黄芩苷对热应激小鼠囊胚线粒体的分布及活性的影响

　摘要：目的：研究黄芩苷对热应激小鼠囊胚线粒体的分布及活性的影响。方法：取若干只小鼠2-cell，在不同的培养液中和不同的环境下把它培养成囊胚后，随机分为对照组、黄芩苷组、热应激组、黄芩苷热应激组、ERK1/2抑制组。经过MitoTracker®工作液染色、孵育、固定液滴固定、透膜液滴透膜、Hoechst 33342 复染、洗脱液洗涤、封片，最后在不同条件下通过扫描不同小鼠分组中囊胚细胞内线粒体的分布，利用统计分析软件分析线粒体的活性。结果：黄芩苷组与对照组相比，线粒体的数量较多，活性高，围绕细胞核排列的程度高；ERK1/2抑制组与对照组相比，线粒体的数量减少，并且活性降低，围绕细胞核排列不紧密在热应激条件下，黄芩苷热应激组较热应激组内的线粒体活性高，线粒体数量越多，围绕细胞核排列越紧密。结论：黄芩苷能提高热应激条件下小鼠囊胚线粒体的活性，减少热应激对线粒体造成的结构上和功能上的损伤。

　关键词：黄芩苷；线粒体；小鼠囊胚；热应激

　　引言

从受精卵开始，小鼠的早期胚胎开始发育，经过几次卵裂，最后发育成为胚胎。小鼠的囊胚是在桑葚胚形成后，在细胞间隙聚集了卵裂球分泌的液体，最后形成一个充满分泌液体的囊胚腔存在在胚胎的中央。随着囊胚腔的逐渐扩张，细胞的分化程度越来越明显，体积小并且分裂活跃的细胞聚集在外周，形成胚胎的外层，继而形成滋养层，大并且分裂慢的细胞聚集在内侧，称之为内细胞层，此时的胚胎叫做囊胚。

目前在热应激条件下抑制早期胚胎发育的机理还不是很清楚，研究表明可能是有两个方面，一方面是胚胎的抵抗热应激的能力有限，说明它的防御系统不够完善，如可能缺乏抵抗氧化应激的能力和保护正常组装蛋白质以及降解变性的蛋白质的能力，不能正常有效地修复或抵抗热应激对胚胎造成的损伤；另一方面是热应激本身可作为损伤因子来对细胞产生损伤效应，如破坏DNA分子的完整性、干扰细胞的有丝分裂、改变蛋白质的图谱、促进自由基的产生、诱导细胞的凋亡等等[1]。

在机体的每个细胞中都有线粒体，线粒体在细胞中的最大功能就是产生能量，供细胞生长和增殖。平均每个细胞中的线粒体的数量在200~2000个之间，数量越多，产生的能量就越多，数量越少，产生的能量就越少。在小鼠囊胚胚胎发育中，线粒体的能量越多，越能促进胚胎的发育，因为机体中大部分的能量都是由线粒体产生的。当然，胚胎中的不同的组织细胞中的线粒体的数量不同。有研究发现，热应激对线粒体的分布及活性会产生影响。用MitoTracker®染液使线粒体着色，然后放在电子显微镜下观察，可以观察到被染液染成红色的线粒体颗粒，此时的线粒体颗粒可观察到它的形态。目前，对线粒体的功能检测有很多种方法，可以检测线粒体生成ATP率，线粒体膜上的离子通道是否打开等[6]。

黄芩属于我国的传统中药，最早记载于东汉的《神农本草经》，有泻火清热、解毒、燥湿、安胎的功能。在临床上与其他中药配伍使用或者单独使用可用于治疗病毒性肺炎、呼吸道感染、过敏性疾病、急性菌痢、妇科性疾病等[2]。在近些年来的研究中发现黄芩中主要发挥功效的活性成分是黄酮类，目前为止已经发现了41种黄酮类的化合物，其中含量比较高并且药理作用比较明显的是黄芩苷、汉黄芩素、含黄芩苷、黄芩新素 I 、黄芩新素 Ⅱ [3]。目前黄芩苷对热应激小鼠囊胚线粒体的分布及活性的影响并不清楚。本试验选用小鼠囊胚为材料，分为对照组、黄芩苷组、热应激组、黄芩苷热应激组、ERK1/2抑制组，每组利用MitoTracker®染液使线粒体着色，多聚甲醛进行细胞固定，透膜，Hoechst 33342复染，复染是使细胞核酸荧光染色，最后洗涤、封片。利用激光共聚焦显微镜来观察被染色线粒体的分布，通过扫描选取处染色效果最佳的扫描出的图像。为探索黄芩苷对热应激状态下的小鼠囊胚线粒体的分布及活性的影响提供依据，也为提高体外培养胚胎发育能力做出贡献。

