桑叶中多糖的提取与分析方法的研究

　　1.1研究的背景和意义

　　由于现在人们的生活水平不断得到改善，人们越来越注重自己的身体健康问题。这就使得当下一些古老的医疗保健用品渐渐不能达到人们的要求，另外，一些医疗保健品的加工过程繁琐工艺复杂，往往被认为在生产过程中杂质过多，人们通常不会考虑购买。在一定程度上，人们越来越偏爱采用天然材料的生产的医疗保健品，此时，自然界的动物以及植物作为医疗保健品的原材料越发得到人们的关注，越来越多的科研人员开始重视并且开展了许多研究分析工作。通过翻阅相关的科学技术文献以及相关的研究报告，可以发现：在动物以及植物中蕴含了相当多的生物活性物质，比如：一些生物碱、多糖类物质、酶类等物质，这些物质起到维持个体的正常的生命活动，使得个体饱含生命活力，因此上述的物质被人们视为人体必需的健康因子，在保持人体健康方面起到相当大的作用。在上述的生物活性物质中，人体最为需要以及最重要的就是多糖类物质。对于多糖而言，其本质上是一种由生物产生的高分子化合物，其能够起到相当多的生物活性作用并且还能够起到一起保健作用。因此，对于当前市面上在售的大部分药物以及保健品而言，多糖基本上是它们的主要组成物质，可见其功能作用较多并且地位相当高。除了起到预防和治疗某些疾病的作用，还可以在治疗癌症方面发挥一定的效果。对此，不少科研机构加大对多糖的研究并做了相应的实验，多糖以其市场潜力以及价值越发吸引人们的注意力，研究以及留意该物质的人士日益增多。另外，生物利用糖类生成组织等身体机构，同时也为日常的生命活动供能，是主要的供能原料。糖类物质的生物学功能说明在生物的正常生命过程中糖类起到相当重要的作用，可以说是生物不可或缺的生命基础。在自然界，多糖的载体相当丰富，怎样选择检测标本进而有利于检测是一个值得研究以及商榷的事情。笔者在翻阅相关文献资料的基础上，了解到桑叶中多糖物质的有待深入的研究分析。中国种植桑树的历史相当悠久，桑树的种植持续了上千年，到今天也得到了广泛的种植。可以说桑叶的获取相当容易，来源十分丰富，种类也是相当多。研究产量丰富、材料易得的桑叶是一个比较好的课题，经过对其细胞中的多糖类物质的研究，并经过提取提纯处理后展开相关的实验，接下来一步一步确定该物质最有效的提取条件，这种提取工艺具有相当高的价值。所以，对桑叶细胞中的多糖物质进行相关的研究并进行提取处理具有相当大的价值。多糖拥有的具体生物活性有以下五点明显作用：

　　1、提高免疫力；世界各国都有相关的权威研究证实，多糖能在一定程度上提高机体的免疫能力，因为多糖的结构会很大程度决定多糖的功能，所以，架构不一样的多糖存在很多不一样的免疫作用。在香菇多糖辅助淋巴T细胞之下，如若机体收到刺激，将更快的参与生理反应。尤其是癌细胞产生或者入侵时，其还有能力帮助机体更快的修复免疫功能。

　　2、降低血糖、血脂：当代人类的三大疾病之一——糖尿病，其本质是因为内分泌物造成的。借助细致的分析后能知道，多糖是借助增强小鼠体内胰岛的分泌能水平，是的胰岛素产生的数量增加，从而提高或者减小有关酶的活性从而达到降低血糖的功能；遗憾的是，当前使用多糖进行降血糖还只是在临床试验阶段，且部分工艺还有待提高，还未能达到能正式使用的阶段。

　　3、抵抗肿瘤活性：有许多多糖物质都具有一定的抗肿瘤活性，当前，人们已经可以通过细菌、真菌等提取得到这类多糖，而且还有不少数具有高抗肿瘤活性的多糖已经进入了临床试用阶段，我们有理由相信，多糖在抗肿瘤活性方面的研究将迎来新的春天。

　　4、抗辐射：部分多糖能或多或少的提升抗辐射水平。曾经有人做过实验，设置两组小白鼠，A组不作要求，B组输入茶叶多糖，将两组放在相同实验条件下进行辐射剂量大小一致的照射，结果表明B组的小白鼠成活率比A组高33%。

　　5、其他作用：由于对多糖的了解还有待深入，所以当前人们也没有对其知根知底的了解，在其他作用方面，有比较显著的效果有：海带多糖能起到减肥作用；九里香多糖能对生物体的损伤进行修复；等等。

　　总的来说，多糖目前的研究已经给人们带来了诸多便利，这也是为什么越来越多的人加入到多糖的研究中，同时多糖也是人体维持正常生命活动的必要物质，而且其对于一些顽疾也有着特殊医疗效果，无论从药品角度，还是从保健品角度，多糖的使用还有很大的发展空间。

　　1．2多糖的研究进展

　　多糖(polysaccharides)，即多聚糖。从其微观组织上来看，是由十个以上单糖连接而成，其中起到连接作用的主要是苷键。不过通常情况下，多糖所包含的单糖基均在百个乃至千个以上、多糖虽然由单糖组成，但是与单糖相比，多糖的性质有着极大的改变，而这种改变中最明显的两点便是单糖本身所含有的甜味以及强还原性比较小。多糖有多种不同的分类方法，结合本文的研究，笔者从多糖在生物体内的功能出发，对多糖进行分类，主要分为不可溶于水以及储存养料两种。其中不溶于水的主要是动物的支持组织，从结构上来看，这种支持组织以直链型居多，而主要用于储存养料的多糖多是可溶于水的，尤其是在热水之中，其能够迅速的溶于其中，并且发生反应之后呈现出胶体溶液之态，在其呈该种状态之下，通过酶催化，能够产生出淀粉等，这种多糖分析接够可以促进植物的生长。

