青枯菌CysA蛋白功能的生物信息学研究

内容摘要

CysA蛋白是一种ABC转运蛋白，可以将硫酸盐和硫代硫酸盐转运进入细胞。本论文通过对青枯菌CysA基因和CysA蛋白质进行生物信息方面的分析,蛋白质的结构域、跨膜区域、亲疏性、卷曲螺旋区域、蛋白质的信号肽分别通过SMART、SOSUl和TMHMM、ProtScale、COILS、SignaIP等在线网站来预测。最后再预测CysA的二级结构和三级结构，同时也预测蛋白质的亚细胞定位，并构建该蛋白的系统发生树。结果分析该蛋白质有一段AAA结构域，为亲水性蛋白，无跨膜结构，位于细胞质中，不含卷曲螺旋，也没有信号肽。无规则卷曲与a螺旋在CysA中占比最大，三级结构呈桶状。从系统发生树上可以看出青枯菌与蒲桃青枯菌、血液病原细菌亲缘关系很近。通过研究发现CysA蛋白与其它复合体亚基结合共同完成转运硫酸盐和硫代硫酸盐，对青枯菌的生命活动起重要作用，本论文主要分析CysA蛋白的功能，为更进一步了解青枯菌提供一些理论依据。

　【关键词】青枯菌；生物信息；CysA蛋白

1 引言

1.1 青枯菌研究概述

1.1.1 青枯病概述

青枯病是细菌性植物病，当细菌侵染植物后，会引起植株的枯萎，此时植株虽萎垂但呈现青绿色，所以被称为青枯病。[1]此病主要出现于热带、亚热带还有温暖的地区，在我们国家，很多地方比如山东、云南、河南、江苏等地普遍存在。[2]青枯病可以发生在450多种植物中，如烟草、番茄、马铃薯等，严重影响农作物的产量，导致极大的经济损失。[3]

1.1.2 青枯菌概述及治病机理

青枯病主要是由茄科-雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum，简称青枯菌）入侵植株造成的。青枯菌是一种好氧性的革兰氏阴性菌，杆状单细胞，两端呈钝圆状，通常有1-3根单极生鞭毛，大小约为（0.5-0.8）×（1.3-2.2）um，可以运动，没有荚膜。在培养基上观察到菌落呈现润滑有光泽的圆盘状，随着时间推移，菌落会由最初的乳白色变为褐色。细菌在温度为30-35℃、PH值为6.6左右时生长状况最好。[4]温度的突然变化可以使细菌产生适应性休克反应，使他们可以在多种多样的环境中繁衍。[5]病菌可以在植株受感染部位或者混有病残体的土壤和肥料里越冬，等到第二年春天开始侵染植物，青枯菌适应环境能力强，可以在土壤中长时间存活，在高温潮湿的环境中有更强的生命力。病菌通过土壤、肥料、患病植株的组织渗出液等方式传播。[6]青枯菌从植物的伤口部位入侵到达木质部，然后在维管束扩散，影响导管正常的运输水分的功能，最终使植株枯萎。除此之外，当病菌的繁殖数量较多时，还可以入侵未受伤的植物，从植株的次生根的根冠进入，穿过一层鞘到达主根的表皮，病菌可以在根部繁殖2-6天，在此期间植株没有明显的症状。病菌继续繁殖穿过皮层到达细胞间隙，使得中胶层受到破坏，造成细胞空腔。此时植株只有薄壁组织和侵填体来防御病菌，当病菌大量增殖，穿过最后的这两道物理屏障后到达导管，会分泌一些致病因子，从而造成维管束堵塞，最终使植物体萎焉。[7, 8]致病因子主要有胞外多糖、Hrp基因编码的III型分泌系统、细胞壁分解酶等，这些致病因子可以保护病菌自身并且帮助病菌侵入植物体。[9]

1.1.3 ABC转运蛋白概述

自然生物体在吸取营养物质和排泄废物的过程中，腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（简称ABC转运蛋白）发挥了重要的作用。[10]在结构上，ABC转运蛋白包含两个核苷酸结合区域和两个跨膜结合区域。核苷酸结合域的序列比较保守，包括ATP结合基序、WalkerA序列、WalkerB序列、Q loop序列、H loop序列。该结构域存在于细胞质中，能够结合ATP并将其水解来为物质的转运提供必需的能量。而跨膜结构域序列没有那么保守，转运物质不同，序列也相应的改变。[11, 12]

1.1.4 CysA蛋白的研究进展

M. Salanoubat等人[13]曾在2002年测出了青枯菌GMI1000的基因组序列，CysA基因编码的CysA是一种ABC转运蛋白。该复合物由一个CysP（溶质结合蛋白），一个CysT（跨膜蛋白）、一个CysW（跨膜蛋白）和两个CysA（ATP结合蛋白）组成。CysA蛋白负责能量与转运系统偶联，可以将硫酸盐/硫代硫酸盐转运进入细胞。具体过程为：ATP+H2O+sulfate/thiosulfate(out)=ADP+H++phosphate+sulfate/thiosulfate（in）[13]，如图1-1所示。