　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1试验动物

SPF级昆明系小白鼠

　1.1.2试验试剂

KSOM胚胎培养液、矿物油、M2胚胎培养液均购于Sigma公司；Hoechst33342、黄芩苷均购于北京索莱宝公司；PMSG激素和hCG激素均购于宁波第一激素厂；MitoTracker® Mitochondrion-Selective Probes购于Thermofisher公司；玻璃培养皿购于NEST公司；免洗载玻片购自碧云天生物技术公司；U0126购于MedChemExpress公司。

　1.1.3试剂仪器

371型CO2培养箱购于Thermo公司；透明加热板购于富士平公司；ALC-11002电子天平购于ACCULAB公司；超低温冰箱购于SANYO公司；凝胶成像系统购于UVP公司；SZX12型体视显微镜购于OLYMPUS公司；Airtech超净工作台购于苏州安泰空气技术有限公司；DGG-9140A型恒温鼓风干燥箱购于上海森信试验仪器有限公司；HVE-50高压灭菌锅购于MMM公司；微量移液器购于Eppendorf公司；公司磁力搅拌器。

　　1.2方法

　　1.2.1饲养试验动物

在试验开始前一周准备饲养小鼠，这些小鼠前提都是没有被细菌、病毒感染过的6周龄的SPF级昆明系的小白鼠，并且体重均在20~30g、均已达到性成熟的要求。把它们饲养在23℃、光照周期为12/12h环境中，让他们自己自由采食和饮水，保证试验是在动物福利的基础上在进行的，确保小鼠的健康。

　1.2.2配制试剂和培养液

PMSG和hCG的配制：先准备好被高压灭菌后的生理盐水，抽取10 mL的PMSG激素，将其和生理盐水一起抽打，直至完全溶解，最后再摇晃均匀。最后配成的浓度是0.1 ml/10 IU。再抽取1 ml配制好的溶液分装到1.5 ml的离心管中，注意一定要做好每管的标记，之后在-20℃环境下密封保存，在低温下保存时溶液容易被冻融，所以要避免这个液体被冻融的问题。hCG激素的配制和使用方法都与PMSG激素相同。

黄芩苷培养液的配制：需要4 mg的黄芩苷，用天平称好后倒入1 mL的DSOM中，摇晃震荡直至其完全溶解，这就把浓度为4 mg/mL的黄芩苷溶液配制完成。完成配制后再进行分装，把0.1 mL的黄芩苷溶液分装到0.6 mL的离心管中，注意把每个离心管做好标记后将其存放在4℃密封的环境中，如果要用的时候，把它先与KSOM培养液配制成浓度为4mL/4u的培养液再使用，方法是依照1：999的比例混合均匀。

U0126培养液的配制：要配制浓度是6 mM的U0126培养液，就是把购买好的U0126先分成0.1 mL的量，然后分装到0.6 mL的离心管中，注意在每管上做好标记。为了将U0126培养液保存备用，要把它放在-80℃的环境中保存，最重要的是避免培养液被冻融。通常是要先配制成30 μM的浓度时再使用，方法是和KSOM培养液按照1：199的比例混合均匀后就配制好了。

MitoTracker®储存液的配制：取一支冻干的MitoTracker®产品，将其离心后，再加入116 µL高质量的无水二甲基亚砜（DMSO），将其吹打混合均匀，最终获得的MitoTracker®储存液的终浓度为1 mM，准备若干1.5 mL离心管，将获得的MitoTracker®储存液分装到1.5 mL离心管中，在-20ºC的条件下注意避光密封保存。一般在试验正式开始之前，先准备若干90 mm培养皿，在培养皿中滴入9个液滴，每滴液滴100 μL。将含有5%CO2的CO2培养箱（100% RH）放置于37℃下，在取胚前4 h把滴好液滴后的培养皿放置于CO2培养箱预平衡。将制备好的MitoTracker®储存液与预平衡好的KSOM培养液依照1：1999的比例进行稀释，最终获得的MitoTracker®工作液的浓度为500 nM。MitoTracker®工作液是一种红色荧光染料，主要是用于对活细胞内线粒体进行染色，并且线粒体膜电位决定了MitoTracker®工作液的积累。当其被乙醛固定后，此染料可稳定保存。在此试验中，主要是用MitoTracker®工作液对小鼠囊胚细胞中的线粒体进行染色，利用显微镜进行观察被染色线粒体的分布及形态。

