枣乌头酸酶的活性测定

　摘要

本次毕业设计，以枣和酸枣中的细胞浆的乌头酸酶的测定为出发点，分别对枣和酸枣的乌头酸酶的活性进行了测量和分析，并进行了比较，认为乌头酸酶的活性与枣和酸枣的质量有关。顺乌头酸酶属于铁硫蛋白，它的身体里有一个[Fe.S.)，可以将柠檬酸转化，经过三羧酸循环，最终形成异柠檬酸钠。ACO将柠檬酸转化为异柠檬酸，异柠檬酸上的氧化脱羧作用使得NADH的吸收峰在240 nm处得到了明显的增强。通过对上述结果的分析，得出了本文的主要结论。

本课题组前期研究表明，在我国红枣生产上存在着一类具有一定代表性的“过渡类型”，这种“过渡类型”的“过渡类型”在红枣向柠檬酸的转变过程中发挥着关键作用。在此基础上，通过比较分析，阐明山楂与山楂的共性与差异，为山楂的选育与驯化奠定理论基础。

　关键词：枣；顺乌头酸酶；柠檬酸；异柠檬酸盐；三羧酸循环

　一、文献综述

　　（一）枣和酸枣果实研究简介

　　1.枣果实研究简介

枣子是一种具有较高经济价值的植物，在国内广泛分布。呈矩形，生吃时呈黄绿，熟时呈棕红色，生吃时呈棕红色，也可制成水果干、水果汁等。枣中富含维生素C、维生素P等多种营养物质，可以作为鲜食食用，也可以制作成蜜枣、红枣、熏枣、黑枣、酒枣、牙枣等蜜饯果脯，也可以制作枣泥、枣面、枣酒、枣醋等。该品种的果形为椭圆，果面平坦，大小一致，果皮薄，果肉呈暗红色，表皮蜡层很少。大枣味甜，果肉嫩，鲜食好，抗旱性强，产量高，稳产，是极具价值的早熟、优质鲜食新品种。从广义上来说，枣分两类：一类是种植型（枣品种），另一类是野生型（酸枣）。红枣是公认的“木本粮食”，由于其富含大量的糖分，我们前期的工作表明，红枣能被一氧化碳（CO）固化，并在一系列的代谢过程中生成柠檬酸[17]，柠檬酸再经柠檬酸的转化，再将一氧化碳（CO）分解为异柠檬酸，从而减少了红枣中的酸性物质，因而，红枣中的酸性物质对红枣的质量和口感起着重要作用。

　2.酸枣果实研究简介

山楂（Salinophylla）属于鼠李科枣（Salinophylla)，属于野生种，具有较少的糖和较高的有机酸。枣树是一种最早的野生种质，在近万年的遗传演化过程中，其果实形态、味道等发生了变化。红枣既有较高的营养，又有较高的药理作用。枣子一般都是又小又圆，瓜子里的瓜子一般都是扁平的。从《观本草》和《本草纲目》中关于红枣的记载来看，它和现代的红枣植株是一样的。与普通的枣子相比，它的个头要小一些，但是却非常的圆润。果型为圆形、扁圆形、卵圆形，口感酸甜，果皮细嫩，口感酸甜可口。它的枝条上有一根尖锐的荆棘，它的果实又酸又甜，因此得名。前期在对青皮、鲜果中的有机酸进行了分析，结果表明青皮、青皮中十碳以上的有机酸含量偏低，十碳以下的柠檬酸等有机酸的含量偏高[18]，而且青皮中柠檬酸的含量与青皮中的柠檬酸相比也有一定的差别，青皮中柠檬酸的含量也有明显的差别，但关于青皮、枣果、青皮等水果中柠檬酸含量的改变，目前还没有关于这种改变的报道，因此，本项目拟通过分析青皮、青皮等果品中柠檬酸在青皮中是否发生了转换，进而影响青皮等果实的风味。

　（二）乌头酸酶简介

乌头酸酶（俗称乙酸水合酶）在柠檬酸和异柠檬酸转化过程中发挥着重要作用，其催化效率达91:3:3（乙酸均衡）。广泛分布于动、植物和微生物体内。以往一般认为该酶类似于富马酸水解路径，对其活性有很大的影响。其作用机理是建立在三种不同类型的柠檬酸络合物上，其中柠檬酸络合物与活性中心的相互作用是当前的热点。Cyclose（英语：Aconitase,Cyclose）是一种通过不对称反应将柠檬酸通过环加成的中间体转变成异柠檬酸的一种反应，在有机合成中起着非常关键的作用。

