相对较为突出的抗逆性。因此，突变体cd1叶片颜色较深使得植物光合作用增强，有利于光合作用。突变体cd1叶面积较小，使得蒸腾速率降低，蒸腾失水较慢，从而使得植物对环境的适应能力增强（表2-2）。

表2-2光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度、气孔导率分析

Table2-2 Photosynthetic Rate，Transpiration Rate， Internal CO2 Concentration CO2Stomatal

Conductance of WTand cd1

	Photosynthetic Rate μmol m-2s-1	Transpiration Rate mmol m-2s-1	Internal CO2 Concentration μmol mol-1	CO2Stomatal Conductance mmol m-2s-1
Wild Type	20.44±1.49	6.17±0.30	404±4.05	6.17±16.15
Cd1	25.91 ±0.74*	5.04±0.28*	390±3.31*	7.69±25.00*

注：*表示在0.05水平上呈显著差异；**表示在0.01水平上呈极显著差异

Note：*indicate that it is a significant difference at 0.05 level；** indicate that it is an extremely significant difference at 0.01 level

2.2.2.2光和色素含量分析

突变体cd1与野生型植株相比较，植株叶片颜色较深，在长出第一片真叶时就尤为明显，通过分析叶绿素以及类胡萝卜素含量可知，突变体植株内部的叶绿素a、b以及相应的整体叶绿素占比在一定程度上都显著高于相应的野生类型的植株，但其内部的类胡萝卜素占比会明显小于野生型。因此分析，这也是突变体比野生型植株光合速率高的一个主要因素(表2-3)。具体数据如下:

表2-3叶绿素和类胡萝卜素含量测量

Table2-3 Measurements of chlorophyll and carotenoid content

	Chla (mg g-1 FW)	Chlb (mg g-1 FW)	Chl (mg g-1 FW)	Car (mg g-1 FW)
Wild Type	1.61±0.01	0.47±0.03	2.08±0.04	0.52±0.03
Cd1	1.67±0. 01*	0.55±0.03*	2.20±0.02*	0.46±0.02*

注：*表示在0.05水平上呈显著差异；**表示在0.01水平上呈极显著差异

Note：*indicate that it is a significant difference at 0.05 level；** indicate that it is an extremely significant difference at 0.01 level

2.2.2.3花粉活力的测定

当突变体cd1抽薹开花时，我们发现cd1花瓣的雄蕊中花粉量明显较少。对其自交授粉结果败育，由于花粉活力与植株的育性有着密切的关系，所以通过醋酸洋红染色法对其花粉活力进行鉴定，结果表明如图所示（2-4、A和B），野生型植株花粉数量多呈圆形且形状规则。突变体植株几乎没有花粉粒，并且非常小，形状不规则。说明花粉无活力。

图2-4野生型WT（A）与突变体cd1（B）

Fig.2-4 Wild type in the left and the mutant cd1in the right

2.2.2.4矮化突变体cd1的激素处理

前人已经研究表明，激素合成或信号转导途径受阻都会引起植物株高变矮。由激素合成缺陷导致的矮化突变体可以通过外源喷施激素来部分恢复表型，而由信号转导途径缺陷的矮化突变体则对外源喷施激素表现不敏感。为了进一步了解突变体cd1矮化性状是否与激素合成或信号传导途径受阻有关，我们用赤霉素对矮化突变体cd1进行了外源喷施，同时将喷洒清水作为对照组。结果表明，外源施加赤霉素的矮化突变体cd1在株高上出现恢复现象，其他性状比如叶片，在叶长、叶宽已经叶片起伏程度上都无明显变化（图2-5）。所以，矮化突变体cd1对于赤霉素外源激素处理具有一定的敏感性，并推测突变体cd1株高变矮的原因是因为激素合成缺陷导致的。

图2-5不同时期喷施赤霉素效果图

Fig.2-5Effect of spraying gibberellin in different period

2.2.3白菜矮化突变体cd1的茎秆组织细胞形态学

2.2.3.1茎的石蜡切片观察

茎秆变短导致cd1植株矮化，然而造成茎秆变短的原因可能是因为细胞数目减少或茎秆组织纵向长度变短。为了了解突变体cd1茎秆变短的原因，为了了解突变体cd1茎秆变短的原因，本试验对cd1的茎秆组织进行了石蜡切片的观察。野生型茎秆组织横切面从外到内分别由表皮、皮层、初生韧皮部、初生木质部和髓组成（图A）。切片结果显示，与野生型相比，突变体cd1的中柱细胞面积变大，但细胞数目减少；韧皮部和木质部边界区分不明显；初生韧皮部于初生木质部的细胞排列不规则（图C）。茎秆组织的纵切面结果显示，野生型的薄壁细胞和中柱细胞排列整齐，细胞形态较为一致，薄壁细胞呈现为规则的方形。（图B），然而，cd1薄壁细胞面积变大，但数目减少，细胞形态不一，中柱细胞排列也不规则（图D）。因此，我们认为矮化突变体cd1的茎秆组织的薄壁细胞和中柱细胞未能在纵向上正常伸长，细胞数目减少可能是导致茎秆变短的原因。

