变价金属离子催化儿茶素的氧化产物及颜色分析

摘要：茶叶中，儿茶素是多酚的重要成分之一，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血压和血糖、降血脂以及清除自由基、增强人体免疫力等多种保健功效，其氧化产物的生物活性日益得到了许多人们的关注。儿茶素在被氧化过程中受到多种因素的影响，如温度、金属离子等。本实验制备表儿茶素（EC）与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）混合溶液，加入一定量的CuSO4·5H2O氧化3小时，利用高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱串联质谱法（LC-MS）及分光测色仪测定儿茶素在变价金属离子铜离子（Cu2+）影响下的氧化成分以及氧化后的颜色。本文利用分析化学理论，进一步分析了铜离子对儿茶素氧化的影响。结果表明，室温（25℃）时儿茶素氧化程度较低，而铜离子作为氧化剂，可以氧化儿茶素，铜离子本身被还原，并在氧化儿茶素的过程中析出，氧化产物主要为质荷比m/z为715.0132的茶黄素物质及质荷比m/z为911.0453的EGCG自氧化产物。对样品每30分钟进行测色，3小时内，a与b皆为正值，L为负值，即随着氧化程度的加深，样品颜色趋向红黄色，色度变暗。

　关键词：儿茶素；EGCG；氧化产物；分析

　一、引言

茶叶中，茶多酚是含量丰富且极为重要的多元酚混合物，相关的结构、性质等受到了人们的广泛重视，许多研究围绕其代谢及生物活性展开。茶多酚具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、降血压和血糖、降血脂以及清除自由基、增强人体免疫力等多种保健功效[1]。

茶多酚(Teapolyphenols)亦有“茶鞣质”、“茶单宁”之称，其在茶鲜叶中一般所占的含量为干重的百分之十八到百分之三十六之间。茶多酚的主要成分有儿茶素类（黄烷醇类）、黄酮及黄酮醇类、花青素类、酚酸和缩酚酸类等。其中，儿茶素类所占含量最多，大约占据茶叶干重的12%~24%[2]。

茶叶中的儿茶素(Catechins)是2-苯基苯并吡喃的衍生物，可分为以表儿茶素(Epicatechin，EC)，表没食子儿茶素(Epigallocatechin，EGC)为例的非酯型儿茶素，以及以表儿茶素没食子酸酯(Epicatechingallate，ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechingallate，EGCG)为例的酯型儿茶素[3]，其中，EGCG含量最为丰富，约占儿茶素总量的50%～80%[4]。

由于结构中存在酚性羟基，尤其是B环上的catechol（3,4-二羟基）和pyrogallol（3,4,5-三羟基）酚羟基，所以儿茶素非常容易氧化聚合，易被鲜叶中多酚氧化酶（Polyphenol oloxidase，PPO）催化氧化，也会发生氧化聚合缩合，形成有色物质[5]。茶叶中的儿茶素类氧化产物主要包括茶黄素(Theaflavins，TFs)，茶红素(Thearubigins，TRs)，茶褐素(Theabrownine，TB)[6]。茶黄素类化合物是具有苯骈卓酚酮结构的一类化合物的总称，具有特定的空间构象，主要有茶黄素(TF1)、茶黄素-3-单没食子酸酯(TF2a)、茶黄素-3′-单没食子酸酯(TF2b)和茶黄素-3,3′-双没食子酸酯(TF3)四种[7]，分别由EC和EGC、EC和EGCG、EGC和EGC、EGC和EGCG偶联形成[8]。茶红素是一种异质的酸性酚性色素，分子量主要在700-4000之间，且分子质量差异非常大。而茶褐素为一类水溶性非透析高聚合的褐色物质，是分子量极大、结构多样的高聚物，由儿茶素和儿茶素聚合物发生氧化缩合等反应形成[9]。