乌头酸是一种具有正、负两种构型的有机酸。马尾松属植物三甲酸环结构中以马尾松酸为主，柠檬酸向异柠檬酸转变为弱碱态。这道工序所用到的原料是顺时针。用硫酸对柠檬酸进行脱水，合成了乌头酸：(HO,CCH,),COH(CO,H）→HO.CCH=C(CO,HO)CH,CO,H.，其通过加热脱水的方式来制备，其基础原理是：顺乌头酸酶是一种铁硫蛋白，含有一个[Fe,S.S.]，可以将柠檬酸，并将其转化为异柠檬酸钠，然后将其进行三羧酸循环，转换为异柠檬酸盐。ACO将柠檬酸转化为异柠檬酸，再将其氧化，获得240 nm的发光光谱。结果表明，三甲酸与硫酸盐、铁酸盐的作用可以得到“乌头酸”，而与柠檬酸的作用则可以得到“异柠檬酸”。在酶的作用下，柠檬酸会发生失水和水化，从而使得羟基从beta C原子到alpha C原子上，从而形成了很容易被氧化脱氢的异柠檬酸，而异柠檬酸氧化脱羧将NADH还原为NADH。随着NADH含量的增加，ATP的生物合成也随之增加。结果表明，随着黑醋栗酶活性的提高，黑醋栗的质量和香气也随之提高。

（三）柠檬酸简介

柠檬酸是一种重要的代谢物，又叫羟丙烷三羧酸。它的化学名字叫2-hydroxypolycyclic acid。这种无色结晶具有强烈的酸性，在水中和酒精中溶解。因晶体环境的变化，形成了一系列具有特殊晶体结构的柠檬酸，其晶体结构因其晶体结构的变化而有很大的差别。它是一种很好的食物添加剂，也是一种很好的防腐剂。天然柠檬酸是一种重要的有机化合物，这种物质不但存在于柠檬，柑橘和凤梨里，而且也存在于动物的骨头，肌肉和血液里。人工柠檬酸是用糖、糖浆、淀粉、葡萄等进行发酵而成。柠檬酸是一种主要的小分子有机酸，它广泛地影响着植物的多种生理代谢，并在提高植物的抗逆性、抵抗营养和重金属等方面发挥着非常重要的功能。柠檬酸的含量因品种及植株的生长状况而异。

　（四）三羧酸循环简介

三甲酸环化修饰是一个由三个重要调节因子参与的可逆性修饰。研究发现，柠檬酸与异柠檬酸在三甲酸环作用下，可以通过一系列的可逆反应，得到一种具有较好生物活性的顺式乌头酸。该三羧酸环包括三个单元：2 CO+3 NADH+FAD+GDP+Pi-,2 CO+3 NADH+FAD+GDP+Pi-。首先，利用异柠檬酸脱氢酶催化的方法，催化异柠檬酸合成一种名为“草酰丁二酸”的中间产物，然后在a-酮戊二酸的作用下，将其催化为NADH和CO2，最后经过二次反应，合成出两个新型的、具有特殊生物活性的化合物。三羧酸环是这三种物质共同的终端代谢途径，是它们之间相互连接的桥梁，也是生物体内的关键物质。三羧酸环是三者共同起作用的最终环节，也是三者联系的重要环节。在不同时间尺度上，植物对干旱的响应呈现出不同时间尺度上的动态变化。红枣富含柠檬酸，经人工驯化后，可将其细胞质中的氨基酸酶转化为异柠檬酸，进而改善红枣的风味与质量。

　二、乌头酸酶的提取与制备

　　（一）材料与方法

　　1.实验材料

(1)为试验的便利，选择10种不同的枣种，将其标记为：英不落、湖北蜜糖、永济蜜糖、鲁蜜糖2、临汾蜜糖、金丝果4、六月天、献县小蜜糖、金丝果、广洋蜜糖等。

锦锦4号是由山东省果业研究院以锦锦2号为母本，经人工选育而成的一种优质品种。这颗果子的两头扁平，呈圆柱形，中间却要粗壮一些。一般水果的重量在10到12 g之间。这颗果子的顶端微微下垂，而果皮则是更加的平滑，色泽也更加的鲜艳。果实呈乳白色，肉质紧实，酥脆，多汁，甘甜中带着一丝酸，没有任何苦涩，没有任何辛辣，也没有任何辛辣，是一种非常美味的水果。枣子呈淡棕色，肉质肥美，富有弹性。六子果为优质的早熟水果，其果形呈椭圆形、椭圆形和倒卵形。

