菜心组织培养与离体再生研究

摘要：为了获得菜心再生体系，以“四九”菜心、“60天”菜心种子为试验材料，对菜心进行组织培养与离体再生的研究。试验用两种菜心种子接种获得无菌幼苗，用它们的带叶柄子叶和下胚轴作为外植体，接种于不同激素配比的分化培养基上进行，再以获得的不定芽进行生根培养，获得了菜心离体再生体系。试验结果表明：“四九”菜心种子经消毒处理无菌接种后在光照光照强度为2250 lx，光照时间16 h，温度25℃下培养6天可获得无菌苗。带叶柄子叶为适宜的外植体；在MS+ 6-BA 2.5mg/L+NAA 0.25 mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂的分化培养基进行一段时间的培养，结果表明：不定芽及愈伤组织的诱导率依次为95%、75.6%，诱导效果最佳；而生根培养在1/2MS+ NAA 0.15 mg/L浓度组合下，培养效果最佳，MS培养基的生根效果次之。为菜心离体培养与再生研究提供了依据。

关键词：菜心；外植体类型；激素配比；生根培养

1 前 言

菜心（Brassica campestrisL.）属芸薹属白菜种作物，是一、二年生草本植物。许多研究显示，在芸薹属农作物的不同品种、变种、种之间，它们的再生频率存在非常大的差异，并且还会受到多种要素的影响，比如培养基的类型、外植体的类型以及苗龄等。通常给大白菜进行脱分化并不是一件容易的事，并且它的再生频率也非常低，在愈伤组织上，很容易先长出根，如此一来，就会对芽的形成有一定的抑制作用[1~4]。除此之外，相比于其他的芸薹属作物，白菜植株的再生长频率也要更低，当使用转基因技术对大白菜品种进行改良时，其效果大打折扣。

改善组织培养可以在一定程度上改良目前存在的大白菜品种。 为了进行大白菜的组织培养，有必要先建立大白菜的快速繁殖体系。 陈卓斌等[5] 使用菜心的雄性不育植株的幼叶作为外植体, 建立了菜心的快速繁殖系统, 能够在短时间内获得为数众多的试管苗。何晓明等[6] 系统性的分析研究了菜心茎尖培养的快速繁育, 相关数据表明：当处于MS+BA 2 mg/L播种培养基培养环境中，茎尖的繁殖系数比处在MS无激素培养基环境中要高的多, 实验表明无菌苗播种培养基中的激素类型以及含量都会影响菜心茎尖的繁殖速度。

采用组织培养技术，从植物外植体上诱导不定芽再生成的完整植株，其遗传稳定性好，繁殖率高，植物组织培养的研究中培养基是最核心的部分，能够为植物组织提供需要的有机和无机营养成分，使植物更好的生长发育[7]。本文以不同品种的菜心作为实验材料，研究了不同外植体和不同成分的培养基的体外培养，找寻适宜菜心体外培养的环境，从而为改良菜心再生培养系统提供现实基础。

2 材料与方法

2.1 试验材料

“四九”菜心、“60天”菜心种子，购置于长春吉利蔬菜花卉种业公司。

2.2试验设计

2.1无菌幼苗的获得

将菜心种子流水冲洗30 min，然后用浓度为70%的酒精进行相应的处理，时长为30 s，接下来用2%的 NaCl0进行表面消毒，时长为15 min，再用无菌水进行冲洗，次数为3—4次，之后接种在MS培养基上，让其生长发芽；具体的培养条件为：在25℃温度，2250 lx的光强下，光照16 h,待到无菌苗的子叶伸展开来之后，割取外植体，并接种到分化培养基上进行培养。

2.2不同外植体对不定芽分化的影响

选择菜心无菌幼苗的子叶以及下胚轴(0.6-0.8cm)作为外植体，并将其接种在分化培养基(MS+ 6-BA 2mg /L+NAA 0.15 mg/L+30g/L蔗糖 +8g/L琼脂)上培育，培养条件同上。