而根据催化剂的不同，儿茶素的氧化可以分为酶促氧化与化学氧化。酶促氧化是利用茶叶本身的多酚氧化酶（PPO）以及过氧化物酶（POD）的氧化性质，将儿茶素类氧化成醌类，而后再氧化缩合形成更复杂的产物，如茶黄素、茶红素和茶褐素[10]。而化学氧化主要是利用变价金属离子催化儿茶素氧化。相较于提取纯化难度大、稳定性弱的酶，化学氧化的控制难度更低，受氧气制约性更小，简化了反应体系。同时，依据氧化时的条件不同，可以被分为酸性氧化（pH<7）和碱性氧化(pH>7)。李大祥等对茶多酚进行酸性实验时得到较多酯型茶黄素；而Roberts则在1958年的儿茶素碱性氧化模拟实验中研究发现，其氧化产物含有与酶促氧化相同的茶黄素类物质[11]。

儿茶素被氧化过程中受到多种因素的影响。以表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）为例，依据其结构，B环上3’、4’和5’位点上分别有一个酚羟基，并且在C环上酯连一个没食子基团，这种结构使得EGCG易受到氧化[12]。同时，EGCG氧化时伴随颜色从无色透明转变为棕色，并不断加深的过程。在温度及氧化时间一定的条件下，当pH超过5时，EGCG的氧化产物降低；在其余条件适宜时，氧化的环境温度处于20℃~40℃较为合适，超过一定范围后，环境温度越高，氧化产物越少[13]。除此以外，EGCG的氧化还受到变价浓度、金属离子等影响。其中，变价金属离子，如铜离子和铁离子，可使EGCG氧化进程加快，并且可与中间产物过氧化氢发生芬顿反应（Fenton Reaction），生成氧化活性最强的羟自由基[14]。

重金属元素铜是人体必需的第三大微量矿质元素，在动植物体中主要以二价铜（Cu2+）形式存在，起着非常重要的作用。二价铜离子具有一定氧化性，能作为氧化剂参与氧化还原反应。在动植物体中，铜还可以作为酶辅基，许多含铜酶还参与电子传递和氧化还原反应[15]。儿茶素氧化后的化学成分十分复杂，许多反应条件对其反应的影响仍有待于深入研究。本实验选取EC及EGCG作为实验样本，加入铜离子参与氧化，一定时间后分别观察其颜色，同时结合高效液相色谱法（HPLC）[16,17]、超高效液相色谱串联质谱法（LC-MS）[18-21]进行分析，探究加入金属离子后的氧化成分，以获得更多关于儿茶素结构和活性方面的信息。

二、实验材料与方法

　　2.1实验所用标准品

(-)-表儿茶素（EC）、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、茶黄素-3-没食子酸酯（Theaflavin-3-gallate）、茶黄素-3’-没食子酸酯（Theaflavin-3’-gallate）、茶黄素-3，3’-双没食子酸酯（Theaflavin-3，3’-digallate）、纯度均＞98%，均购买自上海源叶生物科技有限公司。

　2.2实验主要试剂

色谱试剂：甲醇、乙腈（色谱级，XTedia公司）；甲醇、乙腈和甲酸水（质谱级，XThermo Fisher Scientific公司）。

其他常规试剂药品，如硫酸铜（CuSO4·5H2O）等，均是按照具体实验要求购买的分析纯。

2.3实验主要仪器

ML204万分之一电子天平，XMETTLER TOLEDD公司：IKA®A11 basic分析研磨机，德国IKA集团；IKA Lab Dancer涡旋振荡器，德国IKA集团；EYELA一千一百转旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社；TG16-WS台式高速离心机，中国湖南省湘仪实验仪器研制公司；Agilent 1260高效液相色谱、1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪（制备）、Infinity 1290 UPLC-G6545四极杆-飞行时间质谱/6460三重四极杆质谱，XAgilent科技公司；移液枪、容量瓶、5 mL离心管、恒温水浴锅、超声波清洗器、冷冻干燥机，中国力晨科技公司、计时器、热水壶、注射器、0.45µm水相滤膜、0.22µm有机相滤膜。

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2.4实验方法

　　2.4.1儿茶素氧化产物的制备

利用铜离子进行样品的制备：分别用电子天平称取表儿茶素(EC)174mg、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)274.8mg，转移至250mL玻璃烧杯中，用纯水(100mL)完全浸泡，在室温(25℃)下进行溶解。

