槐果碱对肝癌细胞SMMC-7721和肝细胞L-O2生长的影响

　　原发性肝癌简称肝癌，是指在肝细胞、肝内胆管上皮细胞或者两者混合发生的恶性肿瘤。肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，发展迅速，因其初期症状并不明显，因此发现时多已处于癌症晚期，晚期患者多因癌细胞扩散和转移导致预后不良，已成为世界恶性肿瘤致死的第2位病因[1]，目前肝癌是世界上男性第5常见肿瘤，女性第7常见肿瘤[2]。中国每年死于肝癌的约有38.3万人，约占世界的51%[3]，肝癌的致死率已跃居我国恶性肿瘤致死原因的第2位[3]。目前，肝癌在全球的发病率仍呈上升趋势。2014年2月3日，世界卫生组织发表的《全球癌症报告2014》显示，中国新增癌症病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。肝癌已经成为严重威胁人类健康和社会经济发展的社会问题。因此，积极寻找肝癌的危险因素，研究肝癌的发病机制，最终达到根治肝癌是当前中西医学届迫切需要解决对的问题之一。

　　肝癌的发病原因和机制较为复杂，其中HBV、HCV、HP的感染，生活饮食因素、遗传因素和环境因素等都是造成肝癌的发病率不断增长的主要原因。近年来，有许多的学者研究认为，慢性HBV和HCV感染是肝癌发生的独立危险因素，约四分之三的肝癌患者是由于感染HBV、HCV所致[4]。在中国等发展中国家中，慢性HBV感染是肝癌发病的首要危险因素。乙肝患者随访研究报道显示，HBV患者发生肝癌的概率是非HBV携带者的98.4倍[4]。HCV感染是发达国家肝癌发生的主要危险因素。病例随访研究证实，HCV抗体阳性患者较非HCV携带者发生肝癌的风险增加了20倍[5]。随着乙型肝炎病毒疫苗的不断推广，HBV相关性肝癌的发生率较HCV相关性肝癌的发病率明显下降[6,7]。

　　肝癌的治疗主要包括手术治疗和非手术治疗，肝癌的最佳治疗方法是手术切除，肝切除术、肝脏移植和射频消融术被认为是目前肝癌具有治愈性效果的3种方法[8]。但肝癌起病隐匿，病程短，恶性程度高，易复发转移，以及患者对肝癌的认知较少，一般发现时都已经是中晚期，很难手术治疗，因此肝癌的五年生存率低于9%[9]。近年来随着影像学、分子生物学、中医中药学等的不断发展和进步，肝癌治疗由传统的外科手术为主转变为多方法综合与序贯治疗，甚至是个体化治疗。肝癌的非手术治疗包括：放化疗，介入治疗，消融治疗肝移植，分子靶向治疗及生物治疗和中医药治疗等治疗手段。药物化疗仍是肝癌的主要治疗手段之一，其中中药在其中起着至关重要的作用。从中药和天然药物中寻找特异性强的和低毒性的治疗药物是一种新的治疗思路。

　　在亚洲地区，肝癌是一种常见的癌症。尽管肝癌患者表现出相似的临床病理特征，然而治疗和预后有不同的结果。细胞毒性的化疗是肝癌的主要治疗方式之一，但是化疗的患者预后差，生存率低，生活质量差。因此，当务之急是要积极寻找更好的新型抗癌药物来替代化疗药物，或者降低化疗药物的副作用。其中[10,11]，天然的植物化学提取物凭借其在神经系统、心血管、内分泌系统等多系统疾病中的良好治疗效果，而成为研究热点。尤其是在肿瘤的预防和治疗上，这些天然的植物化学提取物表现出了极大的优势，天然的植物化学提取物有望成为新一代抗癌药物。目前，天然的植物化学提取物如：苦参碱类生物碱、姜黄素、3,3'-二吲哚基甲烷、芹菜素、白藜芦醇、花青素、槲皮素等是研究的热点。这些植物化学提取物具有抗氧化、抗炎、抗血栓形成、抗动脉粥样硬化等多重功效[12,13]，同时参与凋亡、自噬等多种信号通路，从而影响肿瘤的血管形成、侵袭迁移等[14-17]。Maan等人的研究显示，植物化学提取物对肝癌具有较好的防治作用[18]。

