离子交换层析法

       子交换层析是以离子交换剂为固定相，缓冲液和盐类为流动相。离子交换技术分离生物分子需待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与其相结合，由于不同的分子在此条件下带电荷的数量、种类及电荷分布不同，故结合强度存在差异，洗脱时根据结合力不同先后被洗出得以分离，亲和力小的蛋白质分子优先被洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被洗脱。
       用于蛋白质的分离纯化的离子交换层析，是一种根据蛋白质所带电荷差异而进行分离的层析方法。蛋白质多肽中存有带电氨基酸，其决定了蛋白质的带电性。然而又由于介质中的pH决定了氨基酸的电性，故蛋白质的带电性主要还是介质中的pH导致的。当介质中pH值较小时，介质带正电，负电基团被中和，而游离的正电基团就很多，蛋白质带正电;在介质中pH值较大时，蛋白质的带电荷与低pH时相反带负电；当介质中的pH处于等电点时，蛋白质的正负电荷相等。所以，在不一样的pH条件下时，蛋白质带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，因此这一类蛋白质被留在层析柱上，接着通过提高洗脱液中的盐浓度等方法，将被吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合能力较差的蛋白质就会优先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合蛋白也能通过提升洗脱液中的盐浓度或是增大洗脱液的pH值被洗脱下来。
       1850年，化学家Thompson等人对土壤中钙离子和铵离子做交换了研究，在这些碱性物质交换过程中发现了离子交换现象，后来，离子交换开始用于生活中，其交换技术的核心和基础是离子交换剂的选择^[8]。上世纪30年代，出现了具有重大意义的人工合成离子交换树脂。后来，离子交换层析技术进入生物学科范畴内，在经过无数学者尝试后，碱性蛋白质成功被异丁烯酸树脂分离，而此时离子交换剂并不适用于蛋白质的分离，其容易导致蛋白质在分离过程中失活。此后数年，新的离子交换不断诞生，极大的在生化分离中推动离子交换技术发展。目前，离子交换技术已成为了蛋白质分离纯化中最常用的一种层析方法。普遍的用于分离纯化各种生化物质，如氨基1. 离子交换剂
       离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种，其依据与高分子聚合物基质共价结合的带电性质不同的电荷基团而分类。阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，带正电荷的离子在阳离子交换剂中可以和流动相中带正电荷的离子基团进行交换，新形成的阳离子能与带负电荷的蛋白质进行结合，达到交换阴离子阴离子的目的。阳离子交换剂中可以使用的主要电荷基团是磺酸（-SO₃H）、羧酸（COOH）、磷酸（-PO₃H₂）和酚羟基（-OH）等酸性基团。阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电，带负电荷的离子在阴离子交换剂中能与流动相中带负电的离子基团进行交换，新形成的阴离子可与带正电荷的蛋白质相结合，达到交换阳离子的目的。阴离子交换剂中常用的可解离基团是伯胺（-NH₂）、叔胺-N（CH₃）₂、仲胺（-NHCH₃）和季胺-N(CH₃)₃等碱性基团。
2. 特点
       离子交换剂有很强的不溶性，疏松的多孔结构和巨大的比表面积，游离的可交换离子很多，平稳的物化特性，用于分离物质时，其识别率较高，可互换离子数量大，不会引起目的蛋白变性，能够有效的去除目的蛋白中所含杂质，操作方便实施。
3. 应用
       离子交换层析是运用最早的层析技术之一，现阶段离子交换层析技术普遍用于制药生物等范围。在生产工艺下游技术中运用相对广泛，一般根据蛋白质所带电荷选择阴离子层析或阳离子层析。能有效的去除蛋白质中部分小分子物质，在改变蛋白质活性达到分离效果。

4 超滤与渗滤
4.1 介绍
       超滤技术用超滤膜作隔离层，在溶液中根据膜两侧产生的压力差作为驱动力的分离技术。属于膜分离技术一种。在一定压力下，小分子溶质和溶剂穿过具有一定大小孔径的超滤膜，大分子物质无法透过超滤膜，留在膜一侧，从而达到小分子与大分子分离开的目的。在超滤过程中，超滤膜是核心部分，在膜表面不断积累不能透过的大分子物质，达到一定溶度时会产生浓差极化现象，此时膜的透水性会下降。故超滤的应用受到一定限制。在此基础上研究人员发现用溶剂稀释截留下的物质，可使小分子物质充分被冲走，这种操作方法被称为渗滤。渗滤是给了超滤一个辅助。
4.2 分类
        超滤根据超滤膜的成分不一样可分为：管式超滤膜，板框式超滤膜，卷式超滤膜和中空纤维式超滤膜。按照压力驱动形式的差异：可以分为外压式和外压式。根据膜的化学成分不同分类：有机超滤膜和无机超滤膜两种。
4.3 特点
       超滤技术具有无相变、高效率、低能耗、操作简便、无需添加任何化学试剂、条件温和等诸多优点，在蛋白质脱盐、浓缩、脱醇、分级分离及内毒素去除等过程中具有广阔的应用前景。膜材料具备良好的成膜性、化学稳定性、热稳定性、机械稳定性、亲水性、耐酸碱和耐微生物浸蚀以及不对蛋白质等生物大分子产生非特异性吸附作用等性能。但是其在使用时易产生凝胶层，还需要渗滤辅助才能更好的完成。
4.4 应用
       超滤技术在实际应用中有其独特优势，但还存在许多阻碍，尤其是超滤中产生浓差极化和膜污染成为了一大难题，这些困难需要通过改变相应的条件来克服。生产中可通过以下方面弱化其缺点，①超滤膜选择性不强，通过改变溶液中各组分理化性质提高分离性能。②用渗滤的方法降低因浓差极化产生凝胶层， 使超滤过程进行更彻底。S．Mukherjee 等利用超滤分离技术分离纯化出了胰蛋白酶。
4.5 展望
       在生物产业快速发展的同时，超滤技术因其独特分离优势而取代传统的工艺方法，在蛋白质的分离纯化中运用也越来越熟练，相信在不断发展中，超滤技术也能与其他技术相结合，克服其存在的一些缺点，在制药行业运用更广。