　　1.2.3胚胎的体外培养

在饲养小鼠一周后的下午三点的时候，给所有的小母鼠要注射PMSG激素，激素的剂量是10 IU/0.1 mL。到第三天，也就是过了48个小时之后，再给所有的小母鼠注射hCG激素，剂量也是10 IU/0.1 mL。此时是下午三点钟，再当天的下午六点钟要把注射了激素的小母鼠和小公鼠放在一个笼子里饲养，注意选取的小公鼠是9周龄，一起饲养一周，把现在的六点钟叫做胚胎发育起点。在这一周的时间里，要注意观察小鼠有没有发生交配行为，方法就是检栓。一般是在第二天的上午八点钟，把小母鼠从笼子里用镊子拿出来，抬起来它的尾巴，看它的阴道的地方。如果发生了交配，那么就会在阴道口的地方留下精液，并且精液已经发生了凝固，粘连在阴道口处，很容易观察到，颜色一般是白色或者黄色。用这个方法就可以检查小鼠有没有发生过交配。

取胚前要先做好培养皿，因为是进行胚胎的体外培养。首先把KSOM培养液分成5个35 μL的液滴备用，把分好的液滴滴在35mm的平皿上，再用矿物油进行覆盖，一般矿物油的剂量是2mL，这就把一个培养皿做好，之后就用于培养胚胎。胚胎培养的过程中还得需要清洗胚胎，那么就要配制清洗液，用M2培养液分为6个80 μL的液滴，然后滴在90 mm培养皿中，这样就配制成胚胎清洗液。提前4个小时把CO2培养箱预平衡，让它保持在37℃、5%CO2、100% RH的状态，为接下来的胚胎培养工作做准备。

挑选见栓的小母鼠，一般在胚胎发育到40个小时后，把小母鼠使用颈椎脱臼法处死，然后剖腹取出它的输卵管，把它全部的输卵管放到平衡好的M2液滴中，在显微镜的帮助下找到输卵管的壶腹部，用1 mL注射器的针头划破输卵管壶腹部，这样就可以冲出来2-cell胚胎。2-cell要进行冲洗，用干净的M2液滴冲洗5次后，再把它平均分为30个胚胎，之后每30个胚胎被转移到之前预平衡过的KSOM培养液的微滴中。要将胚胎发育至囊胚要经历94个小时，这个时期要把胚胎放到CO2培养箱中培养。等到胚胎发育到囊胚时，胚胎要被4%的多聚甲醛固定15min。胚胎固定好后再放到4℃的PBS中，为了保存备用，通常把囊胚按照每30个一组转移到1.5mL的离心管里，被存放在-80ºC的环境中。

　1.2.4试验分组

为了检测黄芩苷对热应激小鼠囊胚在基因和蛋白水平的变化，试验一共分为五组。

对照组：在37℃的环境下进行胚胎的体外培养，把胚胎放置在纯KSOM 培养液中直到它发育成囊胚。黄芩苷组：在37℃的环境下进行胚胎的体外培养，胚胎被放置到含有4μg / mL 黄芩苷的KSOM 培养液中培养，直到它发育成囊胚。ERK1/2抑制组：在37℃的环境下胚胎培养，是要把胚胎先放置纯KSOM 培养液中，等它发育到88h胚龄后再放到含有30μM U0126的KSOM培养液中，直到它发育成囊胚。热应激组：先把胚胎在37℃的环境下培养，将其放置在纯KSOM 培养液中直到它发育成91 h胚龄后，再把温度改变成42℃进行热应激，时间为1 h，热应激过后，再改成37℃，让胚胎进行恢复3 h。热应激黄芩苷组：先把胚胎在37℃的环境下培养，将其放置在含有4μg / mL 黄芩苷的KSOM培养液中直到它发育成91 h胚龄后，再把温度改变成42℃进行热应激，时间为1 h，热应激过后，再改成37℃，让胚胎进行恢复3 h。1.2.5线粒体与细胞核染色

