利用CRISPCAS9技术改良水稻YN6的香味品质

　　水稻是世界上许多国家重要的粮食作物。随着人们经济生活的水平的提高，稻米的食用口感越来越受到关注。香米在国内外市场上倍受消费者的追捧，具有非常良好的市场效益，这使对水稻香味的研究有了重大意义，包括对控制香味的基因，遗传特性和香味的鉴别。

　　我国是稻作历史最悠久、水稻遗传资源最丰富的国家之一，浙江河姆渡、湖南罗家角、河南贾湖出土的炭化稻谷证实，中国的稻作栽培至少已有7000年以上的历史。我国科学家在矮化育种、杂种优势利用的杂交水稻、超级稻育种、水稻生物技术研究等方面，均走在世界的前列[1]。

　　根据中华人民共和国农业部行业标准(香稻NY/T596-2002)，对香稻米的定义是:自身含有香味物质，其香味强度超过人对香味的识别阈，在蒸煮或生熟品尝过程中，能够逸出或散发令人敏感香味的稻米。世界上各水稻生产国均有香稻种植，其普遍分布在东南亚和南亚地区，主要在印度、巴基斯坦、中国X、孟加拉国、阿富汗、伊朗、中国和X等地。国际市场上著名的香米品种主要有巴基斯坦的Basmati种群、泰国Khao Dawk Mai1105、Jasmine、RD6、Siamati等。中国的香稻资源也很丰富，如陕西的洋县香米、湖南的江永香米、山东的曲阜香米、福建的过山香米等[2]。

　　1.2.1水稻香味的形成机制

　　许多研究人员对香米的成分进行分析，被检测出来且具有挥发性的物质有上百种，但是经过众多学者的研究，控制香米香味的主要物质是2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrrolin，2AP）[3]。但是对于香米香味的遗传方式，各个研究人员产生了分歧[4]。对于香味遗传所产生的分歧，主要是因为对香味不能进行一个定量的分析，各个研究人员的对香味的评判方式并不一致，而且对香味定量也有一定的难度。尽管有这些分歧，研究者们还是得到了一个被众人认可的结论，即水稻香味是受隐性单基因遗传控制[5]。

　　1.2.2香味的鉴定方法

　　对于香味的鉴定，有五种方法。热水法是将研磨后的稻粒放入试管中加热，通过嗅其产生的味道来鉴别是否有香味。但这种方法存在风险，有可能会因为其他物质的挥发产生干扰。故目前大多数研究者很少使用这种方法。咀嚼法是一个常用的香味鉴别方法。即通过咀嚼稻米粒直观的鉴别是否产生了香味[6]。蒸煮法是将水稻煮熟成为米饭，来鉴别香味是否产生。氢氧化钾浸泡法实验室中较为常用，其鉴别结果比较准确，不易被其他物质干扰，其原理是因为KOH可以与香稻的香味产生物质2-乙酰-1-吡咯啉特异性结合，且不能与稻米里其他物质反应。以上四种方法事项未鉴定的定性检测方法。其中KOH浸泡法最为实用，结果也很准确。另外三种方法比较简便，但不够准确。因为每个人的味觉嗅觉有差异。会使实验结果不准确。第五种方法是一种较为准确的定量分析法，气-质联用(GC-MS)法有很多的有点，其结果准确，是目前鉴别香味的最准确的方法之一。主要的方法是先将稻米研碎，用溶液溶解。再用蒸馏法将提取出的稻米主要物质蒸馏，使主要物质变成气体，再将气体注入气相色谱仪进行分析，最后再用质谱法定性牌[7]。

　　基因组编辑技术是一种新兴的一种对基因组进行准确修饰的技术，它能在基因组上进行定点突变、插入或删除、基因置换、在两位点或多位点同时定点突变或小片段缺失等操作，已经成为目前发育生物学中的重要工具[8]。该技术可以用于系统地研究基因、调控元件在特定生理或发育过程中所起到的作用，或者用于作物性状的定向改良[9]。

