亲水作用色谱分析吡啶离子液体阳离子

　　离子液体是由离子组成的，在室温或接近室温下呈液态的盐类[1,2]。其中阳离子一般为对称性低的有机阳离子，阴离子一般为体积较小，对称性较好的无机弱配位阴离子或有机阴离子。根据离子液体阳离子的化学结构不同，离子液体可以分为咪唑类、吡啶类、季铵类和季鏻类等。与传统溶剂相比，离子液体具有很多独特的物理化学性质，如液程宽、不挥发、溶解能力强、不可燃、热容量大、离子导电率高、萃取能力好、相稳定性好、热稳定性好、水稳定性好、酸碱稳定性好等、绿色环保等特点[3-6]。因此，其已被广泛应用于分析化学[7-12]、环境科学[13]、有机合成[14]及电化学[15-17]等领域和成为诸多领域的研究热点。例如，在液相色谱中离子液体可作为流动相添加剂[18-21]和固定相[22-25]等。随着离子液体应用范围的不断扩大，势必会导致其流失到环境中。因此，越来越多研究者的关注离子液体会对环境造成的污染有多大、在自然界中的降解程度怎么样以及离子液体的生物毒性又如何等问题。目前一些文献[26,27]已报道离子液体具有生物毒性，并且随着离子液体阳离子烷基链长度的增加，其毒性也在增加。而且，离子液体的分解产物也可能具有严重的毒性。因此，环境中离子液体的检测工作已经变得非常重要。近年来，对咪唑类离子液体阳离子[28-30]、吡啶类离子液体阳离子[31,32]及吡咯烷类离子液体阳离子[33,34]的测定已多见报道，但对环境中离子液体阳离子分析的报道较少[42-44]。因此，研究离子液体的色谱分离检测，并将其与样品前处理技术相结合，从而解决环境中离子液体的分析问题有着重要的理论和实际价值。由于吡啶类离子液体是一类重要的离子液体并且应用广泛，其可能会流入环境之中。因此有必要开发一种分析环境水中吡啶类离子液体的方法，进而为研究吡啶类离子液体的环境影响和生物毒性等提供相应的参考。

　　分析离子液体的方法主要有四种，分别为反相高效液相色谱法、离子色谱法、离子对色谱法和亲水相互作用色谱法等。反相高效液相色谱优点在于拥有高分辨率、高选择性以及优越的分离重现性等特点，但对于一些强极性的化合物及其离子型化合物，反相色谱通常不能够提供较好的保留和分离选择性。而在离子色谱法中我们可以使用强酸性阳离子交换柱或弱酸性阳离子交换柱来分离测定离子液体阳离子，这种方法的优点在于对烷基侧链较长的离子液体阳离子的保留较强，而它的缺点在于易产生色谱峰拖尾[45]。由于吡啶类离子液体的极性较强，其在反相色谱中保留较差，需要加入离子对试剂增强保留。所以本研究采用了更简单的亲水相互作用色谱法[46]对吡啶离子液体阳离子进行分析。亲水作用色谱采用极性固定相结合的流动相，其中流动相在水中含有高浓度的有机溶剂(主要为乙腈,含量大于60%),为各种天然极性化合物和离子型化合物包括多肽、蛋白质、低聚糖、药物、代谢物和等的分离分析提供了一个很好的选择。作为一种新型的色谱分离手段,HILIC克服了正相色谱重现性差、流动相对强极性的化合物溶解性差和反相色谱在极性化合物分离过程中在成功分离中极性、弱酸性或碱性样品通常不能被充分保留的缺点,并且与此同时还能够能够提供与反相色谱迥乎不同的分离选择性。亲水相互作用色谱是近年来色谱领域的研究热点之一[47]。其能为强极性物质提供合适的保留并且具有流动相组成简单、无需添加离子对试剂等优势。它是通过采用强极性固定相结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现对强极性物质的分离测定。

　　由于离子液体应用范围的不断扩大，势必会导致其流失到环境中，因此迫切需要进行对离子液体的常规分析，要求其分析方法必须灵敏、专一性强。亲水作用色谱对离子液体有较好的保留，流动相与质谱兼容，可提高检测灵敏度，但质谱价格昂贵，测定费用较高，某种程度上限制对其的使用。与和HILIC-MS相比，HILIC-UV的准确度和灵敏度都比较低，但吡啶离子液体阳离子中有紫外吸收基团，在紫外区具有特征的吸收峰，并且紫外检测器作为常用的检测器具有稳定性好且维护成本低的特点，所以本研究采用常用的紫外检测器。

　　由于环境水样体系复杂，其会对目标物的分析检测产生影响，因此对环境水样的预处理尤为重要。固相萃取技术[48]多应用在样品的预处理方面，其主要用于样品的两个方面，分别是净化和富集。其用于干扰组分的分离以及被测组分的富集,从而分析检测提供了更为有效的分析结果。固相萃取技术操作简单，因此被广泛应用于医药、食品、环境等领域[49-53]。因此，本研究的样品预处理方法采用固相萃取技术。