胚胎进行孵育之前，要先把胚胎细胞里的线粒体进行染色，通常是用MitoTracker®工作液在35 mm平皿中做5个液滴，每个液滴35 μL。挑选每组里发育比较好的囊胚，保证囊胚是活的情况下每组挑选10个放置MitoTracker®工作液中染色。孵育是在CO2培养箱（100% RH）中进行15 min，培养箱的条件是37 ℃下含有5%的CO2，注意孵育时要避光。孵育完成后，要用预平衡的KSOM培养液清洗每个胚胎，至少要清洗三次。

固定胚胎要用1%的多聚甲醛液滴，在每组中取出胚胎后，配套被放到35mm培养皿的50 μL的多聚甲醛液滴中，培养皿中的多聚甲醛液滴滴数为5个，每个液滴中放入的胚胎数不能超过50个。在室温的环境中，将标记好的每组胚胎进行固定15 min。

透膜的目的是使细胞膜的通透性增高。透膜时要先把胚胎用玻璃吸胚针取出后放入35mm培养皿中的50 μL的透膜液滴中，平均每个培养皿中有5个透膜液滴。胚胎是按照分组取出透膜的，在室温的环境中，各组胚胎被进行透膜15 min。

复染的目的是使细胞核着色。各组胚胎被玻璃吸针取出后放到90 mm培养皿中的Hoechst 33342染液中，染液使提前稀释好的，并且每个培养皿中加入60 μL。在室温的环境中进行避光复染10min。

复染后的胚胎要进行清洗，至少要用清洗液清洗三次，为了使胚胎清洗得更干净，使用90 mm培养皿缓慢地摇晃清洗液和胚胎。

1.2.6封片

封片的目的是为了保存并且可以观察线粒体的分布及形态。在室温的环境中，提前在干净的免洗载玻片上标记好胚胎的数量、抗体的名称和试验的时间。做好准备工作后，在载玻片的中央滴上一滴1 μL左右的抗荧光淬灭剂，在液滴的周围点上四根羊绒脂的蜡柱。清洗好的胚胎放到抗荧光淬灭剂液滴中后，立即用干净的盖玻片轻轻地盖在载玻片上，再用少量的抗荧光淬灭剂滴在盖玻片的周围，是为了保护胚胎受到过大的压力。封好片后，把片子放到避光、温度为-20℃的环境中保存14天左右。在保存的时间里，可以利用激光共聚焦显微镜观察线粒体和细胞核，重复做三次试验得到每个指标，最后利用扫描来选取处染色效果最好的图像。

1.2.7分析数据

免疫荧光图片中的IOD SUM、AREA要用Image Pro Plus 6.0进行分析，要计算平均光密度，平均光密度是等于IOD SUM 与 AREA的比例。试验中所得的数据都要被SPSS13.0统计分析软件分析，数据被统计后，当P<0.05才有统计学意义。

2结果

　　2.1不同分组下小鼠囊胚线粒体的分布及活性

下图1结果显示：对照组中，可以在细胞质中见到大量的线粒体。线粒体都在细胞里，并且这些线粒体都围绕着细胞核排列。染色线粒体表现出的亮度高。

黄芩苷组与对照组做对比可发现，线粒体的数量比对照组的多，也都在细胞里，而且线粒体也均围绕着细胞核排列，不过比对照组的排列紧密，线粒体的活性也比对照组的高，亮度也比对照组的高。

热应激组与对照组相比，线粒体的数量明显减少，线粒体的位置发生了变化，大部分在细胞的外边，细胞核的数量较其他组也明显减少，线粒体排列在细胞核周围的紧密度较低，比较疏松；染色线粒体呈现出的亮度比对照组低很多。

黄芩苷热应激组与热应激组相比，线粒体的数量比热应激组线粒体的数量多，在细胞外的线粒体的数量比对照组的少，并且围绕细胞核排列比热应激组紧密，细胞核的数量较热应激组增多，染色线粒体呈现出的亮度比热应激组高。

ERK1/2抑制组与热应激组相比，线粒体的数量比热应激组线粒体的数量减少，一部分在细胞外，与细胞和排列不紧密。细胞核的数量减少。染色线粒体呈现出的亮度比热应激组高。