再在烧杯中加入249mgCuSO4·5H2O反应液(n=3)，在空气流通良好的室温（25℃）下，将烧杯放置在磁力搅拌器上进行反应。每30分钟取样，即得到反应0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min后共七组样品，然后用四倍体积的甲醇提取反应产物，8000rps下离心10分钟，得到待测样品。

　2.4.2儿茶素氧化产物的测定

（1）将样品溶液通过0.22µm Millipore过滤，进行多酚定量分析和LC-MS进行质谱分析。

（2）液相分析条件：使用AgilentTC-C18(4.6×250mm，5µm)色谱柱，加PhenomenexC18（10×4.6mm，5μm）保护柱，流动相A相50mM的KH2PO4（色谱级）-三乙胺水溶液（pH=7.55），B相为乙腈；检测波长为278nm，柱温35℃，进样量为3μL，流速为0.25mL/mim，液相洗脱梯度如下：0min~5min，2%B；2.5min~3min，2%~5%B；3min~8min，5%~15%B；8min~14min，15%~30%B；14min~16min，30%~50%B；16min~18min，50%~2%B；18~22min，2%B。

（3）台式分光光度计检测方法

使用CS-90台式分光测色仪。将样品置于样品仓内，每个样品测量两次。其中L值代表样品溶液的明度，a值代表颜色从深绿色（负值）到亮红色（正值），b值代表颜色从深蓝色（负值）到黄色（正值），Cab表示色彩饱和度，表示色彩空间中心消色差灰轴所覆盖的距离，色相角(hab值)反映色彩的色度或色调，范围为0*(红度)-90*(黄度)-180*(绿度)-270*(蓝度)-360*(红度)，计算公式如下：

Cab=（a2+b2）1/2

hab=arcsin(b/a)

（4）LC-Q-TOF-MS分析方法

液相条件：使用AgilentInfinity1290UPLC-G6545Q-TOF/MS（四极杆飞行时间质谱）；WatersAcquityUPLCShieldRP18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)色谱柱，柱温40℃，流速0.25mL/min，检测波长278nm，进样体积为3μL。超高效液相色谱中流动相A相为0.1%甲酸水，B相为乙腈。超高效液相色谱的洗脱梯度为：0min~5min，2%B;2.5min~3min，2%~5%B;3min~8min，5%~15%B;8min~14min，15%~30%B;14min~16min，30%~50%B;16min~18min，50%~2%B;18~22min，2%B。

质谱条件:干燥气温度320°C，干燥气流速8L/min，鞘气温度350°C，鞘气流速11L/min，电喷雾离子源，毛细管电压3500V，喷嘴电压500V，锥孔电压75V，毛细管出口电压185V。鞘气、辅气、碰撞气均为高纯氮气。在负离子模式下采集质谱数据，一级离子扫描范围：m/z100-1500；二级离子扫描范围：m/z50-1000。

　三、实验结果与分析

　　3.1对茶样儿茶素的含量变化的测定结果与分析

在纯水条件下，将液相得到的各个峰面积数据，根据混标的出峰时间和标准曲线进行换算，EC与EGCG含量见图1：

fd095e51adc47ada2871a0a76fdaf9a6 　　由图1可见，在该条件下，表儿茶素(EC)与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的含量随时间变化不明显。其中，EC与EGCG的含量在进行反应的第30分钟至120分钟有轻微的减少，可能是两者在有氧条件下发生氧化以及EGCG自氧化。同时，儿茶素及其氧化产物具有一定抗氧化性和一定的清除自由基能力，因此发生氧化的程度并不高。

