构树叶片叶绿素荧光诱导动力学特征的季节变化

　　构树（Broussonetia papyrifera）为桑科（Moraceae）构属（Broussonetia）木本植物，是一种生态型经济树种，在我国除东北及西北北部寒冷区域外，其他地区均有分布，在我国黄河流域以南，特别是贵州、广西、云南等地分布较为集中,其喜生长在阴湿肥沃的环境中，尤其是河流岸边及土壤肥力强区域，它可以抗御短期的季节性干旱及洪涝灾害，伴生的植物主要是生命周期短的植物。目前大多数构树处在野生或半野生状态，但其体内含有丰富的蛋白质以及可利用的营养元素，是木本饲料主要的选择树种；同时，构树适应性强，耐旱、耐瘠，常野生或栽于村庄附近的荒地、田园及沟旁，具有一般植物难以比拟的旺盛生命力，是困难地造林的先锋树种。此外，构树还可用作高档纸张和织物、药材和食品等的原料。

　　近年来，构树因其在生物学特性、生态学特性、饲用特性以及市场利用空间等方面的潜在价值而受到越来越多的关注，加大这一宝贵绿色资源的开发利用力度。对于寻求可再生生物原料新途径有着重要的价值。因此，开展构树生理习性与生物活性物质含量特征研究，进而加强构树资源的开发利用、深入挖掘经济型植物构树的利用价值具有重要意义。

　　叶绿素分子吸收可见光光子后发生电子跃迁到能量较高的激发态。通常情况下处于激发态的电子不稳定，要放出能量回到基态。而电子回到基态时放出的能量用于：1)发射出红色荧光；2)放出热；3)用于光化学反应。三种途径彼此竞争，因此热耗散、光化学反应以及入射光强的变化都会引起荧光产量的变化。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点[1]。几乎所有的光合作用过程的变化均可通过叶绿素荧光反映出来，而叶绿素荧光动力学测定技术不需破碎细胞，不会伤害到生物体，因此通过对叶绿素荧光的研究以间接研究植物光合作用的变化，是一种简便、快捷、可靠的方法[2]。

　　利用叶绿素荧光分析技术不仅能够从另一角度反映植物的光合作用情况，也能够直观地反映植物受到的胁迫伤害，过对荧光数据的分析，可以推断不同季节间构树的区域适应性、光合潜能等。其应用于构树育种工作，将有利于丰富育种材料筛选的手段，缩短品种选育时间，有效发展构树产业。

　　高温在植物生长乃至生存上存在胁迫作用。Lobell等[3]调查表明，在植物的生长季中，若平均温度上升1℃，作物的产量约下降17%。通常认为细胞生理过程在高温下受到抑制，也就是说光合作用对于热胁迫是极其敏感的。在高光强高温胁迫下，叶片细胞叶绿体的内囊体膜，尤其是光系统Ⅱ(PSⅡ)的结构和功能受到损害，导致光合速率下降。由于高温环境下不同植物光合作用受影响的程度不尽相同[4]，且光合作用在植物生理中占据重要地位，研究植物在高温胁迫下光合作用的变化，有助于了解植物对高温胁迫的生理适应机制，同时能为筛选耐高温品种提供一定依据。

　　研究发现，由于天线色素与光系统II(PSII)反应中心并非一一对应，每个PSII均从天线色素系统中获得电子[5]。叶绿素荧光参数可用于描述额定光化光强度下光系统中能量平衡及分配状况(ΦPSII+ΦNPQ+ΦNO=1),其中可调节性能量耗散ΦNPQ和非调节性能量耗散ΦNO可以衡量非光化学猝灭途径的激发光能的分配特性[6]。叶绿素荧光特性响日变化规律以及对于高温胁迫的响应在多种作物上得到较为充分的研究[7-9]，其中最大光能利用效率Fv/Fm、基于Puddle模型的光化学猝灭qP和ΦPSII均随着胁迫的加剧而逐渐降低,并且与品种抗性呈显著正相关关系。但对于叶绿素荧光动力学参数的季节性变化研究中，特别是针对构树的基础研究鲜有报道[10-13]。