(2)为便于试验记载，选择10种不同品种的枣树，将其标记为：Suan1B、S-金尼307、Suan1、S-Dai317、S-Dai313、Suan2、S-Dai311、S-金尼8r、S-金尼14、S-金尼12.2等等。山楂（Saccharidae）隶属于鼠李科枣（Saccharidae)，属于野生品种，具有较少的糖和较高的有机酸。

在挑选原料的时候，需要在一棵树上的上、中、下三个位置，分别放置在各种种类的多年生枣子上的枣吊上，将其剥去上面的叶子，然后将其采摘下来，所挑选的原料必须是健康、合格的，在采集到原料之后，要立刻将原料放进液态氮中，然后将其放进-80℃的冰箱里，将其保存起来，进行三个重复。

2.实验试剂和设备

反应缓冲溶液：

30 mmol L⁻¹Tris-HCl,pH7.8

研磨液∶

①0.2mol/L Tris-HCl,pH 8.2

②0.6mol/L蔗糖,

③10mmol/L异抗坏血酸

（二）实验方法

　　1.酶液的制备

①将0.3 g水果放入预先冷却的研钵中，用1 mL预先冷却的研磨液冰浴进行研磨，在确认无损伤后，将其移至离心管内，于4℃条件下4000 r/min进行离心20分钟。

②从胃肠道中取出10 ml的上清，如果上清不足，可以用研磨水进行添加，得到粗酶。

③在4℃下，在12000 r/min的条件下，取4 mL的粗酶溶液4 mL，在1 mL的条件下，将其上清液1 mL加入到萃取的缓冲剂中，将其定容到2 mL，得到的是一种胞浆型的乌头酸酶溶液。

　2.酶活测定

①将2 mL的酶响应缓冲剂与100 uL的酶液混合，在25℃下温育15分钟。②在240 nm下，添加60 mmol L的枸橼酸使其发生反应，用分光光度计测量OD在吸收率上的变化，并在30秒内测量OD,3次重复3次，持续3分钟，将OD值的变化设为1个酶（U)，即1个酶基（U)/g(g)/1-1(U）。

三、结果与分析

　　（一）实验结果

枣或酸枣中的细胞质乌头酸酶的活性较高，经过三羧酸循环转化为异柠檬盐的数量也较多，产生的异柠檬酸和NADH也较多，240 nm的光吸收逐步增加，表明枣或酸枣中的乌头酸酶的活性增加。以下对枣子和枣子中的乌头酸酶酶活力进行了测定。

48232109a2a0ac38cca6caeedbdb8f2d 　　（1）各枣品种三次酶活测定的平均值及误差线

从图1可知，在三个枣品种中献县的小枣、金丝枣和广洋枣具有更高的胞质乌头酸酶的酶活，它们能够将柠檬酸通过三甲酸循环转变为异柠檬酸，并且所产生的NADH也比较多，这样的枣在这三个枣中，颖不落、湖北圆枣和永济的蟾蜍枣，它们所产生的胞质乌头酸酶的活力都比较弱，这样的枣子在这三种枣中，所产生的柠檬酸也比较弱。从表格可以看到，金丝和广洋两个枣之间的误差线比较大，这是由于有一个过渡型，属于过渡型，是从甜枣到枣在培养过程中的一个主要栽培资源，其他几个枣之间的误差线比较少，总之，从整体上讲，枣子中的乌头酸酶活力比较高，柠檬酸的代谢能力也比较强，所以枣子中柠檬酸的含量比较少，所以这种枣中柠檬酸的含量比较少，所以这种枣大部分的质量和口味都比较好。

（图2）不同酸枣品种酶活性对比

18f759ff29cd36de047e51b76774f0a5-1 　　(Figure 2)Comparison of enzyme activities of different jujube cultivars

从图2中可以看到，在这两个酸枣品种中，S-jinan14和S-jinan12.2的细胞质乌头酸酶的酶活性最高，分别为28.95和27.41，其通过三羧酸循环将柠檬酸转化为异柠檬酸的能力也就更强，转化产生的NADH也就更多，因此，该品种的果实品质和口味也更好。suan1B和S-jinniu307这两种的细胞质乌头酸酶的活性较低，分别为9.70和13.90，其通过三羧酸循环将柠檬酸转化为异柠檬酸的能力就较弱，转换产生的NADH也就较少，因此，该品种的果实质量和口味都不是很好。但是，从表格中我们可以清楚地看出，S-jinniu307和suan1这两种酸枣之间有着很大的差别，酸枣也是从酸到甜，属于酸枣中的中间型，其果实的味道也很不错，因此，实验就会得到以下的结果。