　　本研究的目的是发展简单、快速的分析环境水中吡啶阳离子的样品前处理技术与分离检测方法，从而为环境水中吡啶类离子液体阳离子的检测提供一种有效方法，并为研究离子液体的生物毒性等提供相应的参考。基于此，我们开展了吡啶类离子液体阳离子的亲水相互作用色谱分离和紫外检测研究以及环境水中吡啶类离子液体阳离子的固相萃取研究，并建立了亲水相互作用色谱结合紫外检测分析吡啶离子液体阳离子的方法和环境水中吡啶离子液体阳离子的固相萃取方法。这为环境水中吡啶类离子液体阳离子的分析提供了一种有效方法。

　　离子液体：溴化N-辛基吡啶([OPy][Br])、溴化N-己基吡啶([HPy][Br])、N-丁基吡啶四氟硼酸盐([BPy][BF4])、N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐([MBPi][BF4])(纯度≥99%，上海成捷化学有限公司)。

　　己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、四乙基氯化铵（天津市光复精细化工研究所，色谱纯试剂）；乙酸铵（天津市光复科技发展有限公司，优级纯试剂）；甲醇、乙腈(色谱纯，Dikma Technologies公司)；用电阻率18.2 MΩcm的超纯水配制溶液。

　　ASE-24固相萃取装置，配有AP-9950型无油真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，配有SPD-20A紫外检测器、LC-20AT流动相输液泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A色谱柱温箱和Labsolutions工作站；PHSF-3F型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；Simplicity纯水系统(XMillipore公司)；UF-C18固相萃取柱(250 mg/6 mL，大连中谱科技有限公司)；0.22μm滤膜；其他仪器均符合色谱分析要求。

　　TSK-GEL Amide-80 HR色谱柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5μm,硅胶为基体,氨基甲酰基为功能基团);流动相为3.0 mmol/L N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐(水/乙腈,40/60,v/v);紫外检测波长215 nm;流速1.0 mL/min;色谱柱温度35°C;进样体积20μL。

　　由于在亲水相互作用色谱中，常用乙腈作为流动相中的有机组分，因此本研究选择乙腈作为流动相中的有机组分。选定乙腈作为流动相的有机组分后，本研究考察了不同乙腈含量(50%,60%,70%;v/v)对测定吡啶阳离子的影响。结果表明，保留时间随乙腈含量的增加而先缩短后增长，当乙腈含量为60%时，保留时间最短。这是因为，在亲水相互作用色谱中，保留模型分为三个阶段。例如：在这篇文献[41]中，作者采用亲水相互作用色谱法分析咪唑离子液体阳离子。第一阶段：当乙腈含量为40%–95%时，其保留规律符合亲水相互作用色谱的特点，即随水含量增加，保留时间缩短；第二阶段：当乙腈含量为20%–40%时，其保留时间几乎不变。第三阶段：当乙腈含量小于20%时，其保留行为符合反相色谱的保留特点，即随有机溶剂含量增加，保留时间缩短。所以，在亲水相互作用色谱中，保留时间会随乙腈含量的增加而先缩短后增长。考虑到保留时间的因素，最终选择60%作为适合的乙腈含量。

　　亲水作用色谱常用的流动相添加剂是铵盐[40,41]。在以前的研究中我们也尝试过以离子液体作为亲水作用色谱的流动相添加剂且效果较好[34]。因此，本研究考察了铵盐和哌啶类离子液体以及季铵类离子液体作为流动相添加剂时对测定吡啶阳离子的影响。以1.0 mmol/L的N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐、四乙基氯化铵和乙酸铵（水/乙腈：40/60）为流动相测定吡啶阳离子的结果见图2。结果表明，三种流动相添加剂均可有效地缩短保留时间并改善峰形。但以N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐为流动相时，吡啶阳离子的峰高最高且峰形最好。由此可见，哌啶类离子液体是一种更好的流动相添加剂，其可以明显地缩短保留时间并有效地改善峰形。因此选择N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐作为适合的流动相添加剂，并继续考察N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐浓度对测定吡啶阳离子的影响。

　　图2 a,N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐;b,四乙基氯化铵;c,乙酸铵;d,未添加流动相添加剂.色谱条件:流动相为1.0 mmol/L流动相添加剂(水/乙腈,40/60,v/v);紫外检测波长220 nm;其它色谱条件同2.3部分.色谱峰:1,[OPy]+;2,[HPy]+;3,[BPy]+(每种阳离子的浓度均为50 mg/L).

　　本研究考察了N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐浓度为1.5,2.0,2.5和3.0 mmol/L时，对测定吡啶阳离子的影响（见图3）。结果表明，随N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐浓度的增加，吡啶阳离子的保留时间逐渐缩短且峰形变好。根据文献[21]，其原因可能是离子液体阳离子与固定相间存在极性相互作用，因而，哌啶阳离子与吡啶阳离子在固定相上存在着竞争。所以，随着N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐浓度的增加，哌啶阳离子的竞争能力增强，即淋洗能力增强，从而使吡啶阳离子的保留时间缩短。当N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐浓度为3.0 mmol/L时，三种吡啶阳离子可在10 min内完成分离检测。因此选择3.0 mmol/L作为适合的浓度

　　图3 a,1.5 mmol/L;b,2.0 mmol/L;c,2.5 mmol/L;d,3.0 mmol/L.色谱条件:流动相为N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐(水/乙腈,40/60,v/v);其它色谱条件和色谱峰标记同图2.