图 2-6 野生型（WT）和 突变体（cd1） 茎杆的石蜡切片

Fig2-6 Paraffin sections of stem in WTand cd1

注：A:WT 茎杆横切；B:WT茎杆纵切；C：cd1 茎杆横切；D：cd1 茎杆纵切

Note: A: Stem crosscutting of WT; B: Sterm slitting of WT; C: Stem crosscutting of cd1;D: Stem slitting of cd1

2.2.3.2叶的石蜡切片观察

与野生型相比，矮化突变体cd1植株除了株高变短外，从苗期到成熟期最为明显的区别还体现在叶片上，表现为叶长、叶宽均短于野生型，叶脉明显加深并伴有叶裂出现。为有效认知造成这类变化的原由，本研究凭借石蜡切片相关技术针对其叶片细胞形态展开相对较为详尽的分析。切片结果显示，cd1的中脉直径和维管束直径与野生型相比略微变大，但是细胞数目明显减少，且排列不规则（图2-7）。因此，我们推测叶片表型的不同是由于细胞数目减少和细胞不规则排列造成的。

图2-7 突变体cd1（B和D）与野生型WT(A和C)叶片纵切图

Fig.2-7The longitudinal section ofcd1and wild type

2.3小结

经EMS诱变白菜‘Rapid Cycling Brassica Rapa︐，得到相应矮化形式的突变体cd1（chinese cabbage dwarf mutant1）。与野生型相对比，植株生长缓慢、下胚轴极短、叶面积变小；叶片颜色加深、有刺毛；根的长度也明显受到抑制，主根变短，侧根数目也明显减少；与野生植株展开详尽对比，发现突变体cd1植株的叶长、叶宽以及株高等明显低于野生植株。基于叶绿素相关结果分析，与野生植株展开对比，相应的突变体cd1叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素占比相对较高。因此，突变体cd1的相应的合速率、胞间CO2浓度、气孔导度也高于野生型，可以说明，颜色加深有助于光合作用，由于蒸腾速率低于野生型，说明突变体cd1对外界环境的适应能力较强。但是，我们通过花粉活力测定，我们发现，突变体cd1的花粉活力极低，。

经过对突变体cd1茎秆和叶片进行石蜡切片细胞学观察发现，突变体叶片的中脉直径和维管束直径与野生型相比略微变大，但是细胞数目明显减少，且排列不规则。因此，我们推测叶片表型的不同是由于细胞数目减少和细胞不规则排列造成的。突变体cd1茎秆的中柱细胞面积变大，但细胞数目减少；不易于进行有效区分韧皮部以及木质部的边界；初生韧皮部以及相应的初生木质部当中细胞排列极为不规则。茎秆组织的纵切面结果显示，野生型的薄壁细胞以及中柱细胞形态相对较为类似，排列效果较为整齐，其薄壁细胞大多数均呈现出较为规则的方形。然而，cd1薄壁细胞面积逐步增大，但相应的个数逐步降低，并且细胞形态有所差别，相应的中柱细胞的排布也极为不规则。综合分析，认为致使茎秆变短的主要原因可归结为cd1的茎秆组织内部的薄壁细胞以及中柱细胞没能在纵向有效延伸，致使相应的细胞个数逐步降低。

造成植株由高变矮主要可归结为两种方式：激素合成缺陷以及信号传递通道受阻。最后，我们通过对矮化突变体cd1进行了外源喷施赤霉素发现恢复其株高，因此分析认为，突变体cd1矮化现象可能是由激素合成受阻造成的。

第三章 白菜矮化突变体cd1的初步定位

混池转录组测序（BSR-Seq）具体可归结为凭借两种极端形式的表型群体进行混池，并完成相应的全转录组测序，凭借针对两个极端性状相关群体在转录本层次所引起的相关序列变异，即SNV，进而有效定位极端表型相应的位点，进而完成相关染色体的有效定位，为相应的基因确定提供了切实有效的操作方式。

本试验利用矮化突变体cd1和野生型两种极端表型建立了两个RNA混池，从而进行转录组测序分析。然后完成了相关目标基因所在染色体区域以及各种形式的相关SNV位点。最后与BSR-Seq进行有效结合展开转录组分析，对矮化突变体cd1基因进行初步定位。

3.1材料与方法

　3.1.1试验材料

本研究以矮化突变体cd1（chinese cabbage dwarf mutant1）以及白菜型油菜‘Yellow Sarson’为相应的材料展开一系列探讨。相应的白菜矮化突变体cd1是由白菜‘Rapid Cycling Brassica Rapa’经EMS 进行相应诱导所得，利用诱变所获取的突变体cdl与白菜型油菜‘Yellow Sarson’进行杂交，并成功获得F1代。将杂交所获取的F1代进行自交，进一步获取到F2 分离群体，相应的突变体cd1呈现出相对较为显著的矮化。利用F2代分离群体内部相关显性形式的纯合植株展开初步定位。本试验所涉及到的相关材料均来源于沈农大温室大棚当中。