而在纯水中加入硫酸铜溶液后，将液相得到的各个峰面积数据，根据混标的出峰时间和标准曲线进行换算，EC与EGCG含量见图2：

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　3.2对儿茶素及氧化产物的分析

加入硫酸铜溶液后进行氧化得到的产物，颜色逐渐变为红黄色。将所有样品混合后进行LC-MS检测，从该图谱（图3）中可以看出，样品中峰十分复杂。有质荷比m/z为715.0132的茶黄素物质，EC和EGCG在变价金属离子的氧化下形成了茶黄素（Theaflavin1，TF1）；有质荷比m/z为911.0453的物质，为EGCG自身的氧化产物。EGCG的分子量为MW=458，其形成的二聚体Theasinensins A/D=914，经过进一步脱氢之后的Theasinensins A/D变成了Dehydrotheasinensins。由此可以发现，在变价金属离子的氧化下，除了EGCG和EC可以形成的茶黄素TF1、EGCG自氧化物部分和未被完全氧化的儿茶素部分之外，还有很多其他的氧化聚合物。该样品的质谱图十分明显地表现出，铜离子参与氧化的儿茶素氧化产物相当复杂。其中，茶黄素、EGCG自氧化物相较于其他产物，含量较多。近年来，有越来越多的研究人员开始注重分析儿茶素的氧化产物，并开展了不同条件的儿茶素催化氧化的实验，推动了人们对儿茶素类氧化产物的认识的深入。

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在纯水体系与在纯水中加入硫酸铜溶液的体系中，选取12份样品，观察所得不同氧化时间的儿茶素样品颜色见图4：

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由图4可知，在氧化的三小时内，没有变价金属离子铜离子参与的纯水体系的样品，颜色没有发生肉眼可见的变化，即几乎未发生氧化，生成茶黄素等物质。而加入CuSO4后的体系中，儿茶素样品溶液的颜色明显发生改变，由浅黄色逐渐变为红黄色，且时间越长，颜色越深，样品溶液越浑浊。这证明儿茶素氧化程度越深，氧化生成的茶黄素、茶红素越多，其他氧化产物同时增多。

利用CS-90台式分光测色仪对加入铜离子的样品进行测色，所得结果见图5：

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　四、实验结论

儿茶素在氧化过程中，生成许多复杂的氧化产物，其中包括水溶性色素，同时影响着所呈现出来的颜色。实验分析发现，纯水体系中，在室温（25℃）下氧化3小时，儿茶素氧化程度较低。加入CuSO4·5H2O后，变价金属离子铜离子可以作为氧化剂，氧化表儿茶素（EC）与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），铜离子本身被还原，并在氧化儿茶素的过程中析出。

利用高效液相色谱及质谱进行进一步分析，氧化产物主要为质荷比m/z为715.0132的茶黄素物质及质荷比m/z为911.0453的EGCG自氧化产物，还有其他复杂的氧化产物。

利用分光测色仪对氧化后的儿茶素溶液每30min进行测色，3小时内，a与b皆为正值，L为负值，即随着氧化程度的加深，样品颜色趋向红黄色，色度变暗。

　　致谢

2019年从南门第一次进学校的时候，路边上的梧桐叶开始黄了没有，我已经记不清了。四年的时间竟然可以流逝得这么快，回想起来，大多记忆只剩下了模糊的影子。

过去的那些许多重复的日子分明是平静的，但常常在现在的某一刻令我和我的朋友们相视一笑。深刻的、让自己窘迫的画面是最想忘记的，偏偏被反复提起，在熄灯的宿舍里，成为永不苍白的话题。

这就是我四年的生活，平凡的、有许多人参与其中的平凡的生活。平凡的快乐，平凡的痛苦，平凡的愤怒，以及平凡的冷静。可是直至此刻，只留下平凡的幸福。或者说，平凡本身，便是极大的幸福。

我很感谢学校、感谢遇到的老师们。每一位独一无二的老师，都能给予我独一无二的思考与认知。我尤其感谢我的论文指导老师：张梁老师。张梁老师的博学，总能让我受益匪浅。也是他的耐心教导，为我指明方向，帮助我完善实验与论文，顺利地走到现在。同时，我非常感谢遇到的连丽师姐和其他许许多多的师兄师姐，是他们包容了我，提点了我，将路上不引人注意的小碎石指给我看，也是他们在我行走的路上因为生疏而快要跌倒时，轻轻拉我一把。另外，我还要感谢辅导员张宪林老师，他的辛苦，我们大家都看在眼里。

最后，我最感谢的是我的父母。因为他们，我才能够拥有无限的勇气。他们永远站在我的身后，在任何时刻，都能让我无畏。

最后，感谢所有参加论文答辩的老师，感谢你们的宝贵意见！

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