　　CRISPR/CAS系统的结构非常简单，是CRISPR位点附近4~10个编码CAS蛋白的基因连接组成[10]。CRISPR位点由同向保守重复序列(directed repeats)、间隔序列(spacers)和5’端的前导序列(leader sequence)排列组成[11]。其中，间隔序列来源于外源基因片段即原间隔序列(protospacers)，重复序列与间隔序列排列，可以拥有2~100个重复[12]。CRISPR序列基因被转录为pre-crRNA(precursor CRISPR RNA)，然后被剪切为较短的CRISPR RNAs(crRNAs)，指导Cas蛋白的识别与降解[13]。Cas基因则主要编码切割、修饰核酸相关的蛋白[14]。在进行基因组编辑时，CRISPR/Cas9系统主要起两个作用[15]：一是与RNA相结合，这个作用在识别序列的过程中起决定性作用；另一个是间隔序列(protospacer adjacent motif，PAM)也参与识别靶序列[16]。PAM序列是有物种特异性的，不同细菌中序列不同[17]。目前在基因组编辑中，应用最广泛的是Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)，它的PAM序列是5'-NGG-3'[18]。

　　自CRISPR/Cas9系统被开发为基因组编辑工具后，很快就成功应用于各种动物和微生物等多个物种中[19]。但直到2013年，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞实验室才首次将该技术应用到水稻、小麦中，证明了CRISPR/Cas9系统能够应用于植物基因组编辑中[20]。

　　本研究所用水稻材料为北方优良粳稻品系YN6。YN6米粒与北方其它普通粳稻相比，抗冷与抗病性强、生育期短但结实率好，粒长且米饭口感好。与黑龙江省的优质香米稻花香2号相比，YN6不易倒伏，适种性广，但不具有香味。本研究利用CRISP/CAS9基因定点编辑技术，定向敲除失活YN6的OsBadh2基因，使YN6产生香味表型。

　　香稻是一种各个器官均能散发香味的特殊水稻品种，香稻的营养物质含量很高，含有大量的氨基酸和蛋白质，受到了各国人民的追捧。香稻具有良好的口干，清新的香味，丰富的营养价值，是各种水稻中的珍品，其历史大约已有2000年[21]。众所周知，中国是世界第一水稻生产和消费大国，拥有丰富多样香稻品种，但出口型优质香稻品种廖廖无几，占领国际香米市场一席之地的中国香米几乎为零，抢占国际香米交易市场的主要是印度Basmati香米品系、泰国KDML105、中国XJasmine。加强中国香稻育种研究工作，提升中国香米生产水平和出口竞争水平，是当前中国稻作科研的迫切任务[22]。

　　2.1.1材料

　　本研究所用水稻材料为黑龙江省粳稻品种YN6。YN6米粒与北方其它普通粳稻相比，抗冷与抗病性强、生育期短但结实率好，粒长（如图2-1）且米饭口感好。与黑龙江省的优质香米稻花香2号相比，YN6不易倒伏，适种性广，但不具有香味。

　　图2-1稻花香与YN6生育期与粒型比较

　　Figure 2-1 The comparisons of two traits between Daohuaxiang and YN6

　　2.1.2转化相关试剂

　　农杆菌EHA105菌种，由本实验室提供。

　　实验中所用的诱导、继代、选择、分化和生根培养基的组成，见表3-1

　　表3-1水稻再生及转化体系用到的培养基

　　Table 2-1 The medium of rice regeneration and transformation system

　　2.1.3 PCR鉴定分析所用试剂

　　CTAB缓冲液、TE缓冲液、氯仿/异戊醇（V:V=24:1），70%乙醇，无水乙醇，异丙醇、RNA酶、蒸馏水、液氮、5×TBE母液、10×TBE母液、10％过硫酸胺(APS)、6%聚丙烯酰胺胶储存液、Loading Buffer溶液、2%剥离硅烷、0.5%亲和硅烷、固定液（冰醋酸100mL加蒸馏水至1000mL）、银染液（1 gAgNO3+1.5 mL 37%甲醛+1 LH2O）；显影液（1L 30g/L Na2CO3+1.5 mL 37%甲醛+200μL 10 mg/ml硫代硫酸钠）。