综上所述，枣子类整体上乌头酸酶活力低下，表明枣子中的乌头酸酶将柠檬酸转化成异柠檬酸的能力不强，将枣子中的柠檬酸转换成异柠檬酸的能力不强，尽管还有许多过渡型，但这类品种大部分的果实质量和口感都不高，口味偏向于酸甜，枣子的名称也符合了其口感。

（图3）不同枣和酸枣酶活性对比

7d5d9821333aa266a65f7d27e4b2cbe0 　　(Figure 3)Comparison of enzyme activities between different jujube and jujube acid

将两种枣和两种枣进行对比，结果表明：从图3可以看出，广洋大枣、金丝枣、献县小枣和三种枣S-金丝枣12.2、S-金丝枣14、S-金丝枣8 r的酶活力都是最强的，且三种枣的乌头酸酶活力显著高于三种枣，且三种枣的含量都是最小的，含量也是最大的，含量愈大，则表明其酶活力愈强，据此推测三种枣中含量愈高。从表1可以看出，在3个枣品种中，Suan1 B,S-金宁307,S-1 B和S-1金宁307的胞质酸酶活是最小的，而在3个品种中，与Suan1相比差异较小，与湖北圆枣相比，则以Suan1为最小，而与湖北相比，则与湖北圆枣相差较小，据此推测，Uan1 B与Suan1B之间的差异较大，而与Suan 1相比则差异较小。

　（二）数据分析

本课题组在研究中，通过对柠檬酸生物合成关键转录因子柠檬酸合酶（文涛等2001）的研究，获得了一个调控柠檬酸生物合成的关键转录因子，该基因调控柠檬酸的积累，导致了柠檬酸的积累和品质下降，但其调控机理并不明确。这个结果是我在这个试验中得到的，也是在枣子上。

在没有受到抑制的条件下，在枣子或酸枣中，其胞质中的乌头酸酶酶活性越高，通过三羧酸循环，将其转换成了异柠檬盐，这样转化得到的柠檬酸越多，所生成的异柠檬酸和NADH也就越多，因此它的口味就会变得更好，240 nm时的光吸收逐渐增大。

就这个方面而言，像献县枣、金丝枣、广洋枣等，因为细胞浆中所含的乌头酸酶较多，可以把柠檬酸转变成异柠檬酸，生成NADH也较多，所以口感较好。枣中suan1B、S-金乃u307细胞质中存在较低的乌头酸酶活性，致使其柠檬酸三甲酸转化率较低，NADH水平较低，影响了枣的品质和风味。研究发现，与其它几种不同类型的药材相比，枣类药材中的乌头酸含量较低。

　　结论

乌头酸酶能将柠檬酸转化成异柠檬酸，并与三甲酸发生三联反应，在此过程中发挥了重要作用。在240 nm波段，柠檬酸经氧化脱羧基团及NAD-还原后，ACO在可见光区有良好的吸收率。在此基础上，观察并比较了实验结果。据此，我们提出假说：在枣中，细胞质中柠檬酸经三甲酸循环转化为异柠檬酸酶活性较高，柠檬酸代谢率较高，导致其香气及质量较佳。总体而言，酸枣类的乌头酸酶的活力较弱，其通过三羧酸循环将柠檬酸转化为异柠檬酸的能力较弱，转化生成的NADH也较少，因此，该类型的大部分品种的水果品质及风味均不高，口味偏酸偏甜，酸枣的名称也与其风味相符。另外，大部分红枣的胞浆中的乌头酸酶活性高于普通红枣，因而所产红枣的质量和口味也高于普通红枣。枣中存在较高水平的转化子，且其胞内酶活对柠檬酸合成有明显的调控作用，但其调控机理仍不明确。

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致谢

在本次毕业设计中，我学习到了很多的知识，很多之前没有重视的地方通过这个毕业设计让我重视了起来。我特别要感谢一下我的指导老师。老师以其渊博的知识、永不停息的创作意识、严谨的治学态度、一丝不苟的工作作风深深教育了我，在这次毕业设计中给了我很大的帮助，老师严谨负责会仔仔细细的检查我的设计，把设计中有所欠缺的地方都指了出来，并且结合实际中所遇到的问题与我们一起探讨，并且找出解决办法，老师很负责，我碰到的不会的问题老师都悉心给我解答，定期地进行讨论设计，了解我所做的进度，交流毕业设计中所遇到的种种问题以及解决方案。真的很感谢老师！