　　苦参碱类生物碱是以苦参碱为代表的化学结构相似的一类生物碱，主要有苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱及槐胺碱等。他们在药效上也很接近,都具有清热、燥湿、杀虫、利尿等功效,其作用广泛,效果明显[19]。苦参碱又名田菊健，分子式C12H24N20。苦参碱作为传统中药成分主要来源有豆科植物苦参根，主要药理成分为苦参碱(MT)和氧化苦参碱(OMT)。苦参碱药理作用广泛,是抗肿瘤的活性成份,有研究表明在体外它可诱导K562细胞向红系和粒系分化,可抑制鼠移植性肿瘤生长和诱导SMMC-7721细胞分化[20]。在体内,苦参及其生物碱也有抗肿瘤的报道,并且可治疗肝炎,毒副作用小,还能提高免疫力,故可能发展成为很好的抗癌新药。但苦参碱抗炎、抗肿瘤生长的分子机制尚未完全阐明。

　　早年曾从苦参中分离出生物碱，证明苦参碱(matrine)和氧化苦参碱(oxymatrine)是其主要成分，其他含量少的生物碱没有进一步研究[21]。近年随着分析分离技术的进步，经过大量的研究发现其还含有少量的槐果碱(sophocarpine)、氧化槐果碱(oxysophocarpine)、槐啶碱(sophoridine)、槐胺碱(sophoramine)、槐醇碱(sophoranol)、莱曼宁(lehmannine)等20多种生物碱[22]。国内外大量的研究表明苦参碱类化合物有多方面的药理作用，如抗心率失常、抗动脉粥样硬化、保肝利胆，升高白细胞、治疗湿疹、乙型肝炎等。近年来还有报道其有较强的抗肿瘤活性作用，对黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、上皮性卵巢癌和乳腺癌等都有不同程度的抑制作用[23-26]。苦参碱抗肿瘤机制较为复杂，多靶点、多途径作用是其亮点。通过查阅大量的国内外文献，发现涉及苦参碱类化合物的研究国内居多，国外较少。

　　目前有关苦参碱的研究主要在3方面，一是苦参作为天然药物，利用现代先进的分离和分析技术，对其主要成分苦参碱等进行分离分析；二是苦参作为传统中药在治疗效果、药理和临床功能方面的研究，研究苦参各种不同类型制剂的抗菌、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗心率失常、消肿利尿、免疫及生物调节等作用。研究药理过程中苦参碱的药动学及分子结构生物活性；三是对苦参碱的全合成、结构修饰以及与其他药物联合应用的研究。这方面尤以槐果碱的研究最多，而苦参碱的研究相对较少[27]。近期，有文献报道，以槐果碱和美法仑为原料，利用拼合原理制备的MAT-MEL对人肝癌SMMC-7721细胞具有明显增殖抑制作用[28]。然而，槐果碱在肝癌中的作用机制还未完全被发现。另外，有文献表明，槐果碱对正常小鼠有一定的毒性[29]。

　　细胞的死亡，指细胞因受严重损伤时，出现结构破坏、代谢停止、功能丧失等不可逆性的变化[30]。细胞的死亡分为：细胞坏死和细胞凋亡。细胞坏死（Necrosis），是指各种物理、化学因素或病理刺激引起的细胞损伤和死亡，是一种细胞的病理性非正常死亡[31]，坏死时细胞的形态表现为体积变大，细胞膜破裂，细胞内容物外溢，细胞核的变化不明显，可引起局部炎症反应。细胞的凋亡（Apoptosis），是指机体为维持内环境稳定而主动采取的结束细胞生命的活动。1972年，Kerr首次提出了细胞凋亡这一概念。发生凋亡时，细胞表现为体积变小，核质浓缩，核膜核仁碎裂，DNA降解，凋亡发生时无细胞内容物外溢，故局部不引起炎症反应[32]。细胞凋亡后残留的细胞内容物分割形成凋亡小体（Apoptosome）。值得注意的是[33]，细胞的程序性死亡是指由特定基因的程序性表达所介导的细胞死亡。而细胞凋亡是细胞的程序性死亡中的一种类型，即Ⅰ型程序性细胞死亡，特指伴有细胞形态学变化的一种生理性死亡方式，两者概念不可混淆。早在1994年，X著名生物学家Martin就对细胞凋亡和细胞程序性死亡就行了区分。