3.1.2试验方法

3.1.2.1BSR-Seq转录组分析流程

基于F2代形式的分离体，分别摘取正常叶片以及相应矮化叶片植株各40棵，针对某一相同位置进行有效提取其内部的RNA,并完成相应的两极端混池搭建（也就是突变型混池，CD；野生类型混池，WT），利用金唯智企业展开BSR-Seq相关转录组分析与评估。

实验具体操作流程：1、有效提取相应的RNA并展开质量检测；

2、建立文库；

3、文库纯化；

4、展开文库检测以及定量；

5、cBOT自动成簇；

6、Illumina HiSeq测序。

相关生物信息具体分析过程可归结为:首先有效获取相关初始数据，其次展开相应的生物信息分析。（图3-1）

图3-1生物信息分析流程图

Fig.3-1Biological information analysis

3.1.2.2 叶片的DNA提取

1、研磨叶片：在山中采摘相对较为新鲜的植株叶片，并将其投入到2.0ml的离心管内部，其次往离心管内部引入相应的液氮，利用研磨棒快速将其捻至粉状形式。

2、将改良后实验结果稳定的CTAB缓冲液提前放入65℃水浴锅中加热，待温度达到65℃之后，往相应的离心管内部倒入大约700ulCTAB缓冲液。往复充分颠倒3min，其具体的目的在于确保叶片与缓冲液彻底融合。

3、进一步将完成有效融合的相关样品提取缓冲液搁置到65℃恒温烘箱内持续1h。

4、打开相应的离心管，引入一定量的氯仿异戊醇（其比例大约24:1）混合液700ul，充分震荡5分钟。然后放入12000r/min高速冷冻离心机里进行离心10分钟。

5、取出2.0ml离心管后，有效抽取大约450ul的上清液，其次将其投入到灭菌处理的1.5ml离心管内部。再向其离心管投入大约900ul并且经过-30℃预冷处理过的无水乙醇。最后将其搁置在-80℃恒温环境下的冰柜里，维持8分钟左右将其取出。

6、将1.5ml离心管放入12000r/min高速冷冻离心机里，离心10分钟。

7、弃上清液，然后用75%无水乙醇洗涤DNA沉淀两次，每次用3000r/min高速冷冻离心机离心2分钟。

8、晾干后，加入超纯水100ul，用3000r/min高速冷冻离心机离心一分钟，放置4℃左右的恒温环境冰柜内大约4小时确保其充分溶解，最后将其搁置在-30℃恒温环境冰柜内部储存备用。

9、使用前用多功能酶标仪进行DNA浓度检测。

提取DNA所需要的溶液配置如下：

（1）2×CTAB溶液：

Tris-Hcl （PH8.0,1M） 10ml

EDTA （0.5M） 4ml

NaCl 8.1816g

CTAB 2g

β-巯基乙醇（40mM） 300ul

最后加水，用磁力搅拌器搅拌均匀，定容至100ml。

（2）氯仿异戊醇混合溶液：氯仿和异戊醇按照24:1的比例混合。

3.1.2.3PCR扩增

PCR产物扩增采用10ul体系，具体药品如下：

DNA模板 5ul

dNTP 0.8ul

ddH2O 2.8ul

DNABuffer 1.0ul

上游引物 0.1ul

下游引物 0.1ul

TaqDNA聚合酶 0.2ul

PCR反应程序：

1.95℃恒温环境预变性持续5min；

2.95℃恒温环境变性持续30s，进行引物退火温度持续30s，72℃延伸操作持续1min，重复进行35次；

3.72℃环境延伸操作持续5min。

扩增后的相关PCR产物搁置到4℃环境冰柜内部存储备用。

3.1.2.4PCR产物检测

关于聚丙烯酰胺凝胶板的相关制备

把成对的的玻璃平板和玻璃凹板用自来水清洗干净并擦干，放置于实验台上，用无水乙醇完成两次重复喷洒，然后拿纸巾将其彻底擦干。利用移液枪抽取大约2ml左右完成相应配置的50%剥离硅烷并将其喷洒在凹版上，再用纸巾将其抹匀。然后抽取2ml左右完成相应配置的5%亲和硅烷并将其喷洒平板上，再用纸巾将其抹匀。晾干备用。选取两个边条依次洗净并将其进一步擦干，置于平板两侧，确保其上下端稳定对齐。其次，把喷洒过剥离硅烷一侧的的凹版进一步与相应的平板合实，最后用夹子完成对称夹紧操作。将APS、TEMED以及凝胶液基于如下比例投入至鸭嘴瓶内，展开灌胶。在进行灌胶时，必须对相应的玻璃板进行一定的敲击，确保相应的凝胶能够均匀灌入。一旦生产相应的气泡，务必有效将其赶出。当凝胶液铺满整个玻璃板时，一定要避免气泡产生，进一步把梳子平面慢慢插入。聚丙烯酰胺凝胶板制好后，静置2-3h后即可使用。溶液配制如下：