注：A：硫酸盐转运进入细胞。B：硫代硫酸盐中转运进入细胞（图片引自UniProt）

1.2 研究目的和意义

在国内，该复合物很少被报道，国外学者对CysP蛋白做了些许研究[14-17]，CysA蛋白很少被研究。该论文主要对CysA蛋白做了生物信息学方面的分析，为更好的理解青枯菌，从而为预防青枯病提供一些理论依据。

1.3 技术路线图

2 分析软件及序列获取

2.1 分析软件及网站

本论文的目的主要是对青枯菌的CysA蛋白进行生物信息分析，进而预测其功能。在此过程中，需要使用一些数据库来获取基因及蛋白的相关信息，同时还需要使用一些软件及网站来进行生物信息分析。

数据库：①NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，NCBI是一级核酸数据库，可以下载CysA基因和CysA蛋白的序列信息等。

②UniProt：http://www.uniprot.org，UniProt是一级蛋白质序列数据库，可以查看CysA蛋白序列的相关信息。

网站：①SMART网站http://smart.embl-heidelberg.de/，该网站可以预测CysA蛋白质的结构域。

②ProtScale网站https://web.expasy.org/protscale/，可以预测CysA蛋白的亲疏性。

③SOSUI网站http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html，可以预测CysA蛋白的亲疏性。

④TMHMM Server 网站http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/，可以预测CysA蛋白质中的跨膜螺旋。

⑤CELLO 网站http://cello.life.nctu.edu.tw/，将蛋白质序列提交后可预测该CysA蛋白的亚细胞定位。

⑥COILS网站https://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html，可以预测CysA蛋白的卷曲螺旋区域。

⑦SignaIP网站http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/index.php，是用来预测革兰氏阳性菌、古细菌、真核生物、革兰氏阴性菌的蛋白质中是否有信号肽，并且预测出信号肽切割位点的位置。

⑧SOPMA网站http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html，可以用来预测CysA蛋白的二级结构。

⑨Jpred 4网站http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/，将CysA蛋白的序列提交后，可以分析该蛋白的二级结构。

⑩SWISS-MODEL网站https://swissmodel.expasy.org/，可以模拟CysA蛋白的三级结构。

（3）软件:

BioEdit

2.2 序列获取

打开NCBI，选择All Databases中的Gene, 在后面一栏中输入基因ID号1220171，点击Search进行检索。下载基因序列的FASTA格式，再链接到蛋白质序列并将其下载。

3 分析方法

3.1 基因序列的基本信息

BioEdit软件能够分析核苷酸序列。在BioEdit软件中打开已保存好的cysA基因序列，选用Nucleotide Composition对基因的碱基分布进行分析。

3.2 蛋白质的基本性质

使用BioEdit分析基因序列后，继续打开已保存好的CysA蛋白序列。选用Amino Acid Composition对CysA蛋白的碱基百分比进行分析。

3.3 结构域预测

将CysA的序列提交到SMART网站来分析结构域。

3.4 亲疏性分析

（1）将CysA蛋白序列提交到ProtScale网站来预测该蛋白的亲疏性，标度尺选用Kyte Doolittle，其他参数保持默认值。

（2）SOSUI网站也可以预测该蛋白的跨膜结构，将CysA蛋白的序列提交到该网站上。

3.5 预测跨膜区域

将CysA蛋白的序列提交到TMHMM网站，来预测CysA蛋白是否有跨膜区域。

3.6 预测卷曲螺旋区域

首先打开COILS网页，将蛋白质序列粘贴到对话框，其他保持默认值不变，点击“Run Coils”，保存其结果。

3.7 信号肽分析

打开SignaIP网站，点击“Upload Fasta File”，将保存好的蛋白质序列上传，Organism group中选择Gram-negative，Output format中选择Long output，点击“submit”，保存其结果。

