中文摘要
目的：断血流具有止血、抗菌、降血糖、抗氧化、抗炎等药理作用，临床上主要应用于各种出血症。共价有机骨架材料(covalent organic frameworks,COFs)具有良好的孔隙率、高比表面积、规整的孔道结构和易于功能化等特点。旨在利用COFs材料对断血流提取物进行吸附，为材料负载断血流提取物的表征、药理作用及药物递送等方面奠定基础。
方法：用对苯二胺（Pde）与间苯二甲醛（Is）合成一种亚胺基共价有机骨架材料PdIs。采用·DPPH清除能力体外抗氧化模型对不同浓度的断血流提取物溶液的抗氧化活性进行评价，通过吸附性能测试比较不同pH、吸附时间及浓度下共价有机骨架材料PdIs对断血流提取物吸附率的差异，来研究共价有机骨架材料PdIs对断血流提取物的吸附性能。结果：通过·DPPH清除能力体外抗氧化模型结果得知断血流提取物溶液随浓度的增大而增强，通过吸附性能测试结果得知pH为5、吸附时间为100 min及浓度为600 mg/mL时共价有机骨架材料PdIs对断血流提取物的吸附效果最佳。结论：共价有机骨架材料PdIs对断血流提取物具有一定的吸附作用，但还需进一步研究PdIs负载断血流提取物的表征、药理作用及药物递送方法，PdIs为一种合成简便、空隙规整的亚胺基共价有机骨架材料，在水处理、药物递送等方面具有潜在的前景。
关键词：共价有机骨架；断血流；吸附；抗氧化
对苯二胺COF材料制备及在断血流提取物中的基础应用研究
前言
断血流为多年生草本唇形科植物灯笼草Clinopodium polycephalum(Va niot)C.Y.Wu et Hsuan或风轮菜Clinopodium.chinense(Benth.)O.Kuntze的干燥地上部分，主要起到止血的效果，临床上主要用于治疗妇科出血等症状 [1]。断血流作为安徽省“十大皖药”建设项目之一，其气微香，味涩、微苦[2]。断血流主要有止血[3]、收缩心血管[4]、降血糖[5]、抗炎抑菌[6]、收缩子宫[7]、抗氧化[8]等药理作用。目前已报道的断血流药用植物中含有三萜及其皂苷、黄酮、挥发油、苯丙素、甾体等多种成分，其中皂苷和黄酮为断血流的主要活性成分 [9]。断血流具有十分明显的临床治疗效果，但其药理学研究一般多为粗提取物的体外药理学研究，缺乏药物作用机制的研究。
共价有机骨架材料是通过结构稳定的共价键链接结构不同的有机单体的一种有机的多孔材料。这种类型的材料拥有密度较小、质量较轻、物理化学性质比较稳定、孔隙率较高、比表面积大、结构整齐且孔道结构可以调节，在各个领域都具有着广泛的应用潜力。COFs材料是通过有序的多孔网络而组成的，具有较大的孔径面积和较高的比表面积，适合负载各种医药分子；COFs的硼酸酯键、亚胺键、双硫键等共价键在正常生理条件下可以稳定存在，但在低pH、高浓度谷胱甘肽等环境变化的刺激下，可以实现响应性释放；与金属有机框架材料(MOFs)相比，COFs材料具有更好的热稳定性和化学稳定性，同时COFs中金属离子的缺乏降低了自身的细胞毒性，生物相容性好，这是COFs作为药物递送系统的自身特点[10,11]。因为COFs材料的多孔道结构、高比表面积以及低细胞毒性，很多以COFs材料为基础的药物递送系统具有高载药量和药物泄漏量小的优点[12,13]。同传统吸附剂相比，COFs的孔隙大小和形状、表面化学官能团的种类和数量可以进行设计和调控，因此能够更好地适应各种药物分子的空间和化学性质。
在药物吸附方面，COFs材料已经被应用于口服避孕药、水溶性药物、抗抑郁药等多种药物的吸附释放等领域。具体而言，COFs可以通过物理吸附、氢键作用、范德华力等方式吸附药物分子，并具有可控的释放性能。
以对苯二胺(Pde)与间苯二甲醛(Is)为基本单元，设计合成一种亚胺基共价有机骨架材料PdIs，对断血流提取物进行吸附，为其在药物递送、作为药物载体及药物作用机制研究方面潜在的应用前景提供基础，为断血流提取物的药物作用机制研究也打下了地基。
1实验部分
1.1主要试剂与仪器