（1）40%丙烯酰胺（19:1）：

丙烯酰胺 38g

N,N亚甲双丙烯酰胺 2g

加水，并用磁力搅拌器搅拌均匀，定容至100ml，然后用滤纸过滤

（2）10×TBE：

Tris碱 108g

硼酸 55g

EDTA（PH8.0,0.5M） 40ml

加水进行溶解，搅拌均匀，定容至1L。

（3）8%丙烯酰胺凝胶：

40%丙烯酰胺（19:1） 8ml

10×TBE 4ml

10%AP 320ml

TEMED 40ul

加入上述试剂，搅拌均匀，使其充分溶解，最后加水定容至40ml

丙烯酰胺凝胶电泳:

将胶板上的夹子依次取下，轻轻拔出梳子，将灌胶口用清水冲洗干净。检查电泳仪设备是否正常，正常后将玻璃板固定在电泳槽上，然后向其电泳槽加入1×TBE溶液（10×TBE稀释），液面没过灌胶口。拔出上样梳（用力要均匀，防止胶孔变形），最后将胶孔内的气泡消除。配置电泳程序U=1800，I=120，P=70（一块板），进行大约25min的预热。在预热期的时候，往相应的产物当中投入大约2.5ul左右的溴酚蓝，进行大约5min维持95℃恒温变性，随后将相应的PCR产物快速投入至冰盒内。待胶板预热结束后，向其胶孔中加入5ulPCR产物，设定程序在恒定功率条件执行大约80min。银染：

固定.完成相应电泳操作后，把玻璃平板以及玻璃凹版分离，注意要小心操作，以免胶损坏。然后将平板胶面朝上放入固定液中（900ml蒸馏水+10ml+100ml无水乙醇），将其放在摇床上慢摇10min左右。银染.将胶板从固定液内部取出，投入至染色液中，将其置于摇床上维持大约10min的轻微摇摆。漂洗.把胶板拿出，充分洗净，一次大约30s左右。染色.漂洗两次后，再将胶板投入氢氧化钠溶液当中进行相应的显色反应。再将其置于摇床上维持大约10min的轻微摇摆。将胶板放在LED灯箱上进行读带观察。记录数据，扫描电子图像进行保存。基因型数据记录：

在读带过程中，如果F2群体中某个单株的条带与野生型一致，则记为1，如果单株的条带与突变体cd1一致，则记为2，杂合带记为3，空带记为0.

3.1.2.5分子标记的开发与筛选

分子标记(SSR)的开发:凭借Editseq软件探究到相应的目标区域，其次启动SSR Hunter展开相应的SSR序列搜索，进一步将相应的核苷酸个数配置成4，相应的重复次数配置成10。将相应的结果拷贝出来。接下来凭借Primer5展开相应的引物设计，将相应的产物大小配置成大约180bp，有效凭借引物碱基数的调节确保温差在1℃以内。最后将相应的结果序列导出至Excel，上传到金唯智企业邮箱。

分子标记的筛选：把远缘亲本‘Yellow Sarson’带型用‘B’来表示,相应的突变体cd1带型用‘A’来表示，相应的杂合型条带凭借‘H’来表示，相应的缺失或其他类型凭借‘-’来表示。本试验基于现有的SSR引物和Indel引物对其‘Yellow Sarson’与cd1两亲本进行多态性引物的筛选。随后利用有多态性的引物针对F2代的群体内隐性纯合植株展开相应的PCR扩增，其次筛选出与‘突变体cd1’带型保持相对一致的位点展开标记。

3.2qRT-PCR 分析

　3.2.1试验材料

取直播后46d白菜矮化突变体cd1以及野生型的根、茎、叶，各取三份并用锡箔纸包好，放入液氮中速冻，然后放入-80℃恒温冰箱待用。

　3.2.2试验方法

3.2.2.1 总RNA的提取

植物总RNA提取使用RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒（艾德莱），具体的操作步骤及方法见说明书。分别提矮化突变体cd1以及野生型相同部位（根、茎、叶）的总RNA。提取 RNA 前期将研钵、研磨棒及药匙等用锡箔纸包好在烘箱180℃，6h灭菌，使用前需用液氮预冷处理，提前备好冰乙醇和冰氯仿需提前放在4℃预冷处理。