　　本研究在常用的吡啶阳离子的紫外检测波长（220nm）附近考察了检测波长（200,205,210,215,220,225,230,240,250,260,270,280nm）对测定的影响，结果见表1。结果表明，当检测波长为215nm时，基线噪音值最小，峰高较高，检出限最低。因此，本研究选择215 nm作为适合的检测波长。

　　表1检测波长与基线噪音值、峰高和检出限的关系

　　Wavelength

　　(nm)Value of baseline noise

　　(μV)Peak height

　　(μV)The detection limit

　　(S/N=3,mg/L)

　　[OPy]+[HPy]+[BPy]+[OPy]+[HPy]+[BPy]+

　　200 4.67 123642 67474 19466 0.006 0.010 0.036

　　205 4.74 118036 64366 19830 0.006 0.011 0.036

　　210 3.14 102755 54421 16809 0.005 0.009 0.028

　　215 2.22 119346 63801 19702 0.003 0.005 0.017

　　220 3.10 92872 43033 10500 0.005 0.011 0.044

　　225 5.34 42611 22112 5617 0.019 0.036 0.143

　　230 2.85 15429 7862 1943 0.028 0.054 0.220

　　240 2.56 26901 14730 4582 0.014 0.026 0.084

　　250 3.45 82725 46271 15028 0.006 0.011 0.034

　　260 2.66 110469 63226 22876 0.004 0.006 0.017

　　270 4.43 41513 24532 9116 0.016 0.027 0.073

　　280 4.61 1189 731 275 0.582 0.946 2.515

　　同系物的保留因子与碳原子数之间存在着碳数规律[53]：lg k=a nC+b(k为保留因子，nC为同系物的碳原子数)。本研究将最佳色谱条件（见2.3部分）下所得的三种吡啶阳离子([OPy]+,[HPy]+,[BPy]+)的保留因子与其侧链的碳原子数作图，所得的线性方程为lg k=－0.109nC+0.7314，r=0.9981。由方程可知，lg k和nC之间呈现良好的线性关系。这说明在此条件下，吡啶阳离子在亲水相互作用色谱柱上的保留规律符合碳数规律。

　　通过以上研究，选择的最佳色谱条件为：TSK-GEL Amide-80 HR色谱柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5μm);流动相为3.0 mmol/L N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐(水/乙腈,40/60,v/v);紫外检测波长215 nm;流速1.0 mL/min;色谱柱温度35°C。在此条件下分析三种吡啶阳离子，色谱图见图4。

　　图4在最佳色谱条件下获得的色谱图

　　图4 a,N-辛基吡啶阳离子标准溶液;b,N-己基吡啶阳离子标准溶液;c,N-丁基吡啶阳离子标准溶液;d,三种吡啶阳离子标准混合溶液.色谱条件同2.3部分.色谱峰标记同图2.

　　在最佳色谱条件下，对三种吡啶阳离子的标准溶液进行测定。采用峰面积定量，以峰面积(积分值)对离子质量浓度(mg/L)求得线性回归方程；以3倍信噪比计算检出限(噪音值为2.22μV)；以10倍信噪比计算定量限；连续7次重复测定[OPy]+(50 mg/L)、[HPy]+(50 mg/L)和[BPy]+(50 mg/L)标准溶液，计算保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSDt/RSDs)。所得的检出限、线性和重现性等数据见表2。结果表明，本方法的重现性、线性等均能满足定量分析要求。

　　表2线性回归方程、检出限、定量限及保留时间和峰面积的相对标准偏差

　　Ion

　　Linear regression equation

　　y=area

　　x=concentration,mg/L Correlation coefficient

　　(r)Limit of detection

　　(mg/L,S/N=3)

　　Limit of quantitation

　　(mg/L,S/N=10)Linear range

　　(mg/L)RSDt/RSDs

　　(%,n=7)

　　[OPy]+y=26774x–535.6 0.9993 0.003 0.010 1–100 0.381/0.302

　　[HPy]+y=30739x–10695 0.9995 0.005 0.017 1–100 0.358/0.161

　　[BPy]+y=30906x–29319 0.9992 0.017 0.057 1–100 0.332/0.343

　　本研究建立了亲水相互作用色谱-紫外检测分析吡啶离子液体阳离子的方法。本研究采用以氨基甲酰基为功能基团的亲水作用色谱柱为分析柱，以3.0 mmol/L N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐(水/乙腈,40/60,v/v)为流动相，采用紫外检测器实现了吡啶离子液体阳离子的分离与检测。哌啶离子液体作为流动相添加剂，明显地改善了吡啶阳离子的分离和检测。吡啶阳离子在亲水色谱柱上的保留行为符合亲水相互作用色谱的特点，并且其保留规律符合碳数规律。