共价有机骨架材料PdIs的合成、断血流提取物的·DPPH清除能力体外抗氧化模型实验及吸附性能实验所使用化学试剂与实验仪器见下表1和表2：
表1实验化学试剂
1.2实验方法
1.2.1 PdIs的合成
按照对苯二胺（Pde）与间苯二甲醛（Is）按照摩尔比为1：1精密称取Pde 500 mg，Is 619.68 mg。将称量好的Pde倒入50 mL二颈烧瓶中，安装好搅拌桨，用氮气保护并加入20 mL二甲基亚砜（无水溶剂级），启动搅拌，待Pde溶解后加入Is，Is全部溶解后进行超声处理5 min。随后，在上述混合物中缓慢加入2 mL 17.5 mol/L的乙酸溶液，继续超声处理20 min，超声结束后进行抽滤，得黄色固体，用四氢呋喃、无水甲醇冲洗三次，50℃真空干燥7 h以上，取出后用研钵研磨，得PdIs粉末（见图2）。PdIs合成反应方程式如图1所示：
图1 PdIs的合成过程
图2 PdIs
1.2.2·DPPH清除能力体外抗氧化模型
精密称取20 mg DPPH，用无水乙醇溶解，多次洗涤并转移至50 mL棕色容量瓶中，定容摇匀，配制为0.4 mg/mL DPPH乙醇溶液。于20 mL比色管中配制不同浓度的断血流提取物溶液，分别精密量取每一浓度断血流提取物溶液2 mL加入4 mL棕色离心管中，再加入2 mL DPPH乙醇溶液，充分摇匀后置于室温（25℃）下避光反应1 h，在517 nm波长处测量各样品吸光度Ai;以2 mL水与2 mL DPPH乙醇溶液混合测得空白DPPH吸光度Aj；以2 mL不同浓度样品溶液与2 mL乙醇溶液混合测得样品空白吸光度A0；以2 mL水与2 mL无水乙醇混合作为样品本底对紫外可见分光光度计校零，计算DPPH清除率。
1.2.3 PdIs吸附断血流提取物
精密量取断血流提取物200 mg，用水溶解，多次洗涤并转移至100 mL容量瓶中，定容摇匀。于50 mL比色管中配制不同浓度的断血流提取物溶液，并控制pH范围。分别精密称取PdIs 25 mg，倒入150 mL锥形瓶中，并加入调节pH的断血流提取物溶液，以水（调节pH后）为空白对照。将锥形瓶置于水浴恒温振荡器中反应一定时间，结束后以0.22μm微孔滤膜滤过，用紫外可见分光光度计于最大波长处测量吸光度，计算吸附量Qe。分别对pH、吸附时间及断血流提取物浓度进行单因素实验操作。
PdIs对断血流提取物吸附量的计算公式如下：
2结果与讨论
2.1断血流提取物标准曲线的制作
制作标准曲线：精密称取断血流提取物200 mg，用水溶解、多次洗涤并转移至100 mL容量瓶中，定容摇匀。依次从该溶液中精密移取1，2，3，4，5，6 mL分别至6个20 mL比色管中，用水定容。可以得到溶度梯度的断血流提取物溶液：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL。
取任一稀释浓度溶液，利用紫外可见风光光度计测试断血流提取物溶液于190~700 nm范围内的吸光度，可得到断血流提取物的最大吸收波长，在此波长下测试所有浓度的断血流提取物溶液吸光度（用水校零）。经实验测得当波长为276 nm时吸光度最大。然后在276 nm处分别测不同浓度梯度的断血流提取物溶液吸光度。图为断血流提取物溶液的浓度与吸光度值之间线性关系曲线，该曲线拟合得到的标准曲线方程为:
图3断血流提取物标准曲线
2.2·DPPH清除能力体外抗氧化模型
精密称取断血流提取物200 mg，用水溶解、多次洗涤并转移至100 mL容量瓶中，定容摇匀，分别精密移取1，2，3，4，5，6 mL该溶液于20 mL比色管中，用水定容。精密称取DPPH 20 mg，用乙醇溶解、多次洗涤并转移至50 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容，现配现用。分别精密移取2 mL 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL断血流提取物溶液至4 mL棕色离心管中，再加入2 mL DPPH乙醇溶液，充分摇匀后在室温（25℃）下避光反应1 h，结束后于517 nm处测得样品吸光度Ai；分别将2 mL水与2 mL DPPH乙醇溶液加入离心管中，测得空白DPPH的吸光度为Aj；分别将2 mL 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL断血流提取物溶液与2 mL DPPH乙醇溶液加入离心管中，测得空白样品的吸光度A0；将2 mL水与2 mL无水乙醇加入离心管中，作为样品本底进行校零，计算清除率公式如下：