吸取3μL所得RNA 进行凝胶电泳检测纯度并进行浓度测定，以确保提取的 RNA可用后-80℃保存以供后续实验使用。

3.2.2.2反转录cDNA的获取

将提取到的RNA使用反转录试剂盒（TIANGEN）进行反转录，将3.2.2.1部分所得RNA以及试剂盒中的试剂置于冰上解冻（最好在RNA提取完成后立即进行反转录，避免RNA反复冻融导致降解），试剂使用前都需要混匀。先按照表3-1配制反转录Mix。取3μL RNA按下表3-2方法配制基因组DNA去除体系混合液，混匀，离心后置于42℃水浴锅孵育3min，随后将预先配好的Mix，加到混合液中，充分混匀后在42℃水浴锅孵育15min，转入95℃水浴锅孵育3min后放置于冰上，即得到cDNA，将所得cDNA测定浓度及纯度后-20℃保存，供后续实验使用（以上操作均在冰上处理）。

表3-1 反转录体系

Tabel 3-1 reverse transcription system

试剂	使用量（μL）
10×King RT Buffer	2
FsatKing RT Enzyme Mix	1
FQ-RT Primer Mix	2
RNase-Free ddH2O	5

表3-2 基因组DNA去除体系（10μL）

Tabel 3-2 gDNA dislodge system (10μL)

组成成分	使用体积（μL）
5×gDNA Buffer	2
Total RNA	3
RNase-Free ddH2O	5

3.2.2.3荧光定量qRT-PCR

以反转录获得的cDNA为模板使用荧光定量试剂盒UltraSYBR Mixture（Low ROX）（康为世纪）进行荧光定量。根据候选基因序列设计特异性引物，引物详情见表3-4。将cDNA稀释10倍后，按照表3-3的体系加样，为确保准确性设置三次重复，为避免误差可先配置混样，注意将溶液吸打混匀，将配好的混样分装至八连管后，压实盖子短暂离心弹出气泡，放入荧光定量仪器中。按照表设置程序。

表3-3 qRT-PCR反应体系

Table 3-3 The reaction system of qRT-PCR（20μL)

试剂	体积（20μL）
2.5x UltraSYBR Mixture（Low ROX）	10
Forward Primer	0.4
Reverse Primer	0.4
cDNA	0.8
ddH2O	8.4

表3-4 qRT-PCR引物

Table 3-4 The primers using for qRT-PCR

基因	引物序列（5’-3’）
BraA06g032180.3c BraA06g033010.3c BraA06g034110.3c BraA06g031210.3c	F：5′ GGAGTCTTGGCTGGGAGAGGTA 3′ R：5′ AAACGGAGCTGAATTTGGTGAA 3′ F：5′ CTTTCCTCTTCATCTTCGTGTT 3′ R：5′ AGTCTTGTGTGGTTTCTTCTCT 3′ F：5′ GGTGGGACGGAGAGAACTGAAT 3′ R：5′ AAGGGCTACACGCTGGATGCT 3′ F：5′ AGGATGGGGAGGAGGTTGTGTA 3′ R：5′ GATGGCTTTGGGTTTGATTGGT 3′

表3-5qRT-PCR反应程序

Table 3-5 The response procedures of qRT-PCR

步骤	温度（℃）	时间
预变性	95	10 min
变性	95	15s
退火/延伸	60	1min
溶解曲线分析
	95	15s
	60	1min
	95	15s
	60	15s

3.3结果与分析

　3.3.1BSR-Seq转录组测序分析

3.3.1.1与参考基因比对

将完成过滤操作的Clean Data凭借Hisat(v2.0.14)进一步与大白菜3.0数据库展开一系列对比分析，不难分析出，野生类型混池（WT）以及突变型混池（CD）分别有40438860和37436910个reads呈现至相应的参考基因组上，其占比大约是76.80%以及77.53%，其中唯一比对数目占总reads的69.63%和69.29%（表3-1）

表3-1与参考基因比对分析

Table 3-1Comparative analysis with reference genomes

Samples	Total reads	Total mapped	Multiple mapped	Uniquely mapped
WT	52654592	40438860 (76.80%)	3775680 (7.17%)	36663180 (69.63%)
cd1	48289914	37436910 (77.53%)	3974891 (8.23%)	33462019 (69.29%)

3.3.1.2SNV及Indel分析

基于野生型池（WT）以及相应的突变型池（cd1）与相应的参考基因组所得出的相关对比结果，凭借samtools软件展开相应的mpileup操作，进而有效获取相应的SNV结果。紧接着凭借annovar展开相对较为详尽的注释。在野生型池（WT）和突变型池（cd1）中，分别检测到了216068和227846个SNP/InDel。主要呈现在外显子区域，依然存在个别位点呈现在基因间区域、内含子、基因上下游以及剪切位点（图3-1）。

 

图3-1SNV/InDel在基因组上的分布（WT：左；cd1：右）

Fig.3-1Distribution of SNV/InDel in Genome（WT:left;cd1:right）

3.3.1.3基因差异表达分析

因为相应的基因丰度越大，进一步表明基因所具备的表达效果越佳。本文所涉及的基因表达有效凭借Htseq进行相应的求解。通常来讲，凭借RPKM 把相应的预置配置成0.1 或1展开基因是否表达的判别。当RPKM高于0.1时，在WT与cd1中分别表达了26979和27610个基因，其中RPKM在3-15范围内表达的基因最多（表3-2）。