3.8 预测二级结构

（1）打开SOPMA网站，在对话框输入蛋白质序列，提交后保存其结果。

（2）打开Jpred 4网站，在对话框中输入蛋白质序列，点击Reset Form,保存其推测的结果。

3.9 三级结构预测

将CysA序列提交到SWISS-MODEL网站即可推测该蛋白质的三级结构。

3.10 亚细胞定位

CELLO网站可以预测CysA蛋白的亚细胞定位，在“organisms”一栏中选择“Gramnegative”, 再将CysA蛋白质的序列提交进行预测。

3.11 构建系统发生树

在系统发生树中，根据亲缘关系较近的并且已经被注释功能的蛋白质，来预测CysA蛋白的功能。将CysA蛋白序列提交到NCBI中的Blast，在结果页面中，选择15条序列并将其下载保存，命名为BD，再将之前保存好的CysA蛋白序列复制到BD文件中。将BD文件中的序列提交到MEGA软件中进行多序列比对，使用align by clustalW的比对方法，参数设置选择默认，最后将结果以MEGA形式保存下来命名为AF。接下来构建系统发生树，选用Construct/Test Neighbor-joinjing Tree的方法，在参数设置中，Test of Phylogeny使用常用的Bootstrap method 方法来对建树结果进行检验，在No.of Bootstrap Replications 选择500的步长检测。在Model/Method这一栏选用p-distance模型进行计算。在Gaps/Missing Data Treatment这一栏中选择Patial deletion对含有空位的列进行部分删除，删除程度即Ste Coverage Cutoff 设置成50%，将最终的建树结果保存下来。

4 分析结果

4.1 基因序列的基本信息

图4-1核酸序列碱基分布

注：绿色表示A碱基，蓝色表示C碱基，黑色表示G碱基，红色表示T碱基

从图4-1上面的文字我们可以看出DNA分子完整序列长度为1119个碱基对，一条DNA链的分子量为341785.00道尔顿。从图中可以得知各个碱基的数量，如表4-1。C+G含量占71.05%，A+T含量占28.95%，可知该核酸结构较稳定。

表4-1

核酸序列碱基分布表

4.2 蛋白质的基本性质

图4-2 氨基酸含量分布图

由图4-2的文字可知，CysA序列长度为372个氨基酸，分子量为40759.24道尔顿，下方的表4-2中显示了各氨基酸的数量及占比,具体数值如表，其中亮氨酸和丙氨酸占比最高，都达到12.10%，其它氨基酸的占比都较低，小于10%。

表4-2

蛋白质序列碱基分布表

4.3 结构域预测

图4-3蛋白质结构域

CysA蛋白在第27位氨基酸到第214位氨基酸之间存在一段AAA结构域。在AAA结构域中，有αβα核心域，在这里发现了P环NTPase的WalkerA与B基序。[18]该结构域的主要作用是使用ATP水解产生的能量，来将硫酸盐和硫代硫酸盐转运进入细菌。

4.4 亲疏水性分析

图4-4 CysA亲疏性分析

注：纵坐标表示的是氨基酸的亲疏性的值，正值表示蛋白质的疏水性，负值表示的是蛋白质的亲水性，正值越大，反映蛋白质疏水性越强，负值越大，反映蛋白质的亲水性越强；横坐标表示氨基酸的位点。

（1）使用ProtScale网站预测CysA蛋白亲疏性的结果如图4-4，结果显示CysA蛋白的第71位缬氨酸得分显示最低，说明该处的氨基酸亲水性是最强的，为-2.644；第149位精氨酸得分显示最高，说明该处的氨基酸疏水性是最强的，为2.111。由图4-4，CysA蛋白的亲水性区域略大于疏水性区域，认定CysA为亲水性蛋白。

（2）使用SOSUI网站预测的结果如图4-5。结果显示CysA蛋白为可溶性蛋白。

图4-5 CysA的亲水性分析

4.5 预测膜整合蛋白的跨膜区

TMHMM网站预测的结果如图4-6：

图4-6 CysA的跨膜性分析

注：红色表示的是跨膜结构，蓝色表示的是膜内结构，玫瑰红色表示的是膜外结构。

从图4-6中可以看出CysA蛋白没有跨膜结构，预测此蛋白是外周膜蛋白。

4.6 预测卷曲螺旋

从图4-7中可以看出CysA蛋白几乎不含有卷曲螺旋结构。卷曲螺旋是由2-7个a螺旋形成，常常用于形成二聚体。CysA蛋白不含卷曲螺旋说明该蛋白是由一条亚基组成。

图4-7 CysA 的卷曲螺旋预测

注：纵坐标显示了该蛋白含有卷曲螺旋结构的可能性，横坐标表示的是氨基酸序列的位点，14残基、21残基、28残基读长的可能性结果分别用绿色，紫色，红色的线来表示。

4.7 信号肽分析

图4-8 CysA 的信号肽分析

注：纵坐标表示该蛋白中含有信号肽的可能性，红色实线表示蛋白中含有由sec转运并且被信号肽酶丨切割的分泌信号肽，蓝色虚线该蛋白含有由sec转运并且能够让信号肽酶2切割的脂蛋白信号肽，紫色虚线表示该蛋白中含有由TAT转运并被信号肽酶丨切割的TAT信号肽，黄色虚线表示该蛋白质中不含信号肽