图4不同浓度断血流提取物对DPPH消除率的影响
Fig 4 Effect of different concentration of CLINOPODII HERBA extract on DPPH elimination rate
DPPH是一种非常稳定的以氮原子为中心的自由基，主要是因为产生共振稳定作用的3个苯环之间的空间障碍，使中间的氮原子上的不成对电子不能发挥它原本的电子成对作用[14]。DPPH是一种广泛用于评估抗氧化活性的自由基，在空气中会迅速地褪色。由于其容易获取和使用，DPPH被广泛用于食物、天然产物、化妆品等物质的抗氧化活性评估。
在抗氧化活性评估中，DPPH解决液的颜色是紫色的，但它会在存在抗氧化剂的情况下发生变化。当抗氧化剂与DPPH相互作用时，DPPH的自由基会中和，这导致DPPH的溶液从紫色变为淡黄色。用吸光度计可以确定解决方案的吸收度，从而确定抗氧化活性。结果表明：随着断血流提取物浓度的增加，断血流提取物对DPPH的清除率也呈上升趋势，证明断血流提取物具有一定的体外抗氧化能力，样品浓度越高，与DPPH自由基接触的可能性越大，因此样品对DPPH的消除率随浓度的变化而变化。
2.3 PdIs吸附断血流提取物单因素实验
单因素实验是指在同一实验中其他因素都确定，通过改变某单一因素进行实验设计。利用单因素实验可以PdIs对断血流提取物的最佳吸附条件。
2.3.1 pH对PdIs吸附断血流提取物的影响
精密称取断血流提取物200 mg，用水溶解并于100 mL容量瓶中定容，摇匀。精密移取10 mL该溶液于1~5号50 mL比色管中，分别调节pH至4，5，6，7，8（pH±0.05），定容摇匀，水作空白对照。精密称取6份25 mg PdIs倒入0~5号150 mL锥形瓶中，加入不同pH 400 mg/L断血流提取物溶液，0号为空白对照。将锥形瓶置于恒温水浴振荡器中25℃振荡2 h，用0.22μm微孔滤膜滤过，于276 nm处测量吸光度，0号锥形瓶为PdIs空白吸光度。进行三次平行实验，计算吸附量Qe取平均值。
图5不同pH对PdIs吸附断血流提取物的影响
Fig 5 Effect of different pH on PdIs adsorbed CLINOPODII HERBA extract
不同的吸附条件对材料吸附性能通常有着不同的影响。通常来说，溶液的pH不单单会影响提取物中有效成分的溶解度，也会影响吸附材料表面的电荷，从而影响吸附能力[15]。结果表明：pH=5时，PdIs对断血流提取物溶液的吸附量达到最大，再增大pH则PdIs对断血流提取物的吸附能力逐渐下降，可能是因为PdIs中亚胺键对断血流提取物中有效成分的静电吸引力于pH为5时达到最大，为其他pH时，溶液中的离子与断血流提取物争夺与PdIs结合的活性位点。
2.3.2吸附时间对PdIs吸附断血流提取物的影响
精密称取断血流提取物200 mg，用水溶解并于100 mL容量瓶中定容，摇匀。精密移取该溶液10 mL于1~6号50 mL比色管中，调节pH为5（pH±0.05），定容摇匀，水（pH=5）作空白对照。精密称取7份25 mg PdIs倒入0~6号150 mL锥形瓶中，加入pH=5 400 mg/L断血流提取物溶液，0号为空白对照。将锥形瓶置于恒温水浴振荡器中25℃分别振荡20，40，60，80，100，120 min，用0.22μm微孔滤膜滤过，于276 nm处测量吸光度，在不同时间取0号锥形瓶溶液滤过测得PdIs空白吸光度。进行三次平行实验，计算吸附量Qe取平均值。