表3-2不同RPKM区间的基因数目

Table3-2 The number of genes in different RPKM Intervals

Sample	0-0.1	0.1-1	1-3	3-15	15-60	＞60
cd1	1120(4.23%)	5435(18.85%)	4129(14.32%)	9285(32.21%)	6205(21.52%)	2556(8.87%)
WT	1126(4.01%)	5476(19.48%)	4480(15.94%)	9198(32.73%)	5500(19.57%)	2325(8.27%)

凭借edgeR软件针对基因存在的差异展开切实有效分析，利用野生型混池进行对比分析，可知有效获取的差异表达数目高达500，其中相应的上调大约是62个，其余438个为下调，如图所示（3-2）。

图3-2WT与cd1中的差异表达基因

Fig. 3-2 The differentially expressed genes in WT andcd1

3.3.1.4 BSR相关性状定位

本试验利用两个极端表型中存在一定差异的SNV位点进一步求解欧式距离，其次根据差异SNV位点的ED5值。有效筛选出前百分之一的SNV位点，并基于差异SNV位点ED5值记忆布归结出其在染色体上的具体分布状况，最终完成相应的染色体定位（图3-3）。

图3-3ED5染色体分布图

Fig.3-3 The distribution of ED5 on chromosomes

凭借有效筛选出前百个分之一的ED5值所相应的差异SNV位点，基于SNV位点具体分布形式将矮化突变体cd1基因定位在A04和A06两条染色体上，物理距离分别为1.53Mb和5.53Mb范围内。这些试验结果在一定程度上能够对未来精准定位提供一定的指导功效（表3-3）。

表3-3植株矮化性状染色体区域定位

Table3-5 The localization of chromosomal loci related to the cd1gene

Chr	Start	End	Count	Length
A04	17334001	18939299	11	1605298
A06	19356018	25157303	121	5801285

注：Count,性状相关区间内top 1%差异SNV位点数目

Note：Count,Number of top 1% difference SNV sites in the trait-related interval

　3.3.2矮化突变体cd1初步定位

本试验利用BSR-Seq转录组测序，将矮化突变体植株cd1基因定位在A04连锁群（物理位置17334001-18939299）与A06连锁群（物理位置19356018-25157303）相应的区间内 。

为了进一步缩小候选区间，在预测的A04号染色体候选区间内均匀设计了30对SSR引物标记，并对其亲本‘Yellow Sarson’与矮化突变体cd1进行相应的PCR扩增，进一步将相应的多态性引物有效筛选出来。最终发现有6对多态性引物并且条带清晰。基于BSA法，在F2分离群体内展开随机抽取矮化突变体和野生型植株各10株，对其叶片进行DNA提取，然后吸取相同量的DNA进行相应的混合进一步构成近等基因池。利用上述6对引物，在此基础上进行PCR操作，即展开二次筛选。接下来在F2代分离群体内部随机抽取80个单株进行PCR扩增，最后没有找到相应与目的基因的连锁引物。为了进一步精确定位结果，又利用本课题组已构建好的遗传图谱中的A04号染色体上SSR标记与Indel标记对亲本‘Yellow Sarson’与突变体cd1再一次进行PCR扩增，最终筛选出3对具有多态性的引物。与前文结果一致，并未发现具有多态性的三对引物与目的基因连锁。因此，将排除A04连锁群上的定位区间。

紧接着，针对A06号染色体相应的候选区间选取SSR引物30对。并对其亲本‘Yellow Sarson’与矮化突变体cd1进行PCR扩增，同样筛选具有多态性引物的标记，结果有8对引物具有多态性。根据BSA法，在F2分离群体中随机选取矮化突变体和野生型植株各10株，对其叶片进行DNA提取，然后吸取等量的DNA分别混合，作为近等基因池。用上述8对具有多态性的引物对F2近等基因池进行PCR，对多态性引物进行二次筛选。最终发现这8对引物都存在多态性并且其条带相对较为清晰。紧接着，针对其选取F2群体内部的40个单株展开相应的PCR扩增，最后展开相应的连锁性分析，进一步获取与目的基因连锁的相关引物，最终完成相应染色体的定位。

我们利用有多态性的引物对突变体cd1的F2群体进行PCR扩增，结果发现，位于A06染色体上的L06-3标记在F2群体扩增的带型与‘矮化突变体cd1带型’一致，基本为‘A’，没有远缘亲本‘Yellow Sarson’的扩增带型。这一结果证实了BSR-Seq结果的准确性（图）。因此，最终将矮化突变体cd1基因定位在A06连锁群上。