　　所选实验地为安徽省合肥大蜀山森林公园，其位于安徽省合肥市西部，地处中纬度地带。年平均气温在15–16℃之间，年平均降水量在900–1,000 mm之间，为亚热带湿润季风气候。气温变化的特点是气候温和、雨量适中、春温多变、秋高气爽、梅雨显著、夏雨集中。地理位置为经度117.18oE纬度31.84oN，日照2,100多个小时，平均年蒸发量1,538 mm，年均相对湿度74%–78%、全年无霜期230 d，适宜各种树木寄居生长。

　　选取安徽省合肥大蜀山森林公园广泛分布的野生成年构树为实验对象。

　　2.3.1材料选取

　　实验分春、夏、秋3季，于每月中旬天气晴朗的夜晚，日落1 h进行充分暗适应后实施。在实验地随机选取5株成年构树，每株选择3枝远枝端轴面中部向光部位的枝条，每枝从顶芽起选择第4，5，6枚无病虫害树叶，共计45枚叶片进行实验。

　　2.3.2光响应曲线的测定

　　使用Junior-PAM(Walz,Germany)便携式调制叶绿素荧光仪，每隔10 s照射1次饱和脉冲光，连续照射8个强度不断升高的光化光(125，190，285，420，625，820，1,150，1,500μmol(photons)m-2 s-1)，此时的光响应曲线被称为快速光曲线(RLCs)。通过对快速光曲线进行拟合(拟合方程：ETR=ETRm·tanh(α·PAR/ETRm))，可以得到以下几个主要参数所得数据使用：

　　α，单位：clectrons photons，快速光曲线的初始斜率，反映了对光能的利用效率。

　　ETRm,单位：μmol m-2 s-1，最大电子传递速率。

　　Ek，单位：μmol m-2 s-1，最小饱和光强，反映了叶片对强光的耐受能力。

　　2.3.3荧光诱导曲线的测定

　　使用Junior-PAM(Walz,Germany)便携式调制叶绿素荧光仪测定各项叶绿素荧光参数，测出荧光诱导过程中的荧光参数，其中设置的三个光化光梯度分别为190μmol(photons)m-2s-1、625μmol(photons)m-2 s-1、1,500μmol(photons)m-2 s-1，重复测试设为15组。开始预先编制的程序，照射检测光0.1μmol(photons)m-2 s-1，测定初始荧光Fo，然后加饱和脉冲光10,000μmol(photons)m-2 s-1，测定最大荧光Fm。然后在自然光下实时荧光Ft稳定后，给一次饱和脉冲光测定Fm’。延迟40 s后打开测量光和光化光，每隔20 s照射1次饱和脉冲光，由仪器直接读取PSII最大光化学效率Fv/Fm、光化学猝灭系数qP、非光化学猝灭系数NPQ、非调节性能量耗散的量子产量ΦNO、调节性能量耗散的量子产量ΦNPQ等参数。操作过程中，为避免外界环境对荧光数据造成影响，本实验采取多组测量取稳定后的平均值来减少其中的影响误差。

　　测得数据用Microsoft Excel 2016进行整理，用SPSS Statistics 23.0对整理后数据进行系统的统计分析和处理。采取单因素方差分析（one-way ANOVA）对照三个季节构树叶绿素荧光参数的差异显著性，利用Duncan法对数据进行多重比较，通过上述方式系统查验在差别季节的各数据指标的差异性，显著水平设定为α=0.05。最后使用Origin 8.5作图。

　　Fo是植物叶片没有进行光合作用时的最小荧光，也就是PSⅡ反应中心都处于开放状态。Fm为植物叶片没有进行光合作用时的最大荧光，也就是PSⅡ反应中心都处于闭合状态。Fm与Fo之间的差值Fv反映了植物PSⅡ反应中心进行光化学反应的能力范围。Fv/Fm反映了植物的潜在最大光合能力。正常生长的植物Fv/Fm相对稳定，不受物种和生长条件的影响，大约为0.8左右，当环境变化对植物造成生理胁迫或伤害后该参数明显下降，如光抑制和热胁迫。从图3-1可以看出，Fv/Fm在同一季节不同稳态光条件间差异不显著；在190μmol(photons)m-2s-1下最大量子产量Fv/Fm在春季（0.82）与夏季（0.78）间差异不显著，秋季（0.55）时显著降低，这与625μmol(photons)m-2s-1以及1,500μmol(photons)m-2s-1下的显著性差异情况相同。