图6不同吸附时间对PdIs吸附断血流提取物的影响
Fig 6 Effect of different adsorption time on PdIs adsorbed CLINOPODII HERBA extract
吸附时间对吸附量也具有显著的影响。结果表明：随着吸附时间的增加，PdIs对断血流提取物的吸附能力增强，在吸附时间为100 min时达到峰值，继续随时间的增加PdIs对断血流提取物的吸附能力降低。随着吸附时间的增加，断血流提取物与PdIs上的结合位点接触机会也不断增加，所以吸附时间为40~100 min时，PdIs对断血流提取物的吸附能力呈上升趋势，吸附时间越长，PdIs上的活性位点越少，PdIs对断血流提取物的吸附量增长越缓慢；吸附时间继续增加，则已结合在PdIs活性位点上的断血流提取物可能发生解吸附，从PdIs上脱去，吸附能力降低。
3.2.3溶液浓度对PdIs吸附断血流提取物的影响
精密称取断血流提取物200 mg，用水溶解并于100 mL容量瓶中定容，摇匀。分别精密移取该溶液2.5，5，7.4，10，12.5，15 mL于1~6号50 mL比色管中，调节pH为5（pH±0.05），定容摇匀，水（pH=5）作空白对照。精密称取7份25 mg PdIs倒入0~6号150 mL锥形瓶中，加入pH=5 0的不同浓度断血流提取物溶液，0号为空白对照。将锥形瓶置于恒温水浴振荡器中25℃振荡100 min，用0.22μm微孔滤膜滤过，于276 nm处测量吸光度，0号锥形瓶为PdIs空白吸光度。进行三次平行实验，计算吸附量Qe取平均值。
图7不同溶液浓度对PdIs吸附断血流提取物的影响
Fig 7 Effect of different solution concentration on PdIs adsorbed CLINOPODII HERBA extract
结果表明：随溶液浓度的增大，PdIs对断血流提取物的吸附能力增强，但溶液浓度为100~400 mg/L时，PdIs对断血流提取物的吸附能力快速增强，400~600 mg/L时PdIs对断血流提取物的吸附能力增强速度放缓。这是由于溶液浓度增加时，吸附剂表面与吸附溶液之间的浓度差越大，传质动力越大，对断血流提取物的吸附量增加。但随着溶液浓度的进一步增加，吸附剂表面的活性位点被占据，吸附速率也随之逐渐减缓。
3结论
以有机化合物对苯二胺(PdIs)与间苯二甲醛(Is)为基本单元，合成一种具有药物吸附性能的共价有机骨架材料PdIs,并且通过吸附性能测试实验可以得知，在pH为5，吸附时间为100 min，断血流提取物初始浓度为600 mg/L时，PdIs对断血流提取物的吸附量最高可达219.33 mg/g。断血流提取物具有一定的抗氧化活性，并且具有浓度依赖性，即断血流提取物溶液浓度越高，其体外抗氧化能力越强。设计的共价有机骨架材料PdIs合成简便，具有规整的空隙，是一种良好的中药提取物吸附剂，在药物递送及药物作用机制研究方面具有潜在的应用前景。但本实验只针对PdIs对断血流提取物吸附性能进行研究，后续可对PdIs进行修饰改性，增加其活性位点，进一步提高其吸附性能与吸附选择性；继续对负载药物后PdIs的表征及药理作用进行研究。
1、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“文章版权申述”（推荐），也可以打举报电话：18735597641(电话支持时间：9:00-18:30)。
2、网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。
3、本站所有内容均由合作方或网友投稿，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务。
原创文章，作者：1158，如若转载，请注明出处：https://www.447766.cn/chachong/203587.html,
