牦牛腹泻的病原学诊断

　摘要：腹泻病是牦牛最常见的一种疾病，是影响犊牛成活率的重要因素。2021年11月份四川省甘孜州稻城县某牧民家的(2-3)月龄犊牦牛发现泻肚为主症的疾病，传染疾速，为查明病因，我们采集了11份犊牦牛的腹泻粪便，用Trizol法提取腹泻粪便的总RNA，RNA反转录成cDNA，用牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异的PCR方法进行检测。结果测出牛轮状病毒核酸阳性样本为8份，BCoV与BVDV均为阴性。以临床症状结合流行情况，确诊该牧民家犊牦牛腹泻主要由牛轮状病毒(BRV)感染引起的。

　关键词：牦牛泻肚；牛轮状病毒；牛冠状病毒；牛病毒性腹泻病毒；PCR

1.前言

牦牛(Yak Rotavirus)是我国高原藏区特产畜种，也是“世界屋脊”著名的景观牛种。它主要分布于青藏高原及其毗邻的高山、亚高山地区，中国牦牛占世界总数的95%[1]。一般牦牛全身呈黑褐色，体侧两边和胸、腹、尾毛密而长，四肢粗短。它能经受零下30℃至40℃的严寒天气，并可以在海拔3500米至5500米的高寒地区生长繁衍。牦牛在遗传上是一个极为宝贵的基因库[2]，它作为高原地区牧民的经济支柱，是牧民们重要生产、生活资料，直接关系着藏区牧业的增产、增收问题[3]。它的健康养殖更是成为了青藏高原地区养殖业大力发展的主要因素[4]。

犊牛腹泻是犊牛常发的一种胃肠疾病，其临床特征为：病犊牛常出现精神萎靡，食欲废绝，体温上升，呼吸短促，脱水及腹泻等症状。临床上引发犊牛腹泻的病因非常复杂，包括感染性、非感染性的因素，非感染性因素主要有饲喂不当、护理不当或饲养环境恶劣等饲养管理方面的因素；感染性因素主要有病毒、细菌及寄生虫等的感染。其中病毒是造成犊牛腹泻最主要的病因之一，牛轮状病毒(BRV,Bovine rotavirus)、牛冠状病毒(BCoV,Bovine coronavirus)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV,Bovine viral diarrhea virus)是临床上最常见的导致犊牛腹泻的病毒[5]，其流行病学、临床症状和病理变化非常相似，仅凭临床诊断无法鉴别，而且这三种病毒混合感染的情况也很常见[6-8]，需要进行实验室检测才能进行确诊[9]。BCoV是导致新生犊牛泻肚、成年牛冬天泻肚以及呼吸道疾病的重要病原。一般7日龄内感染的多为犊牛，一至两周内常发生腹泻，主要症状表现为稀水样性腹泻，极大影响了犊牛的生长性能；在寒冷冬日里成年牛最常发生水样性腹泻，发病率高、死亡率低[10]。患畜若感染了冠状病毒，则在病症痊愈后540天内仍会以粪便为传染物向外界环境排放病毒[11]。BCoV流行于全球范围，因此，养牛行业常常遭受不同程度的经济的损失[12]；BCoV是由牛病毒性腹泻病病毒感染而导致的一种临床类型多且复杂的疾病，临床上主要以体温升高、口腔黏膜等部位糜烂溃疡、拉稀、持续性感染、免疫耐受与抑制、妊娠母畜流产、畸形胎或产死胎为主要特点的一种接触性传染病。自20世纪80年代以来，在我国牦牛群中陆续发现了BVDV,病死率在30%左右，血清阳性率在30%~42.4%之间，一直严重危害着我国牦牛群的成活率[13]；RV感染可引起多种幼畜和婴儿的急性胃肠道传染病，临床上主要以呕吐、腹泻和脱水为主要特征，BRV是世界公认的引起犊牛急性腹泻的主要病原之一，临床上传播迅速，并在世界范围内流行，给全球畜牧养殖业带来了巨大危害[14-15]。据报道显示在许多国家BRV的阳性率均很高，在英国阳性率为91.18%；在巴西阳性率为88%；在阿根廷阳性率为62.5%；在加拿大魁北克地区阳性率为74.3%[16-17]。1980年在福建的牧医所研究证明了BRV存在于我国的牛群中[18]，在2010年，李鑫对我国BRV流行病学大规模的研究调查时发现，BRV感染在我国牛群中也很常见，发现大部分地区BRV的阳性检出率高达80%以上，而且呈现长期重复发生的状态[19]。BRV不仅是引起犊牛腹泻的主要病原之一，而且也是引起犊牦牛腹泻的重要病原。1985年张敏等，从阿坝州瓦切牧场的牦牛腹泻粪便样品中检测并分离出了BRV[20]，最早证实了BRV存在于牦牛体内。2016年周芳，等在高原藏牧区进行了牛轮状病毒流行病学的调查,发现牛轮状病毒在四川、西藏、青海和云南的犊牦牛腹泻样本中的感染率分别为85.19％、60％、95％和90％[21]，说明了BRV严重危害着我国高原地区牦牛的健康生活，同时也影响着牧民们牦牛养殖的经济产业，严重阻碍着世界各地养牛业的迅速发展[22-23]。因此，加强对病毒性腹泻的及时监测和防治是一项不可疏忽的重要任务。