　　2.1.4试验引物

　　由于利用CRISPR/CAS9技术敲除水稻OsBadh2基因，当载体导入细胞体内所结合的位点有多个。为了防止误差，我们需对位点进行检测，鉴定CRISPR/CAS9鉴定体中的T-DNA转移整合到待改良水稻品系YN6中。此处我们利用聚合酶链式反应(PCR)方法进行鉴定，所用引物为Ubiq1/Ubiq2。第二步对转基因的编辑作用位点进行PCR鉴定分析和测序分析，所用引物为TALfr F/TALfr R。引物均由上海生工有限公司合成，具体序列参见表2-1。

　　2.3.1水稻转化体系建立与再生转基因苗的建立

　　将种子去壳浸泡在浓度为65%的乙醇溶液中20s，取出后吸干水分，放入升汞溶液中，20分钟后冲洗掉升汞。将洗干净的种子吸干水分，放入培养基中培养，等待种子发芽。两周后长出愈伤组织，但生长出的愈伤组织很不规则，则需要进行两次约为20个小时的继代培养，便可以长出微黄色的形状规则的胚性愈伤组织。此时先后放入预分化培养基和分化培养基中培养，分别为14天和20天，此时会生长出分化的幼苗。统计各个品种愈伤组织中诱导和分化的比例。

　　农杆菌介导的水稻转化体系如下：

　　1）菌液准备：将带有CRISPR/CAS9载体的EHA105农杆菌制成菌悬液，进行梯度稀释，稀释完成后涂布祖平板上，培养一段时间，挑取菌落在新培养基上培养，放置备用。

　　2）植物体备用：取植株的愈伤组织，切成1cm的小块。取用时要轻拿轻放，防止愈伤组织有破损。

　　3）灭菌和培养：将培养基放入0.103MPa、121℃、20min高压蒸汽灭菌。将愈伤组织放入灭菌好的培养基中培养。经常观察植株生长情况，期间如果植株不生长要更换培养基。每天记录生长情况

　　4）筛选和检测：分别取被侵染培养3天的愈伤组织和灭菌7天的水稻愈伤组织转移到含有25mg/L的潮霉素筛选培养基上，用筛选培养基继代培养，平均每两周一次。培养过程中会有部分愈伤组织死亡，选取存活部分培养1-2次，培养完成后放入分化培养基中分化培养，大约15-20天左右即可分化出淡黄色的幼苗，再将幼苗小心放入生根培养基培养20天获得植株。再用PCR技术测其序列，确认基因是否重组。统计各个表型的植株的数量，并选出表型最佳的植株。

　　2.3.2转基因苗子鉴定分析

　　按Edwards et al(1991)且稍有改进的CTAB法提取转基因材料的DNA。用PCR法进行分子鉴定。PCR反应体系采用10μL体系：包括20 ng/μl DNA 1.00μL，10×PCR buffer（含Mg2+）1.00μL，10 mmol/L dNTP 0.75μL，2μmol/L Primer 1.00μL，5 U/μL Taq DNA polymerase 0.25μL，最后加ddH2O 6.00μL。扩增程序为：94℃预变性5 min，55-65℃（根据不同反应）退火30 s，72℃延伸1 min后回到95℃变性30 s，共循环37次左右；然后72℃延伸10 min，待温度降至10℃以下，取出用于电泳。采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定转基因事件；用6%的聚丙烯酰胺(Acrilamide)凝胶电泳和银染法检测目标基因编辑事件，聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳和染色方法按Panaud et al.1996描述的方法进行。

　　2.3.3水稻香味的鉴定方法

　　采用1.7%KOH浸泡法和咀嚼法两种方法来验证鉴定改良水稻植株的香味。

　　(1)1.7%KOH浸泡法鉴定香味：将水稻叶片剪成1cm左右置于10mL试管中，倒入约8mL 1.7%KOH溶液浸泡，同时盖紧管口，10min后打开管口，即可辨别出是否有香气逸出。

