大环内酯磷酸转移酶3D数据试验方法

1数据来源

蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)是1971年由X纽约Brookhaven国家实验室创建的主要收集生物大分子如蛋白质、核酸、多糖以及病毒的结构数据库。该数据库为分子生物学、生物化学和生物工程学等学科的研究提供了结构依据。其数据并不是从文献中收集来的而是由发现者通过X射线单晶衍射^[11]、核磁共振、电子衍射等实验室手段而直接提供的，这样就大大扩充了该数据库的容量。

2.2大环内酯磷酸转移酶3D数据准备

通过查找相关文献，从蛋白晶体数据库^[12-18](www.pdb.org) 中获取诱大环内酯磷酸转移酶（PDB ID:5igz）的蛋白晶体结构。下载保存为5igz.pdb
通过Sybyl/Biopolymer^[19-23]模板对蛋白质结构进行预处理，以PDB格式读取大环内酯磷酸转移酶晶体结构，选择对接配体、删除其他配体及全部结晶水、抽提原配体、暴露活性口袋，并蛋白质结构分析:包括氨基酸末端处理、加氢原子、加载Gasteiger-Huckel电荷，质子化、添加Amber7 FF99原子类型、及氨基酸侧链修复等，以选择的原配体为指针搜索受体蛋白的活性位点、生成分子探针，确定对接位点在蛋白质结构中的位置；保存需要的原配体5igz,保存为：5igz_H-L-0.50-0.sfxc。
执行步骤：打开SYBYL-X 2.0软件→Biopolymer-Structure Preparation Tool对受体蛋白进行前处理→Extract Ligand Substructures-Select Ligands抽提原配体、暴露活性口袋→Remove Substructures对受体蛋白中对活性口袋对接无影响的结构进行处理→Analyze Selected Structure→对受体蛋白氨基酸进行修饰：末端修饰、加氢、电荷、原子类型、侧链修复处理；保存 5igz1mjt_H-L-0.50-0.sfxc完毕。

2.3配体小分子的虚拟筛选、分子对接

利用SPECS数据库（www.specs.net）精度筛选找出31个化合物的三维数据建成数据库，以及通过查找文献^[24]获得的7个小分子化合物结构.
 
 
图3 吡啶类抑制剂化合物母核
使用Sybyl/Basic模块进行分子构建、及力场优化，全部导入小分子化合物表单，保存为：sdf格式。将此38个小分子化合物作为配体，使用SYBYL Surflex模板与受体蛋白1MJT的活性位点进行对接，最后从中选出打分最高的前9个化合物进行分析和讨论。
3．结果与分析

3.1配体小分子虚拟筛选结果讨论

通过sybyl的分子对接模块，基于打分函数对38种配体小分子与受体蛋白5igz进行分子对接的亲和力评价，得到HXY-001等对接打分高的9小分子化合物对接打分结果，见表1
表1 大环内酯磷酸转移酶抑制剂对接打分
 
 

3.2分子对接结果分析

通过分子对接打分函数值较高的化合物在受体蛋白活性位点结合模式分析，得如下以分子内氢键、亲疏水口袋为主要构效关系的3D结合模式图：
 
图Compound 5igz与蛋白质活性口袋的3D结合模式图
 
图Compound 5igz与蛋白质结合位点关键氨基酸残基的相互作用
 
 
 
图Compound 5igz与蛋白质结合位点关键氨基酸残基的相互作用2D图
通过分子对接研究，综合打分函数值和化合物与蛋白质的结合模式分析：根据图1-2发现化合物分子内形成分子氢键，用于稳定分子构型。分子中苯环上氨基与TRP316上碳基形成氢键，吡啶环上的氨基分别与TRP225上羰基形成氢键，与GLU230羧基中碳氧双键形成氢键，吡啶环上的氮原子与GLU230中羧酸形成氢键；小分子中丁氨基分别与ARG61中羰基形成氢键，与ILE63中氨基形成氢键，此外吡啶环的诱导效应和共轭效应进一步增加了小分子与蛋白质晶体结构结合的稳定性。
 
 

3.3．结果讨论

对接结果显示，小分子配体主要是和受体活性口袋上的氨基酸残基侧链以疏水作用、氢键、芳环中阳离子的相互作用，影响空间构象的变化，从而影响到受体大分子的活性，使它们对机体的作用减弱。多数类蛋白质片段化合物与蛋白复合物的活性位点结合，含有多羟基和羰基的化合物能与活性中心的多处氨基酸残基形成氢键，从而使化合物分子与活性中心结合更加紧密，抑制作用更强。 吡啶环的共轭效应使抑制剂与受体蛋白结合更加稳固，而侧链上的氨基强电负性易与氨基酸中羧基、羰基、羟基形成氢键。疏水基团能与活性中心的氨基酸残基形成较强的疏水作用力。这些可能是化合物产生作用的关键。
4．结论
通过对接筛选结果较高的化合物在靶标蛋白晶体结构中三维定量构效关系分析得：诱导型一氧化氮合酶抑制剂（新型吡啶类化合物）中两个氮杂环的诱导共轭效应和环上氨基、苄基芳环及苯环上烷氨结构都能与氨基酸侧链中的羰基、羧酸等强电负性基团形成氢键。此外中心对称的噻吩结构也是抑制诱导型一氧化氮合酶表达的活性基团，含有芳环、双吡啶环及氮正离子（碳氮双键）等强诱导效应的结构可以促进与靶受体活性部位、空间及力场效应中与受体完美匹配，并影响受体与药物结合取向和受体空间构象的变化，从而达到抑制受体诱导型一氧化氮合酶的表达活性。TRP56、E222、TRP225、TYR344、 TRP316、TYR344、PRO203、ASN235、TYR226、ILE63形成的疏水口袋和杂环间的共轭等力场效应对小分子与受体结合的稳定性方面起到的空间效应是药物作用有效性的基础；因此可以达到抑制受体-诱导型一氧化氮合酶表达活性的目的。