图3-4 L06-3连锁标记

Fig.3-4 L06-3 linked marker

确定矮化突变体cd1基因位于A06连锁群上后，本试验又进一步对cd1基因定位，凭借参考已公布的大白菜3.0数据库（http://brassicadb.org/brad/downloadOverview.php），展开相应的染色体序列有效查找，确定相应的目标片段后，凭借Primer5软件进行SSR标记设计。总共设计20对SSR标记，针对远缘亲本‘Yellow Sarson’以及突变体cd1进行PCR扩增，最终共筛出6对有多态性的引物。用这6对引物对F2代植株群体共计500株隐性纯合体进行PCR扩增，记录基因型，筛选与目的基因紧密连锁的标记。最终引物L06-09 与L06-14重组植株数分别为11和14（图3-5）。通过计算重组率，最终将矮化突变体cd1基因初步定位在引物L06-09与L06-14之间（物理位置21621766-24683923）。

3.4相关候选基因的预测

根据BSR-Seq转录组测序定位区间范围，凭借基因NR数据库以及相应的白菜数据库进行筛选矮化突变体cd1中有关赤霉素的相关候选基因，经基因功能分析，最终在A06染色体候选区间内共找到4个候选基因，基因 ID分别为：BrA06g031210.3C、BrA06g034110.3C、BrA06g032180.3C、BrA06g033010.3C。

3.5候选基因在根、茎、叶中的差异表达分析

为了进一步确定候选基因，本试验分别对突变体cd1以及经赤霉素处理过的cd1的根、茎、叶中的相对表达量进行了分析。结果如图所示。候选基因BrA06g031210.3C、BrA06g034110.3C、BrA06g033010.3C在根、茎、叶中的相对表达量都显著上调。但候选基因BrA06g032180.3C在根、茎、中的相对表达量都相对下调，根中相对表达量显著上调。所以，该结果一定程度上排除了候选基因BrA06g032180.3C，剩余三个候选基因，在之后精细定位中将继续验证。

图 3-6 候选基因差异表达分析

Fig.3-6 Candidate gene differential expression analysis

3.6小结

基于对BSR-Seq结果展开的一系列验证与评估，进一步有效完成相应的矮化植株cd1染色体定位。其次凭借大白菜3.0数据库、Primer5展开相应的SSR引物设计，最后有效筛选出具备多态性引物以及与相应突变体cd1密切连锁的标记。最后将相应的矮化突变体cd1基因定位在引物L06-09与L06-14之间（物理位置21621766-24683923）。

为了进一步确定候选基因，本研究对其进行差异表达分析，最终候选基因为三个，分别为：BrA06g031210.3C、BrA06g034110.3C、BrA06g033010.3C，这三个候选基因将在后续精细定位中进一步验证。

第四章 讨论

4.1cd1是一个新型的白菜矮化基因

本试验根据外源施加赤霉素处理发现，cd1突变体对喷施赤霉素敏感。喷施赤霉素后，突变体株高表现为多分蘖并且恢复其株高。这表明出现矮化性状可能与赤霉素的合成途径有关。关于赤霉素调控白菜株高的研究也鲜有报道，所以，cd1作为一个新型的白菜矮化基因，能够帮助我们了解赤霉素对白菜株高的调控机理。但是，考虑到矮化突变体cd1授粉败育以及种子数量有限，目前没有进行充分的重复和处理组合，仍需继续深入研究来确定cd1基因与赤霉素合成代谢途径的关系。

4.2 白菜矮化突变体cd1的产生原因可能为细胞分裂过程受阻导致

通过细胞水平观察发现，造成矮化突变体的原因有三种情况，一种为细胞的伸长，另一种为细胞分裂过程受阻，最后一种为前两者情况同时发生。（杨意宏 等 2018）。经细胞学研究，在水稻的等位基因矮杆株系上，发现节间长度与细胞数目成正相关，与细胞长度没有显著相关性，这表明节间变短很很可能是由于细胞数目减少变成的。（Wang N.,et al. 2017）本试验通过对白菜矮化突变体cd1和野生型植株的茎进行石蜡切片观察发现，矮化突变体cd1茎的细胞数目显著少于野生型植株。这表明cd1在细胞分裂过程中受到阻碍。因此cd1表现为矮化性状可能是由于细胞分裂受阻所致。

4.3cd1的矮化性状明显，可用于杂交育种

本试验矮化突变体cd1表现为极度矮化，是目前在白菜作物上发现为数不多的矮化突变体，这说明cd1对白菜株高的调控作用十分明显，能有效的较低白菜的株高。但是，如何合理利用cd1降低白菜株高，还需我们更进一步了解cd1的调控机制。