2021年11月份甘孜州稻城县某牧民家爆发犊牦牛腹泻，本研究采用PCR方法对牛腹泻样本进行检测，结果报告如下。

　2.材料与方法

　　2.1样本采集

腹泻粪便棉拭子11份，2021年11月份采自甘孜州稻城县某牧民家2-3月龄的犊牦牛，低温运输至实验室于-80℃冰箱保存。该牧场共有犊牦牛28头，患病犊牦牛11头，出现精神萎靡、呼吸急促、体温升高，食欲废绝和腹泻等症状，粪便呈灰绿色水样。

　2.2主要试剂及仪器

　2.3核酸提取与cDNA的合成

　　2.3.1 RNA提取

将11份腹泻粪便棉拭子与适量的PBS涡旋混匀，反复冻融3次，置于4℃离心机中10000 rpm离心10 min，取上清，按照Trizol试剂盒(RNAiso Plus)说明书进行RNA提取，步骤如下：

①取400µl上清液至1.5 ml EP管中，再加入750µl冰预冷的Trizol。

②将样品剧烈震荡混合，在冰上静置10-15min。

③再加入200µl氯仿剧烈震荡混合，使液体充分混匀呈乳白色状态，冰上静置5min，置于4℃离心机中12000

rpm离心15min。

④将上层次相转移到新的1.5ml EP管中，加入500µl等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min，置于4℃离心机中12000 rpm离心15min，小心的出去全部上清液。

⑤用1ml 75%DEPC冰乙醇洗涤沉淀和管壁，置于4℃离心机中12000 rpm离心15min。⑥将RNA沉淀干燥，用15µl DEPC水溶解后，将其保存于-80℃备用。

　2.4.2 cDNA合成

采用10μl体系：5×buffer 4μL，Random primer 2μL,Prime Script RNase 1µl，ddH2O 9µl，RNA 4µl；

反转录条件为：37℃15min，85℃15s,16℃1min，合成cDNA于-20℃保存备用。

　2.4 PCR检测BRV

采用2.4合成的3对引物对11份犊牦牛腹泻样本的cDNA模板进行PCR扩增，均采用25μL的反应体系见表3，反应条件见4—6。

　3.结果

电泳结果显示：通过实验对11份犊牦牛腹泻粪便棉拭子样本中BRV、BCoV、BVDV的PCR检测，见图1~图3。图1中有8份样本扩增得到BRV特异性条带，片段大小约为231 bp；BCoV与BVDV仅有阳性对照扩增出条带，8份样本中均未见特异条带，结果见图2、图3。

　　M:DNA MarkerⅡ;N:阴性对照；P：阳性对照；1~11：被检样本BRV扩增产物；

M:DNA Marker II;N:negative control;P:positive control;1~11:BRV amplification product of

the sample to be tested;

图1 BRV的PCR产物的电泳结果

　　Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of BRV

M：DNA Marker II；N：阴性对照；P：阳性对照；1~11：被检样本BCoV扩增产物

M:DNA Marker II;N:negative control;P:positive control;1~11:sample to be tested BCoV amplification product