总体上分析，线粒体和细胞核的数量：黄芩苷组>对照组>ERK1/2抑制组>黄芩苷热应激组>热应激组。初步得到结论，在热应激条件下，热应激对线粒体的位置造成影响，并且对线粒体的正常功能造成影响。但黄芩苷能抵抗热应激对线粒体造成的位置变化，使线粒体维持正常的生理功能。

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图1黄芩苷对热应激小鼠囊胚线粒体分布及活性的影响

(1)：对照组 (2)：黄芩苷组 (3)：热应激组 (4)：ERK1/2抑制组 (5)：黄芩苷热应激组

2.2不同处理组小鼠囊胚线粒体活性变化

如下图2结果显示：不同处理组中小鼠囊胚线粒体活性最高的一组是黄芩苷组，其次是对照组、ERK1/2抑制组、黄芩苷热应激组，活性最低的一组是热应激组。可初步得到结论，在热应激条件下，小鼠囊胚线粒体的活性比正常时降低，说明线粒受到了损伤，但是在热应激黄芩苷组中说明，黄芩苷可提高小鼠囊胚线粒体的活性，抵抗热应激对线粒体造成的损伤。

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图2 不同处理组小鼠囊胚线粒体活性变化

：对照组 (2)：黄芩苷组 (3)：热应激组 (4)：ERK1/2抑制组 (5)：黄芩苷热应激组注：*：与对照组比较，差异显著（P<0.05）；**：与对照组比较，差异极显著（P<0.01），

#：与热应激组比较，差异显著（P<0.05）；##：与热应激组比较，差异显著（P<0.01）

3.讨论

之前的研究表示，黄芩苷具有多种药理作用，如抗肿瘤作用：主要时通过抑制肿瘤细胞的增殖来抑制肿瘤，并且当黄芩苷的浓度越大时，表现出的抗肿瘤作用越强；保护损伤后的肝的作用：黄芩苷通过升高血清内谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，并且使丙二醛的含量降低来进行保护肝组织；抗病原体作用：可抑制细菌性炎症，有研究发现，耐药性的金黄色葡萄球菌可引起机体炎症的发生，黄芩苷可抵抗金黄色葡萄球菌所引发的炎症作用；改善糖尿病肾病：血管紧张素是引起机体肾脏内部氧化应激和炎症反应的最有活性的因子，当出现糖尿病肾病时，使用黄芩苷治疗后可降低血管紧张素的活性，恢复肾功能，也有研究表明，黄芩苷降低血管紧张素后恢复肾功能时还可以通过改善血液内环境及循环功能、降低血压和肾小球的内压。除此之外，黄芩苷还具有也有清除羟自由基、烷自由基、超氧自由基的功能，在临床上用于治疗先兆流产、感染等疾病，有显著的安胎作用[4]，并且对人的正常组织细胞和造血细胞几乎没有损伤作用[5]。

线粒体在细胞中有很多功能。线粒体是细胞中脂肪、氨基酸和糖类最终的氧化释放能量的场所[6]。当DNA损伤时可做为压力信号，此压力信号可以用来激活线粒体的凋亡途径，这也是线粒体的另外一个功能，即参与启动细胞凋亡，通过实现线粒体的凋亡途径[4]。当线粒体上的跨膜电位下降时，线粒体会进一步释放储存的钙离子，从而导致DNA断裂，并且细胞内的钙离子浓度越来越高，之后引起线粒体的跨膜电位降低，还会影响机体的能量代谢过程，造成机体代谢紊乱，体内的脂质过多地氧化，导致能量平衡被破环，引起细胞凋亡[11]，不利于胚胎的发育。

　3.1应激条件对囊胚线粒体分布及活性的影响

通过线粒体上的转换孔开放来实现线粒体的通透性，当转换孔开放时的标志可以认为是线粒体肿胀的时候。由于转换孔的开放，线粒体的通透性转换次数增加，线粒体高度肿胀可激活促凋亡信号通路，并且导致细胞色素的释放[3]。当线粒体的通透性增加时，此时线粒体大量开放，导致线粒体的膜电位会随着丧失，并且还会导致内容物如细胞色素的释放，从而激活细胞凋亡的途径[7]。电子传递链复合体中包含Bcl-2和细胞色素C，且它们是重要组成成分，线粒体中的细胞色素有重要作用，尤其在细胞凋亡中发挥重要作用。在高钙的环境里能维持线粒体膜的功能发挥抵抗细胞凋亡功能的可能是位于线粒体外膜的Bcl-2，当细胞膜的通透性发生变化时，它可以发挥作用防止这种变化的发生[2]。