　　(2)咀嚼法鉴定香味：取1粒米于口中，仔细咀嚼品尝，用鼻子吸一口气，然后呼气，即可辨别出是否有香气呼出。此方法需要反复试验，一般连续2-3次咀嚼即可完成一个样品的鉴定，检验第二个样品前须漱口。

　　我们首先比较了水稻YN6和稻花香2号香味基因自起始密码子上游3kb处到终止密码子间的基因序列，确定了YN6的香味基因Badh2基因与稻花香品种在DNA序列第7外显子上存在序列差异，其余序列部分两者之间完全一致。序列差异情况与文献报道情况一致，如图3.1A所示，其中稻花香在OsBadh2第7外显子存在短序列缺失，造成移码突变。据此，我们认为，通过失活YN6的OsBadh2基因，将可能改良该品种的香味品质。

　　根据上述的序列分析，我们在YN6的OsBadh2基因第2外显子处选取了一段序列作为CRISPR/CAS9酶识别和编辑位点，如图3.1B所示。CRISPR/CAS9识别序列为：L-arm:GCTGGATGCTTTGAGT A

　　构建识别目标编辑位点的左侧序列的CRISPR/CAS9载体(L-CRISPR/CAS9 vector)，其对应的氨基酸序列设计如下:

　　L-sequence:

　　构建识别目标编辑位点的右侧序列的CRISPR/CAS9载体(R-CRISPR/CAS9 vector)，其对应的氨基酸序列设计如下:

　　R-sequence:

　　上述识别目标编辑位点的左右两侧序列的CRISPR/CAS9载体示意图如图3.1 b，c

　　对上述的构建好的转化CRISPR/CAS9载体进行SacI，出现预期的两条带，大小分别为包含R-sequence的4kb片段和转化CRISPR/CAS9栽体的其它序列12 kb（如图3.1d）。对上述两片段进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化，并进行测序分析，与预期的结果完全一致，表明转化CRISPR/CAS9载体构建成功。

　　和传统的诱变技术相比较，基因定点编辑技术完全可以按照我们的意愿去对任意位点进行诱变。另外，修饰后的基因会随染色体DNA复制而进行复制，进而进行遗传，这也有便于后续的实验统计与观察研究。近年来CRISP/CAS技术以其独特的优势得以迅速发展，CRISP/CAS技术由于其简单的技术原理和实验操作等优点，这个技术对细胞的要求不是那么严格，所以可以应用到各种物种和所有的体外培养的细胞。这一技术是目前应用最广，效率较高，最具有实践应用前景的基因打靶技术。在粮食作物和各种经济物种中，利用CRISP/CAS可以人为的改变任意性状，从而培育出我们所需要的，含有各种好性状的超级植物。同时，CRISP/CAS技术也可以应用到医学研究方面，建立突变体库，为人类的疾病是如何发生的以及怎样发展的提供依据。

　　但是，这一技术仍然存在缺点，它会引起细胞的两种修复机制，从而也会发生一些有违我们意愿的突变，另外，也会出现概率极少的不能识别目标基因位点的现象。但是，这一技术仍然具有巨大潜力，我们有理由相信，随着科技的发展，这一技术必将会对科学界做出巨大的贡献。

　　实验有待进一步改进。最主要的是先保证选取的CRISP/CAS识别区域和载体的剪切的高效性。我们可以尝试不同浓度的菌悬液优化实验环节中的每个方法及步骤，从而增加阳性植株的转化效率。进而能够得到足够多的阳性植株，在保证阳性植株数量的前提下再进一步筛选出我们想要的定向编辑植株。

　　在目前看来，要想在各种高等植物中采用这个技术获得不菲成就，我们还要克服许多的问题。近年来，科学家们通过多种途径不懈努力和探索，已经取得了一些令人振奋的结果。一个具有参考价值的实验为我们积攒了十分重要的数据和技术。就是借鉴大马哈鱼的基因打靶的成功经验，并且成功筛选出最初我们设计想要得到的突变体，从而最终达到基因的定点编辑目的。这一实验也为植物基因组的定点敲除，基因敲入和碱基的定点置换提供了巨大的参考意义。并且这一技术是目前最有利用价值的植物基因组定点编辑技术。