图2 BCoV的PCR产物的电泳结果

　　Fig.2 Electrophoresis results of PCR products of BCoV

M：DNA Marker II；P：阳性对照；1~11：被检样本BVDV扩增产物

M:DNA Marker II;P:positive control;1~11:BVDV amplification product of the sample to be tested

图3 BVDV的PCR产物的电泳结果

Fig.3 Electrophoresis results of PCR products of BVDV

使用RT-PCR方法，11份临床犊牦牛腹泻样本中，BRV的阳性检出率为72.7%(8/11)，BCoV与BVDV均未检出。结合临床症状及流行情况，确诊该牧场犊牦牛腹泻主要由牛轮状病毒(BRV)感染引起的。

4.讨论

试验检测结果中的犊牦牛腹泻样本只检出了BRV，检出率达72.7%，BCoV与BVDV均未检出，再与临床症状进行结合分析后，可确诊此牧场犊牦牛腹泻主要是由BRV引起的，为该牧场牦牛腹泻的防治提供了科学依据。研究显示，牛轮状病毒病在我国流行十分严重，2014年何美琳，等为调查川西北牦牛腹泻病的流行情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对来源于川西北阿坝州8个县的1070份牦牛血清中进行了BVDV、BCoV、BRV的抗体检测,其中BRV抗体阳性率达到94.4%[27]；2016年周芳，等对四川阿坝州14个牧场的88份犊牦牛腹泻样本用特异的PCR方法进行了BRV的检测，结果显示BRV核酸阳性检出率为98.86%[28]；2017年李凡，等用PCR方法对30份牛腹泻样本和30份牦牛腹泻样本的进行BRV的检测,其中对牛的BRV检出率为33.33%,对牦牛的BRV检出率为73.33%[29]；2018年泽旺塔，等对四川若尔盖县牦牛轮状病毒感染情况使用ELISA技术对276份牦牛血清BRV、BCoV抗体进行检测，结果显示：BRV阳性率为99.2%。BRV感染呈全球广泛分布，在许多国家BRV的阳性率均很高，在阿根廷阳性率为62.5%在加拿大(魁北克地区)阳性率为74.3%；在巴西阳性率为88%；在英国阳性率为91.18%。2010年Swiatek D L，等在澳大利亚维多利亚州Gippsland地区的三个不同的农场，从小牛中总共收集了100个粪便样本，发现轮状病毒阳性样本感染率为38.5％。这些数据共同说明了BRV在世界各地的牛和牦牛群中分布广泛。BRV在严重危害着世界各地的养牛业的发展和牧民的经济产业。

BRV是引起犊牛腹泻的最重要的病原，可感染各个年龄段的牛，且多发于1月龄以内的犊牛，在全世界尤其是发展中国家犊牛中具有重大的发病率和死亡率[32]。以为稀水样腹泻为临床特征，排出物里偶尔会含杂有血和黏液，严重的会持续脱水后死亡，若为继发性感染，死亡率会迅速上升；该病四季均可发生，尤其在气候多变季节初春及夏末秋初时最易频发，危害病犊牦牛，临床表现为体温升高，食欲减退，急性腹泻，粪便呈灰绿色水样。部分病畜粪便中带血，并有许多气泡和肠粘膜等，是造成犊牦牛生长发育不良和死亡的最重要的疾病之一，给畜牧业发展和牧民养牛业造成了巨大的经济损失[33]。此外，BRV常常成为诱发、并发或继发其他一些腹泻性疾病的病因，在临床上出现混合感染情况很严重[34-36]，对人类健康和畜牧业发展都有较大危害，具有重要的公共卫生学意义。因此，加强牛轮状病毒病的防治至关重要。

患牛的治疗：一是为患畜进行输液纠正休克与肌体酸中毒的症状，同时补充能量和维生素；二是可用广谱抗生素、磺胺类药物和抗微生物制剂等，能预防继发感染。三是喂服吸附剂与保护剂可起到肠胃调节作用。四是若发现感染BRV的病犊牛，则必须马上清理消杀圈舍卫生。