　　细胞凋亡的信号通路主要由死亡受体途径、内质网途径和线粒体途径这三部分构成[34]。具体表现为：（1）线粒体途径，又称为内源性途径，该途径分为依赖Caspase途径和不依赖Caspase途径的凋亡。促凋亡因素刺激下，线粒体中的Cytc释放进入胞质，与Apaf-1(凋亡蛋白酶)结合成多聚体，该多聚体和Caspase-9（凋亡起始分子）结合成凋亡小体后，Caspase-9被激活，继而激活了Caspase-3，6，7等一系列可激活凋亡级联反应的分子。不依赖于Caspase途径的凋亡是直接通过线粒体释放凋亡诱导因子AIF来促进诱导凋亡发生的。值得注意的是，有研究证实[35]，Bcl-2家族可通过调控线粒体膜透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），实现CytC的释放。Wang等人[36]已证实Bcl-2蛋白家族是通过线粒体途径来激活细胞死亡这一观点的。在线粒体途径中，Bcl-2家族蛋白的调控至关重要。Bcl-2家族蛋白分两类，促凋亡蛋白（如:Bax、Bak、Bim、Bad、Bid等）和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-XL等），当细胞受损时，促凋亡蛋白激活，抗凋亡蛋白功能受抑，从而诱导细胞凋亡发生[37]。（2）内质网途径：内质网应激时细胞内钙离子稳态失衡或出现钙超载时，Caspase 12就会被激活，活化的Caspase 12进一步激活下游Caspase 9从而促进凋亡的发生。（3）死亡受体途径，TNF,Fas等死亡受体与FADD（具有死亡功能区的Fas相关蛋白）结合后激活Caspase 8，Caspase 10，进而激活下游凋亡执行分子Caspase-3，6，7，促进凋亡发生。

　　当细胞生长失去程序性调控时就会导致肿瘤，而细胞凋亡可有效抑制细胞的异常增殖，从而抑制肿瘤的发生。白藜芦醇作用于宫颈癌细胞时，可激活细胞内ERK1/2并发生核转移，继而使P53发生磷酸化，抑制核转录因子（NF-ＫB）的活性，诱导细胞凋亡[38,39]。体外实验证明[40]，熊去氧胆酸可通过激活肝癌BEL7402细胞凋亡而发挥抗肝癌效应。天然的抗肿瘤活性物质-三萜皂苷（giganteaside D,GD)能激活肝癌细胞内线粒体依赖性的细胞凋亡途径，激活活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，阻断ROS的产生会减弱线粒体途径介导的细胞凋亡效应[41]，显著抑制肿瘤细胞的生长。虾青素（Astaxanthin,ASX）具有很强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性。ASX通过抑制PI3K/Akt和ERK的活性，从而下调Wnt/β-catenin的表达，阻断NF-ＫB p65的核转录，发挥肝癌细胞的增殖抑制和凋亡效应[42]。在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中，都会有脂肪酸合酶（FAS）的高水平表达，Fan等研究者证实[43]，姜黄素可以作为FAS的有效抑制剂，其可从蛋白和基因层面抑制FAS的表达以及其活性，从而诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡。并且姜黄素可促进乳腺癌细胞内促凋亡蛋白Bax的表达，而抗凋亡蛋白Bcl-2的水平明显下调。这就说明姜黄素通过激活乳腺癌细胞的凋亡途径实现了抗肿瘤效应。

　　综上所述，细胞失去基因调控的生长会导致肿瘤的发生，细胞凋亡作为由基因调控的细胞正常死亡方式，有望成为肿瘤治疗的一个新的靶点。

　　苦参碱在临床上常用于抗肝纤维化、保肝、抗乙肝病毒等。有文献证实其能有效抑制人肝癌细胞株HepG2的增殖,并具有直接杀伤作用。司维柯等对苦参碱抑制肝癌细胞HepG2增殖的时效、量效进行了全面的研究,通过苦参碱诱导人肝癌细胞凋亡,并将细胞阻滞在GO/G1期,使细胞不能进人S期进行DNA合成,最终使瘤细胞的体外增殖受到抑制,发挥其抗肝癌作用。然而，苦参碱类生物碱在肝癌中的作用机制还未完全被发现。因此，本实验旨在研究比较槐果碱对肝癌细胞和肝细胞的生长影响，为探索新的抗癌药物提供了科学依据。

　　本文拟采用MTT法、流式细胞术、western bolt法、线粒体膜电位检测等方法研究槐果碱对肝癌细胞SMMC-7721和肝细胞L-O2生长的影响。

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