突变体cd1株高虽然极度矮化，但是与产量相关的性状表现较差，花粉活力检测结果表明，育性极差。很难应用于白菜育种工作中。因此，本试验结论可为后续工作做一个基础。

4.4本试验的后续工作

本试验是以白菜矮化突变体cd1为材料，利用BSR-Seq分析与验证最终将矮化突变体cd1基因初步定位在引物L06-09与L06-14之间（物理位置21621766-24683923）。后续工作将针对矮化突变体cd1的遗传特性与生理特性，结合BSR-Seq分析结果，对突变体cd1进行精细定位。再对其对突变体cd1和远缘亲本‘Yellow Sarson’做转录组分析，进一步探究矮化突变体cd1的分子机制并验证候选基因。克隆其全长cDNA，进行序列分析、时空表达分析、亚细胞定位等。

第五章 结论

1.通过对材料突变体cd1与野生型植株的农艺性状进行测量发现：与野生型相对比，植株生长缓慢、下胚轴极短、叶面积变小；叶片颜色加深、有刺毛；根的长度也明显收到抑制，主根变短，侧根数目也明显减少；突变体cd1植株的叶长、叶宽以及株高等数据均极显著低于野生型植株。

2、对其生理指标测量发现：突变体cd1叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素占比都显著大于野生型，因为其叶绿素占比相对较高，所以突变体cd1光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度也高于野生型，可以说明，颜色加深有助于光合作用，由于蒸腾速率低于野生型，说明突变体cd1对外界环境的适应能力较强。但是，我们通过花粉活力测定，我们发现，突变体cd1的花粉活力极低。

3、通过对突变体cd1茎秆和叶片进行石蜡切片细胞学观察发现，在叶片上，我们推测叶片表型的不同是由于细胞数目减少和细胞不规则排列造成的。在茎上，我们认为矮化突变体cd1的茎秆组织的薄壁细胞和中柱细胞未能在纵向上正常伸长，细胞数目减少可能是导致茎秆变短的原因。

4、根据外源施加赤霉素处理发现，矮化突变体cd1对赤霉素敏感。外源喷施后，突变体的株高可以恢复其高度。这表明矮化性状的出现可能与赤霉素合成途径有关。

5、基于对BSR-Seq结果展开的一系列验证与评估，进一步有效完成相应的矮化植株cd1染色体定位。其次凭借大白菜3.0数据库、Primer5展开相应的SSR引物设计，最后有效筛选出具备多态性引物以及与相应突变体cd1密切连锁的标记。最后将相应的矮化突变体cd1基因定位在引物L06-09与L06-14之间（物理位置21621766-24683923）。

6、本研究对其候选基因进行差异表达分析，最终确定三个候选基，分别为：BrA06g031210.3C、BrA06g034110.3C、BrA06g033010.3C，这三个候选基因将在后续精细定位中进一步验证。

参考文献

[1]白丽君, 尹淑霞. 植物矮化突变体的来源及矮化机理研究进展.生物技术通报, 2014, (06):34-39.

[2]白丽君，尹淑霞.植物矮化突变体的来源及矮化机理研究进展[J]. 生物技术通报，2014，6：34-39.

[3]陈晶晶,胡玉林,胡会刚,等.植物矮化相关基因的研究进展.广东农业科学,2014, 41(15): 126-132.

[4]程云,王枟刘,杨静,等.种植密度对夏玉米基部节间性状与倒伏的影响［J］.玉米科学,2015,23（5）：112-116.

致 谢

在XXX副教授的悉心指导下，本论文才顺利得以完成，在本试验中，做出最大贡献的人不是我，而是我的导师，不论是在提供开题的建议、资料的收集、实验室的调配，还是试验种子的准备以及实验数据的分析都给了我莫大的帮助。此刻，我要把我崇高的敬意献给您，我非常自豪有您这样的导师，您的严于律己、平易近人，治学的严谨、视野的宽阔、知识的渊博、这都对我有着影响深远，是您为我营造了一种良好的学术的氛围，使我的论文更加的严谨。试验的成功离不开我的努力，更离不开导师的正确指导。正是因为我与导师的沟通交流，才得以使试验顺利完成。再次献上我真挚的谢意。

同时还要感谢本团队内的各个老师，感谢这三年以来给予的无私帮助，让我终生受益，他们的敬业精神让我感动，成为我学习的榜样，使我更加明确今后的目标和人生方向，让我对接下来的路充满了期待与斗志。

在整个研究生三年里，给予我帮助与鼓励的人很多。感谢我的室友XXX在生活上给我带来了很多欢乐以及帮助。感谢我的小伙伴XXX三年来的陪伴。感谢我的师姐XXXX，我的师妹XXXXXXX在实验上的帮助与支持。在此尤其感谢XXX师姐、XXXXXXX师兄，XXXX师妹以及XXX同学，他们无论是在生活、学习以及科研上，都不尽余力的帮助我，在这里衷心表示感谢。是你们的陪伴与帮助让我度过了悲喜交加的三年研究生生活。

然后，我要感谢我的父母，是他们在背后默默地给予我无限的力量，做我最坚实的后盾。是他们的鼓励与支持，才能让我一步一步踏实的向前走。

最后，感恩这三年来遇到的每一个人，希望我们都能为自己的理想而奋斗！