BRV的预防：一是防重于治，一经发现就要将病畜犊立即隔离，以防传染给其他安全健康的犊牛；二是发现病死或死因不明的犊牛，必须按安全规定进行无害化的处理，对污染的畜舍及周围环境严格进行消杀处置；三是犊牛哺乳前，母牛的两对乳头及时消毒清干，不能让病毒通过母乳传播给了小犊牛；四是初乳营养含量高且丰富，犊牛出生后，要及时给吃母牛的初乳，以确保犊牛获得初乳中丰富的营养物质；五是奶嘴、毛巾壶、桶、等犊牛哺乳用具要严格开水煮沸消毒；六是做好环境卫生的保障，勤换牧地、勤迁帐篷、维持环境干燥、卫生，清洁排除积粪和杂物，搞好消毒工作；七是加强妊娠母牛和犊牛的饲养管理。

　参考文献

[1]高文武,达久.甘孜州牦牛产业发展现状及对策[J].中国畜牧兽医文摘,2018,34(01):42.

[2]钟金城,赵素君,陈智华,et al.牦牛品种的遗传多样性及其分类研究[J].中国农业科学,2006,39(2):389-397.

[3]王康,滕建旭.青康牦牛价值再认识[J].西南民族大学学报(人文社科版),2003,24(4):147-148.

[4]钟金城,陈智华,赵素君,etal.牦牛生态类型的分类[J].生态学报,2006,26(7).

[5]张坤.新疆北疆地区规模化奶牛场犊牛病毒性腹泻相关病原的调查研究[D].石河子大学,2016.

[6]李然,汤承,岳华.一起奶牛腹泻病的病原学诊断[J].四川畜牧兽医,2019(2):28-30.

[7]马吉云.一起牦牛病毒性腹泻病原学诊断[J].中国畜禽种业,2017(9).

[8]李凡,阿继,严州,et al.一起犊牦牛腹泻病的病原学诊断[J].四川畜牧兽医,2017(2):29-31,共3页.[9]马吉云.一起牦牛病毒性腹泻病原学诊断[J].中国畜禽种业,2017(9).

[10]张莹钰,张迎春,王青青,et al.新疆南疆牛冠状病毒BCV-Aks-01株分离及基因型鉴定[J].中国兽医杂志,2018,v.54(02):2+14-16+20.

[11]Madin S H,York C J,Mckercher D G.Isolation of the Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus[J].Science,1956,124(3225):721-722.

[12]CLARK MA.Bovine coronavirus[J].Br Vet J,1993,149(1):51-70.

[13]刘亚刚,殷中琼,刘世贵,et al.牦牛病毒性腹泻/粘膜病的防制研究[J].中国预防兽医学报,2003,25(6):487-490.

[14]Badaracco A,Garaicoechea L,Rodríguez D,et al.Bovine rotavirus strains circulating in beef and dairy herds in Argentina from 2004 to 2010.[J].Veterinary Microbiology,2012,158(3-4):0-0.

[15]Minamifukuda F,Nagai M,Takai H,et al.Detection of Bovine Group A Rotavirus Using Rapid Antigen Detection Kits,RT-PCR and Next-Generation DNA Sequencing[J].Journal of Veterinary Medical Science,2013,75(12):1651-1655.

[16]Martin M Nyaga,Mathew D Esona,Khuzwayo，C Jere,et al.Genetic diversity of rotavirus genomesegment6(encodingVP6)inPretoria,SouthAfrica[J].SpringerPlus,2014,3:179-183.

[17]Brito W M E D D,Munford V,Villaça AM,et al.Characterization of mixed infections withdifferent strains of bovine rotavirus in an outbreak of diarrhea in dairy herds in Goiás,Brazil[J].Braz.j.microbiol,2000,31(2):140-145.

　致谢

本文的立题、撰写和修改均得到了指导老师的倾心指导、多次反复修正和细致辅导，谨此表示衷心感谢。感谢指导老师在论文写作时提出的修改意见和建议。导师严谨、精益求精的工作作风，深深感染和激励我。在此谨向指导老师致以诚挚的感谢和崇高的谢意。经过几个月来广泛地搜集资料，参考大量文献，归纳整理写出了该篇论文。在论文写作的过程中，深感自己学识肤浅，在分析问题与提出解决问题时不免有疏漏与不当之处，恳请老师的批评指正。在此我还要感谢学院的诸多老师，他们在传道授业的过程中，让我奠定了良好的理论功底。不但给了我学业上的指导，而且也给了我生活上的启发，这会使我终身受益。

牦牛腹泻的病原学诊断

价格 ¥9.90 发布时间 2024年2月8日

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