蛋白质分离纯化

2.1 蛋白质分离纯化技术
       蛋白质分离纯化技术主要运用于制药行业下游生产工艺中对目标蛋白的提纯，下游生产工艺流程一般为∶澄清→直接捕获→低PH灭活→深层过滤→离子交换层析→超滤与渗滤→原液制备。经过蛋白质的预处理，将细胞破碎初步提取目标蛋白，为后期运用蛋白质分离纯化技术对含有大量杂质的目标蛋白质进行提纯做下了一个铺垫。蛋白质分离纯化技术的重要步骤有深层过滤，离子交换层析，超滤与渗滤。深层过滤是根据混合物中不同物质的大小不同进行分离，蛋白质属于大分子物质，在凝胶过滤层析中优先被洗出，从而达到大分子与小分子分离的目的；离子交换层析是根据离子的正负带电性，先通过缓冲液中配基与蛋白质的结合，再用PH溶液将结合的蛋白质洗脱下来，从而去除蛋白质中带有异电荷的杂质；超滤与渗滤是利用一定压力让稀释的物料穿过一定孔径的特制薄膜，截留需要物质，从而使大分子物质得到净化。实现了制药行业中大分子与低分子溶质完全分离的需要。
蛋白质的分离纯化技术有很多种，沉淀分离技术、膜分离技术、离子分离技术、色谱分离技术等都属于分离纯化技术，而运用时我们需要根据目标蛋白与杂蛋白的各种特性，从而选取最合适的蛋白质分离纯化技术。
蛋白质分离纯化一般是根据蛋白质的与配基的种类、形态、溶解性、亲水性、生物活性等方面进行选择，其要保证蛋白质在生产工艺中的稳定性。
2.2 凝胶过滤法 
2.2.1 介绍
       凝胶过滤是由分子筛演变而来，最初分子筛由McBain在1928年提出，此后发现在很多地方有运用到^[5]。1950年,Syngei和Tseiln 引用分子筛的概念解释凝胶层中的电泳和电渗现象。此后在柱层析中发现有这种类似现象,于是大量的实验工作者尝试许多能适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。1959年,Porath与Flodin发现了一种葡聚糖凝胶，这种凝胶做成的层析柱性能良好，因此在生物领域被广泛使用。
       凝胶是由有机物制作而成,在液相中可用于蛋白质、多糖、肽链及其它一些较大分子物质的分离和提纯。凝胶过滤法又称凝胶层析，分子筛层析，主要是依据蛋白质的大小和形状进行分离和纯化。一般目标蛋白含有多种杂质形成混合物质，而根据其分子大小、形状与杂蛋白不同，通过多孔性凝胶层析柱时，混和物质根据分子量大小依次分离出纯蛋白（一般是大分子先流出来，小分子后流出来。），目标蛋白就可以去除部分杂质达到分离效果。凝胶层析柱中的填料多是一些多孔网状结构物质，这些物质都具有很大惰性，目标蛋白通过层析柱时易洗脱，不会受影响而改变其性质^[8]。
2.2.2 基本原理
       合适的凝胶是凝胶过滤法的主要因素。多孔、孔隙大小分布均匀;亲水;与蛋白质没有吸附是决定一种凝胶的必要条件。凝胶过滤时,样品中的各种成分主要是根据蛋白质的分子量大小差异进行分离的。因为凝胶颗粒的网状结构像筛子,离子或小分子物质能够通过网眼进入胶粒的内部, 大分子物质不能进入网眼则被阻留于胶粒的间隙,这样,在进行洗脱时，样品中的各成分分子量大小不同导致各组分流速不同,按其先后顺序,随着洗脱液依次洗出,达到分离的效果。
 
图2.1 凝胶过滤分离过程示意图(图中大小黑点分别为大分子量与小分子量物质)
2.2.3 分配系数
       当混合溶液通过凝胶床过滤分级时,各种溶质在凝胶相和流动相中存在一个含量分配关系,这种关系称为分配系数，用Kd表示^[9]。也是衡量溶质被阻的一个特性常数。Kd的值具有很重要的实际意义，其大小取决于分子的大小与形状。
                                       Vt=Vo+Vi                                  
Ve=Vo+KdVi
                                     Kd=（Ve﹣Vo）/Vi                             
Vt: 凝胶床的“总水体积”(不考虑干胶本身所占的体积)
Vo: 凝胶粒间隙的液体总量即“外水体积”
Vi:凝胶粒内部的液体总量即“内水体积”
Ve:被分离的物质完全通过凝胶床时所需洗脱液的体积即“洗脱体积”
       在制药行业实际生产中,Kd值具有很大意义:(1)当Kd=0即Ve=Vo时,说明溶质是大分子物质,(2)当Kd=1即Ve=V。+Vi时,说明溶质是小分子物质,但在实际上小分子物质如无机离子的Kd值约为0.8,这是因为在洗脱时凝胶相中发生了水化作用,阻碍了小分子的扩散;(3)当0<Kd<1时,说明溶质的分子介于上述两者之间,(4)如果Kd大于1时,说明凝胶颗粒对溶质有吸附作用凝胶过滤不成功或发生了离子交换作用,而不是分子筛效应。
2.2.4 分类与应用
       凝胶过滤是上世纪六十年代兴起的一种生物分离纯化技术。经过许多实验工作者的实践,认为葡聚糖凝胶、生物胶和琼脂糖等均较适用,但应用最广泛最多的还是葡聚糖凝胶。其因在于葡聚糖凝胶具有很强的亲水性,能在水和电解质溶液中膨胀；在水和盐溶液、弱酸及弱碱溶液中十分稳定；对于具有生物学活性的物质,在通过凝胶过滤后,可保持其原有活性,并能除去热原的作用,这在实际生产应用中是一个十分有利的特点。另外生物胶也因为其稳定性很好而运用越来越广，琼脂糖也因为其可分离的分子量比较广而使用。
2.2.5 优缺点
       优点：层析所用凝胶普遍都属于惰性载体，不带有电荷，吸附能力弱，操作条件相对温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要有机溶剂，能保持蛋白质的理化性质与活性，对高分子物质可以达到一个很好的分离效果。
       缺点：凝胶过滤法在使用时有一定的局限性，对分子量比较接近的大分子物质无法进行分离，对某些特定样品有很强吸附能力，此时就不能运用凝胶过滤法进行分离。