　　叶片吸收的光能用于光化学反应和非光化学反应的两部分可以通过荧光产量的比值参数来进行区分。光化学猝灭系数qP是由于植物的光合作用而引起的荧光猝灭，反映了植物光合活性的高低。非光化学猝灭系数NPQ是由于热耗散引起的荧光猝灭，反映了植物耗散过剩光能为热能的能力，也就是光保护能力。如图3-2(A)所示，在190μmol(photons)m-2s-1下光化学猝灭系数qP在春夏秋三个季节间均存在显著差异(p<0.05)，其中春季（0.60）<夏季（0.70）<冬季（0.78），这与Fv/Fm的变化相反，625μmol(photons)m-2s-1以及1,500μmol(photons)m-2s-1下的显著性差异情况与前者相同；图3-2(B)反映了在同一季节间，随着稳态光强度的增强，qP值不断降低；还可以看到：在190μmol(photons)m-2s-1下，同一稳态光不同季节间NPQ均存在显著差异(p<0.05)且不断降低，春季（0.82）>夏季（0.52）>（0.46）秋季，625μmol(photons)m-2s-1以及1,500μmol(photons)m-2s-1下的显著性差异情况与前者相同，同一季节不同稳态光条件下随着稳态光强度的提高NPQ值也升高。

　　图3-2叶片的ΦPSII反应中心光化学猝灭系数（qP）(A)和非光化学猝灭系数（NPQ）(B)的季节变化（平均值±标准误差，n=15）。差异小写字母表示三个季节及三种稳态光作用条件下构树叶片qP和NPQ差异显著。

　　调节性能量耗散的量子产量ΦNPQ是PSⅡ吸收的光能中不用于光合电子传递而以热形式耗散掉的部分，若ΦNPQ较高，一方面表明植物接受的光强过剩，另一方面则说明植物仍可以通过调节来保护自身，为光保护的重要指标。非调节性能量耗散的量子产量ΦNO是植物通过其他形式减少的进入光化学途径的能量占总吸收能量的比例，若ΦNO较高，则表明光化学能量转换和保护性的调节机制不足以将植物吸收的光能完全消耗掉，这是植物可能已经收到损伤，为光损伤的重要指标。如图3-3(A)所示，在625μmol(photons)m-2s-1非调节性能量耗散的量子产量ΦNO在秋季（0.44）显著升高，春季（0.29）秋季（0.32）差异不显著，表明光损伤不断升高，625μmol(photons)m-2s-1以及1,500μmol(photons)m-2s-1下的显著性差异情况相同；在同一季节不同稳态光处理间差异不显著。如图3-3(B)所示，ΦNPQ在190μmol(photons)m-2s-1稳态光条件下，春季（0.47）显著高于夏季（0.39）和秋季（0.36），这与625μmol(photons)m-2s-1稳态光条件下结果一致；在1500μmol(photons)m-2s-1条件下三个季节均存在显著差异，其中春季（0.59）>夏季（0.53）>秋季（0.45）。在同一季节下，随着稳态光强度的增强，ΦNPQ也不断升高。在三个季节间构树叶片ΦNPQ值均大于ΦNO值，且随稳态荧光强度的升高，ΦNPQ、ΦNO的变化趋势近乎相反。

　　图3-3构树叶片在三个季节间非调节性能量耗散量子产量（ΦNO）（A）和调节性能量耗散量子产量（ΦNPQ）(B)的变化（平均值±标准误差，n=15）。差异小写字母分别表明三个季节及三种稳态光作用条件下叶片的ΦNPQ和ΦNO差异显著。

　　最小饱和光强Ek，反映了植物对强光的耐受能力，和植物的光饱和点及自身的耐受性有关。如图3-4所示，最小饱和光强lk在不同季节间均存在显著差异(p<0.05)，其中夏季（694.86）最低，春季（898.45）大于秋季（1047.11）。

　　图3-4最小饱和光强Ek的季节变化（平均值±标准误差，n=15）。差异小写字母表示三个季节的Ek差异显著。

　　光响应曲线的初始斜率α相当于最大光合效率，可用来表示光化学反应的启动速率，季节变化对初始斜率α的影响如图3-5所示。结果表明：不同季节间α存在显著差异，其中夏季（0.14）最高，春季（0.11）大于秋季（0.82）。