2.3不同激素配比对不定芽分化的影响

在培养基中添加两种不同含量的激素培养无菌苗子叶，两种激素配比的4个处理组合（表1-1），各组合重复试验三次，筛选较为适宜的诱导分化培养基。

表1-1 6-BA、NAA不同浓度处理组合

Table 1 Combination of 6-BA and NAA with different concentrations

2.4不同生根培养基生根效果比较

将诱导分化的不定芽接种在生根培养基上MS、1/2MS+ NAA 0.2 mg/L添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂pH5.8，进行生根培养。

2.5愈伤组织诱导率及不定芽分化率统计方法

将上面配好的培养基分装在培养皿上，每种比例的培养基各装3个，然后进行接种总共接种的外植体数量为30 ~ 50个。在培养大约20 d时，记录相关数据并计算出愈伤组织的诱导率，当培养到40 d时，观察记录并计算出不定芽的分化率以及生根情况。

3 结果与分析

3.1无菌苗获得情况

菜心种子接种在MS培养基上，在培养室内生长6天后，培养结果如图1-1。在相同条件下，“四九”菜心种子获得的无菌苗比“60天”菜心获得的无菌苗长势整齐。可以作为组织培养接种外植体进行后续试验。

　　图1-1 菜心无菌苗生长情况

　　Figure 1. Growth of Chinese cabbage seedlings without bacteria

　　3.2 不同外植体对不定芽分化的影响

在分化培养基上分别接种“60天”以及“四九”菜心的两种外植体：一、带柄子叶；二、下胚轴；培养20天之后进行观察，显示带柄子叶产生了不定芽、不定根和愈伤组织，而下胚轴只形成了愈伤组织，长出了大量的根毛，不定芽的分化率非常的低，还达不到11%（表2-1），可以得出试验选择不同外植体，不定芽的分化率也会有明显差异，相比之下带柄子叶为比较合适的外植体(图2-1)。

　　表2-1 不同外植体对大白菜离体培养的影响

　　Table 2 Effects of different explants on in vitro culture of Chinese cabbage

　　图2-1 菜心不定芽的分化

　　Fig. 2 Differentiation of adventitious buds of Chinese cabbage

　　3.3 不同激素配比对不定芽分化的影响

每个组合重复3次试验，在MS+ 6-BA 2.5mg/L+NAA 0.25 mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂,pH 5.8的分化培养基上进行一段时间的培育，结果表明其愈伤组织以及不定芽的诱导率分别达到95%、75.6%，效果最佳，B1N1效果第二好，其他处理组合的培养效果相对较次（表3-1）。

表3-1 培养基激素成分对子叶离体培养的影响

Table 3 Effects of medium hormone composition on in vitro culture of cotyledon

3.4不同生根培养基生根效果

将分化出的菜心不定芽接种到MS、1/2MS+ NAA 0.15 mg/L两种生根培养基上，14天左右之后，观察结果表明：菜心不定芽在这两种不同的培养基上均可以生根，但生根效果有所不同。其中，在1/2MS+ NAA0.15 mg/L培养基中培养的生根效果最佳，一般长出的根数量为10条，同时根相对来讲又细又长；而在MS培养基上，生根效果稍微差点，大约3~5条（图3-1）。

　　图3-1不定芽生根情况

　　Fig. 3 Rooting of adventitious buds

　　4 讨论

在一定程度上白菜类蔬菜的品种不一、部位不同，对再生体系的构建都会有所影响，很多专家学者的研究结果表明：与其他外植体相比，带柄的子叶更灵敏[8~10]。本实验以“四九”菜心和“60天”菜心两种基因型的子叶和下胚轴为外植体，采用组织培养的方法进行研究，结果表明：两种基因型的菜心子叶做为外植体时，其愈伤组织以及不定芽的分化率都要比下胚轴做为外植体时的高很多。