由图4-8可以看出，CysA蛋白中含有由sec转运并且被信号肽酶丨切割的分泌信号肽的概率为0.0031。该蛋白含有由sec转运并且能够让信号肽酶2切割的脂蛋白信号肽的概率为0.0057；该蛋白中含有由TAT转运并被信号肽酶丨切割的TAT信号肽的概率为0.0009，概率都非常低。所以可以推测出CysA蛋白中不含有任何信号肽，所以该蛋白不是分泌蛋白，与前面预测的蛋白定位相符合。

4.8 预测二级结构

（1）使用SOPMA网站预测结果如图4-9：

图4-9 CysA的二级结构

注：蓝色曲线代表无规则卷曲；绿色曲线代表β-转角；蓝色曲线代表α－螺旋；红色曲线代表延伸链区

根据图4-9，a螺旋的数量是最多的，其次无规则卷曲含量也很高。CysA蛋白含有的二级结构具体情况见下表4-3：

表4-3

CysA二级结构及其百分比

α螺旋，β折叠还有β转角可以提高蛋白质的稳定性，无规则卷曲可以用来连接其他二级结构，从图中可以看出α螺旋最多。

（2）使用Jpred4网站进行蛋白质二级结构的预测结果如图4-10：

注：绿色的箭头表示的是Beta折叠，而红色的管子则表示的是Alpha螺旋。其中，JNETCONF表示的是此次预测中的每个位点的可信度，值越高，反映该位置的预测出来的结果越可信；而JNETJURY一栏中的星号则表示的是采用不同途径预测，得到差异较大的结果，相应的该位置的可信度就越低。

4.9 三级结构预测

SWISS-MODEL网站对CysA蛋白建模，如图4-12：

图4-12CysA三级结构及二级结构分布

注：在Model-Template Alignment中，隐约可见的箭头表示的是beta折叠，直筒表示的是alpha螺旋。

由图4-12得到的QMEAN值，Local Quality Estimate图还有Comparison图都可知该结果是比较可靠的。

图4-13为CysA的三级结构：

图4-13 CysA 的三级结构

4.10 亚细胞定位

CELLO 网站预测的结果如表4-4：

表4-4

CysA 亚细胞定位分析

从表4-4中可以看出，该蛋白位于细胞外基质、外膜、细胞周质、内膜的概率极小，有很大可能位于细胞质中。

4.11 构建系统发生树

一般是利用统计概率的算法来构建系统发生树，树的节点上的值表示有百分之多少棵树含有这一节点。若构建好的树中，数值大部分都大于70%，表示构建的该树比较可信。我们可以看出，在其它青枯菌中找到了与青枯菌GMI1000 CysA蛋白亲缘关系最近的的转运蛋白，除此之外，青枯菌与蒲桃青枯菌和血液病原细菌亲缘关系很近，与危险罗尔斯通氏菌亲缘关系相对来说较远。

图4-14 CysA的系统发生树

5 讨论

青枯菌的CysA蛋白与CysP蛋白、CysT蛋白、CysW蛋白组成转运蛋白复合体，共同来完成硫酸盐和硫代硫酸盐的转运。CysA蛋白含有AAA结构域，该结构域主要功能是水解ATP获取能量来行使一定的功能，在其它研究中发现该结构域在蛋白复合物的组装中或许会起作用[19]，推测AAA结构域在转运蛋白复合体的组装中起到作用。分析结果显示CysA 为亲水性蛋白，并且不含跨膜结构，亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质，推测该蛋白位于细胞膜的胞质侧，与其它复合体亚基结合共同完成转运硫酸盐和硫代硫酸盐。

6 参考文献

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致谢

在山西师范大学的四年本科生活即将要结束，在这里，有很多美好的回忆，也结交了很多志趣相投的同学和朋友。同时也非常感谢老师、同学对我的热心帮助。

首先非常感谢老师的细心指导。之前没有学习过生物信息学方面的课程，对其完全不了解。从零基础到完成这篇文章的过程是艰辛而坎坷的，期间遇到了数不尽的问题。向老师请教时，他能够不厌其烦，耐心的为我解答，让我有了克服困难的勇气。可以说，没有老师的帮助，就没有我的成长以及这篇文章的完成。

其次，我还要感谢曾经给我上课的每一位老师，如：老师等等，他们真正的做到了教书育人，不仅认真给我们上好每一节课，也经常和我聊生活中的事情，教会我如何为人处事。我还要感谢我的同学，没有他们的无私帮助就没有我学业上的进步。

在此我还要感谢我的父母，他们对我的关爱和默默支持，让我面对困难时才能勇往直前。养育之恩无以为报，唯有学业事业有成，以慰藉心灵。

最后，我要感谢参加论文答辩会的各位老师，我会虚心接受建议并做出修改。往后的日子里，我会努力学习科学知识，提高内在素养。在生活上，我将会注重个人修养，乐于助人，团结同学，不断完善自己。

青枯菌CysA蛋白功能的生物信息学研究

价格 ¥9.90 发布时间 2023年4月28日

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