　　图3-5快速光曲线的初始斜率α的季节变化（平均值±标准误差，n=15）。差异小写字母表示三个季节的α值差异显著。

　　植物光合速率是植物生产力的重要表征指标，在全球气候变化下，因温度和降水的变异将导致植物生物力发生显著变化。近年来，全球气温不断升高，亚热带部分地区夏季高温和临时性干旱现象日益显著，高温与干旱严重威胁着植物的生存与生长。光能是植物进行光合作用的能量基础，但是，当光能超过光合机构所利用的量时，植物的光合能力将下降，从而产生光抑制[14]。对光合系统II(PSⅡ)的伤害是光抑制的一种表现形式，其中Fv/Fm是植物发生光抑制的敏感指标[15]。当光强达到光饱和点时，Fv/Fm降低，且降低幅度随着光强的增加而增加，比值的降低可以迅速恢复时，主要是由于光保护反应起作用所致，这种光保护可通过减少光吸收、增加光能的耗散来实现[16]。

　　植物固有的生活特性决定了不可避免地受到环境因子变化的影响。叶片展露于空气中接收太阳光能进行光合作用的同时，也不得不遭受季节变化引起的低温和光胁迫。低温条件下，强光容易引起光合器官的光抑制，严重的光抑制导致反应中心的不可逆破坏[17]。植物在长期的进化和适应过程中形成了多种抵御和减轻低温与强光胁迫的防御机制，保证物种的延续[18-19]。

　　本试验利用叶绿素荧光技术在室外自然条件下，测定并比较了构树在春夏秋3季的叶绿素荧光参数的差异。结果显示，夏季高温干旱复合胁迫下,构树叶片Fv/Fm呈现下降趋势但是与春季相比较不存在显著差异，且稳态光的增强对其影响不明显，这说明高温干旱复合胁迫对构树叶片反应中心的影响较小，这可能由于构树是强阳性树种，对光强的需求强烈。秋季时的Fv/Fm显著下降，可能是由于到了生长期后期，内在调节机制降低了光合能力。植物对复合胁迫响应的机理复杂，分析植物的叶绿素荧光参数，有利于了解植物对复合胁迫响应表现的状态,但还需从抗氧化性、活性氧和水力结构等方面进一步开展研究。

　　荧光猝灭方面，光化学猝灭系数qP不断升高，非光化学猝灭系数NPQ不断降低，也就是植物耗散过剩光能为热能的能力不断下降，调节性能量耗散的量子产量ΦNPQ不断下降，，非调节性能量耗散的量子产量ΦNO在秋季显著升高，光损伤不断升高，综合原因可能是夏季的干旱破坏了它的光合器官，也可能是因为它的生长季较短，在生长后期对强光的适应能力降低，光保护能力下降。

　　当季节变化时，构树能通过自身调节机制改变能量耗散ΦNPQ和ΦNO的比例，以适应夏季伏旱天气的影响，构树在夏季表现出较高的光能利用率，具有高光效潜能，对高光高热具有强较强的耐受能力，适应性相对较强。建议在构树的规模培养中注意叶片的强光累计胁迫作用，选取日照强的地域种植。

　　相对电子传递速rETR随PAR的变化图即为光响应曲线，即使光化光的持续时间短至10s，也可得出典型的光响应曲线。通过分析可以看出，夏季是最小饱和光强Ek显著降低和快速光曲线初始斜率α显著升高的季节，说明此时受高温高光强双胁迫影响光和能力下降，但光化学启动速率变快；秋季时Ek有所回升，表明可能未涉及叶片光合机构的永久失活，即PSII反应中心捕获天线光能吸收效率的降低是可逆的，与植物自我调节性有关。春季时构树叶片有着较高的光化学反应启动速率和最小饱和光强，可看出春季较适宜构树的生长发育。

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　　在论文完成之际，我要特别感谢我的指导老师给予我的热情关怀和悉心指导。在我撰写论文的过程中，老师倾注了大量的心血和汗水，无论是在论文的选题、构思和资料的收集方面，还是在论文的研究方法以及成文定稿方面，我都得到了老师悉心细致的教诲和无私的帮助，特别是他广博的学识、深厚的学术素养、严谨的治学精神和一丝不苟的工作作风使我终生受益，在此表示真诚地感谢和深深的谢意。

　　在论文的写作过程中，也得到了许多同学的宝贵建议，同时还到许多在工作过程中许多同事的支持和帮助，在此一并致以诚挚的谢意。

　　最后，向在百忙中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心地感谢！