热应激条件所导致的胚胎细胞中各种细胞器数量、形态、位置的变化，不仅是胚胎细胞对抗热应激时的一种保护性反应，也是热应激损伤胚胎细胞中的细胞器的一种表现。热应激造成的胚胎损伤和胚胎自我保护之间的相互对抗决定了胚胎细胞的存亡[8]。对细胞内外环境在应激条件下最为敏感的细胞器之一就是线粒体，在此时的热应激环境下，线粒体内膜开启PTP，PTP是内膜上的渗透性转换孔。因为线粒体基质内呈现出高渗透压的状态，细胞内容物就无法进行选择性内流，所以导致线粒体基质内液体增多，基质发生肿胀。线粒体的渗透性转换孔的开启还可以导致线粒体内外环境中的氢离子梯度消失，继而导致呼吸链脱偶联，最终致使ATP合成道路受阻，ATP量减少，能量供应不足。当一些活性物质如细胞色素C、AIF在膜间隙中被释放出来时，表示线粒体的渗透性转换孔已经开放，这些活性物质均与细胞凋亡有关，当其被释放后，继而诱导细胞凋亡[11]。细胞凋亡率增高导致胚胎发育受阻。

3.2ERK1/2对线粒体分布及活性的抑制影响

ERK1/2属于细胞外调节蛋白激酶，本试验中用U0126培养液来抑制小鼠囊胚细胞中的ERK1/2的活性。ERK1/2一般在细胞浆里，当进行磷酸化作用的时候就可以激活ERK1/2，当它被激活后，就能穿过细胞核膜，穿过的时间很短，进入细胞核后就使转录因子被激活，进行基因的转录和翻译，合成细胞所需的蛋白质。ERK1/2被抑制后，就不能合成细胞所需的蛋白质，继而影响线粒体的功能，并且还会损伤线粒体的形态，使线粒体的活性降低[12]。由此可见，可以假设热应激是通过抑制ERK1/2而引起线粒体的损伤，影响胚胎的发育。

　3.3在应激条件下黄芩苷对囊胚线粒体分布及活性的影响

线粒体的质量好坏程度控制了机体组织的正常功能。通过线粒体生物合成、分裂、融合与自噬这四个相互联系的主要环节来实现线粒体的质量控制，并且线粒体的质量控制主要是依赖自噬性破坏与线粒体的生物合成间的平衡[4]。经多项研究发现，线粒体损伤可以减少细胞的活性，并且之前也有研究报道，口服黄芩苷可以减轻细胞线粒体的损伤和具有维持细胞线粒体结构完整的特性[6]。

有研究发现，黄芩苷可降低胚胎细胞中Hsp70基因的表达，在应激条件下，Hsp70基因超表达时可以助于细胞抵抗应激，适应应激环境[9]。但是也有研究表明，在Hsp70基因表达过多的情况下，会降低胚胎细胞对其他蛋白的表达，并且会不利于胚胎的发育。有实验结果说明，黄芩苷可提高小鼠体外培养胚胎发育的能力，主要是通过降低胚胎细胞的凋亡率和降低HSP基因的表达，并且促进DNA甲基化。黄芩苷在一定的浓度范围内，可以促进小鼠胚胎的HSP基因和Bcl-2在热应激条件下表达，降低Bax和Caspase-3的表达，减少热应激对线粒体造成的损伤，降低胚胎细胞的凋亡，起到保护胚胎发育的作用[10]。

　致谢

四年的大学学习生活将要画上一个句号，对于自己将要取面对新的征程。在毕业前要完成的毕业设计，历时将近两个多月的时间终于把这篇论文写完，在老师和同学的帮助下，我克服了在写论文过程中遇到的无数的困难和障碍。尤其是要感谢我的大的论文指导老师—xxx老师，她不仅在学业上给予我精神指导，而且对我进行了无私的帮助和指导，不厌其烦地给我的论文进行修改和改进。在此谨向xxxx老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。

在完成论文的过程中，感谢我的师姐师兄、同学和朋友给了我真诚的帮助，感谢培养我长大含辛茹苦的父母。还要感谢这篇论文中引用的研究文献的学者们，如果没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我将很难完成本篇论文的写作。

最后，再次向帮助过我的老师、同学、朋友和家人们表示衷心地感谢！

　参考文献

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