　　因为大多数基因功能的改变是由基因内部某一个或者某几个碱基的突变而引起的，所以利用寡核苷酸介导基因的单碱基突变在植物育种中具有十分重要的理论和实践利用价值。但是这一技术的修复的效率不稳定和后期的筛选困难等缺陷大大的限制了该技术的发展与使用。在实验操作中我们还可以调节和控制基因遗传过程中的相关路径，如对相关中间代谢产物和相关酶进行改良，从而最终达到高效率的基因打靶目的。但是，我们也不得不考虑到事情的反方面，也就是这一技术也有可能对目标基因以外的其他有益基因进行修饰更改，从而造成一些优良性状的退化。

　　综上所述，要想根据人们的意愿将一些植物的某些基因进行定点修饰、将两种或多种有益基因进行结合，将不益于植株生长的基因替换掉，这些基因的定点编辑技术依然存在着我们预想不到的困难。总之，我们可以通过各种各样的生物学理论的结合和生物实验技术的合作，相信在未来，这个技术一定可以为我国的水稻育种提供不错的作用。

　　鉴于已成功获得了YN6的Badh2基因获得了定点敲除的植株，并且已经证实产生了香味，再接下来的实验中我们会对获得的植株进行检测，观察其内的营养物质，并且检测是否含有其他有害物质。检测完成后应用孟德尔遗传定律多培养几代，计算出有香味表型的植株的遗传概率，寻求一定的方法，找出能让香味基因稳定遗传的亲本组合。相信通过CRISP/CAS9技术不仅可以改良水稻的香味基因，还可以改良水稻的抗冷、抗病、抗旱等基因，来获得生存稳定易活的，产量高的，高品质的优良水稻。

　　根据水稻香味基因Badh2的表达机理，本试验选取了Badh2基因的第七外显子一段序列作为CRISP/CAS9的识别和切割作用位点，运用酶切酶连方法将两个识别位点成功地连接到了CRISP/CAS9骨架上，并将这对CRISP/CAS9骨架连接到表达载体上，最后成功的将这一表达载体运用电转化法将其转入到了农杆菌中，经PCR检测，测序检测挑选连接完全正确的载体待用。

　　利用实验室的组织培养条件，无菌操作技术。经过前期的水稻愈伤细胞诱导培养，愈伤组织的侵染及清洗，最后成功的筛选出抗性愈伤组织并将其分化成苗，经过大田的栽培及田间的成功管理收获种子。

　　经过PCR鉴定、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定、目标区域的基因组测序分析、KOH浸泡法和咀嚼法鉴定。成功筛选出了具有怡人香味的水稻品种。经过测序分析YN6的Badh2基因发生了8个碱基的缺失，另一株发生了4个碱基的缺失和2个碱基的置换。从而使YN6水稻品种本身存在的Badh2基因发生了功能的缺失。使原本不具有香味的YN6品种获得了香味表型。

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　　在整整的大学四年中，我在黑龙江大学中经历了丰富多彩的四年，在生活中，辅导员老师、同学、室友都给予了我很大的帮助，作为一个之前从未单独生活的学生，有了他们的存在，让我很快适应独立的生活，让我学会了处世原则，学会了独立自主，学会了做人做事的道理。在学习中，我系统地学习了生物方面的知识，从宏观到微观，从理论到实践。经过老师的教导，我对生物知识产生了浓厚的兴趣，我学会了专业的生物知识，并且培养了我的动手能力，对我未来的生活有深远的影响。在本次论文的创作过程中，我的导师姜老师给予了我很大的帮助，从论文题目讲解，到实验过程中的帮助，到文章结构、文章格式的指导。姜老师都认真负责，使我的论文写作较为顺利。

　　在此，我要感谢的辅导员，我的同学，我的室友，是他们让我的大学生活不会感到孤单。我要感谢我的老师，我的导师姜老师，是他们让我学会了知识，让我充实的度过了大学生活，让我学会了知识，有了一技之长。最后我要感谢黑龙江大学给了我学习的平台，能让我遇到这些帮助过我的人。让我步入社会开始一段崭新的人生！