构建菜心的遗传转化系统要求在培养基培养时，带柄-子叶的出芽率比较高,在很大程度上激素对植物愈伤组织的产生以及带柄-子叶的出芽情况的影响都较大[8]，在未增添植物生长调节剂6-BA或者NAA的培养基中，不定芽根本不会出现分化，这些实验结果显示：对于菜心子叶柄、子叶外植体不定芽的再生来讲，一定要添加6-BA、NAA。[11]因此要找到合适的激素配比。于占东等[12]研究分析了大白菜三种结球类型植株的再生情况，实验结果表明：效果最好的分化培养基是添加了6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AgNO3 4mg/L+ABA0.3 mg/L的MS培养基。本文也得到了类似的结论。在培养基中，添加了激素6-BA 2mg/L， NAA 0.25mg/L时愈伤组织诱导率较高，NAA 0.15mg/L时不定芽分化率较高；培养基激素成分为6-BA 2.5mg/L，NAA 0.25mg/L时，不定芽以及愈伤组织的诱导率均比较高。

在植物细胞组织培养过程中，不同种类的培养基为细胞生长提供的营养、渗透压、离子浓度等环境均有所不一；培养基中各类元素及其含量均会影响植物材料的培养效果，这也是实验成功不可或缺的要素[13，14]。何晓明等[6]研究分析了菜心茎尖培养的快速繁育, 实验结果表明：当选择MS+BA 2 mg/L作为播种培养基时, 与MS无激素培养基的培养效果相比，茎尖的繁殖系数要高的多, 这意味着无菌苗播种培养基中的激素类型及其含量会对菜心的茎尖繁殖速度有所影响。张媛媛等的实验结果表明：对王枣子幼叶的愈伤组织而言，B5培养基的诱导效果最佳，1/2MS的效果名列第二，而MS培养基的效果略微要差点[15]。本试验中，将分化出的菜心不定芽接种到1/2MS+ NAA0.15 mg/L培养基生根效果最好，通常生根10条，并且根较细长。由此可见基本培养基成分对菜心愈伤组织诱导有一定影响，培养基中某些成分和添加的外源植物生长激素得种类和浓度都起到一定的调节作用，改变愈伤组织的生长状态等。

5 结 论

本文在对菜心组织培养与离体再生研究中，以“四九”菜心和“60天”菜心种子为试验材料，通过不同的处理，得到了以下结论。菜心子叶做为外植体时的愈伤组织诱导率和不定芽分化率都明显高于下胚轴做为外植体时的愈伤组织诱导率和不定芽分化率。MS+ 6-BA 2.5mg/L+NAA 0.25 mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂,pH 5.8为最佳分化培养基，愈伤组织诱导率、不定芽诱导率最高，分别达到95%和75.6%。1/2MS+ NAA0.15 mg/L培养基为最优生根培养基。

参考文献

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致 谢

本论文是在我的导师于占东副教授的指导下写的。从选题到论文的完成，于老师一直给予我精心的指导和严格的要求。在吉林农业大学就读四年来,我深受每位教师深厚的专业知识、严谨的教学态度、追求卓越的工作方式、孜孜不倦的教师风范、严格的自律但对学生包容耐心的态度的影响。不仅学到了很多专业知识，还让我学到了如何求知治学如何为人处事。

感谢吉农，让我度过一段美好的学生时光；感谢园艺学院，让我不断提高自己的能力；感谢老师，帮助我巩固了理论基础；感谢我的同学们，给我的宝贵友谊；感谢我的导师，让我学会了沉浸学术研究，乐在其中;感谢岁月，让我遇见更好的自己。作为一名农大学子,我会一直坚守”明德崇智,厚朴笃行”的校训,明确目标,脚踏实地,书写更加美好的未来!

菜心组织培养与离体再生研究

价格 ¥9.90 发布时间 2022年11月23日

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