　　均多糖(homosaccharide)，是多糖的一种，也可以将其看成由单一一种单糖所组成的，如果是由多种类型的单糖所组成的，那么这种类型的多糖便被称为是杂聚唐。多糖存在的范围极广，并且存在的地方不一，在动物体内，多糖多存在于体细胞膜之内，而在植物体内则多糖存在于细胞壁之中。另外，因为构成多糖的结构不一，所以种类极多，单从自然界不同动植物中提取的多糖就有数百种，如鲨鱼软骨多糖、仙人掌多糖等。

　　多糖出现在所有动植物和微生物细胞壁中。一个多世纪前，德国化学家E.Fischer研究出糖类以及其复合分子在生物功能上是独特性，为后来人们探索糖类应用奠定了重要基础。在20世纪50年代，通过相关相关学者的探讨，人们发现了真菌多糖拥有令人惊喜的抗癌活性，能够起到一定程度的抗癌效果，从此人们对多糖化学特性领域的研究更加关注。紧接着，诸多表明糖类物质的重要构成——多糖类物质具有与众不同的生物活性功能的研究纷纷见诸于世。截止目前，在多糖化学特性研究领域已经取得了很多成果。Glombitza KW等学者在探究中得出结论：分离酸枣仁丁醇提取物所得到的Christinin A能够借助其所含有的皂甙糖，使糖尿病鼠模型的糖水平与肝磷酸化酶活性降低、令清胰岛素含量和肝糖原量有所提高。Tomoda M等学者的研究证明植物粘液具有降血糖的功能。Isiguld K.以18名糖尿病患者作为实验对象，安排其在饭后饮用含茶多糖的饮料，经过4周的试验期，对其糖基化血红蛋白值和血糖含量进行二次检测，得出糖基化血红蛋白值和血糖含量检测有显著降低。Konnoc等学者则在大量研究基础上从人参中分离出人参多糖，多达21中，并在对其进行作用测试后发现，人参多糖能够在很大程度上减少患有四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖含量。

　　随着新世纪的到来，科技和生产力的发展促使了细胞学和生物学的发展，加上仪器的精密度提高和分析技术的更为地科学，我们对于糖类的研究也更为深入，也逐步建立了关于糖类的研究学科，对于多糖功能的了解也更为全面具体。故而可以说，我们已进入了“多糖生命科学”的时代。

　　我们常说的糖类实际上主要是碳水化合物组成的，碳水化合物是碳原子上附带了很多的多羟基醛或者多羟基酮，其也可以称为利用水解生成多羟基酮(或醛)的类化合物。以糖类的组成结构和性质能够将其分类，主要有以下几类：第一类是单糖，第二类是二糖，第三类是寡聚糖，最后一类是多糖。对糖分子加以分析，我们不难发现，一个糖分子当中还含有若干个原子，这些原子的特点是非对称，这也是导致大多数的糖分子具有旋光性特点的原因。如图1-1和1-2所示，其为单糖D一葡萄糖以及D—葡萄糖醛酸的结构示意图。图1-3则是多糖纤维素的结构示意图。可见，多糖纤维素的链接是有众多直链葡萄糖作为媒介进而形成的。因此，关于多糖我们可以得出这样的结论：由多个单糖彼此之间依靠苷键连接起来相互组成了多糖。而这些单糖连接的方式是不一样的，不同的连接方式会导致形成的多糖也不一样，多糖根据单糖的连接方式可以分为三类，主要的类型有：直链多糖、叉链多糖以及环状多糖。

　　图1-1 D-葡萄糖图1-2 D-葡萄糖醛酸图1-3纤维素

　　多糖的不同类型还取决于构成其单糖的种类、单糖的比例，而一个糖分子上面所含有的原子的基团与数量位置等也会影响最后形成的多糖的种类。当然也会因为其所含苷键类型、比例以及其支链大小而异，多糖在结构上比蛋白质的结构更为复杂多样，究其原因主要是能够组成多糖的那些单糖具有很多的种类，哪拍是只有一种单糖，不同的连接方式也可能会致使其产生分支，当然，蛋白质是没有分支的。正因为以上原有，多糖有很多种结构，对这些结构进行归类划分的话，可以划分出四种，分别是：

　　首先是第一种类型，一级结构：对于糖基而言，它一般是构建在一级结构上面的，当处于一级结构的时候，糖基的排列顺序是由特定序列的，判断是否为一级结构的时候要观察相邻的糖基之间连接的方式特点，如果连接方式有分枝的话，分枝在什么位置以及该分支的长短特点是什么。如果拿蛋白质与其比较的话，蛋白质的结构相对来说都算是简单的。可见糖的一级结构是多么的复杂。

　　接着是第二种类型，二级结构：多糖的二级结构实际上是一种聚合体，主要是由多糖的骨架彼此连接而成，这种连接是通过氢键的方式连接起来的。与一级结构的连接方式不同，二级结构的主要是多糖分子中主链的构象，与侧练无关，因为侧链没有参与到二级结构的空间排布中。而在结构排列中。一级结构是二级结构的基础。

　　其次是第三种，三级结构：三级结构也可以理解为非共同价作用的产物，这种共同价是因为一级结构中唐单位的羧基、氨基或硫酸基相互作用产生的。因此导致了原本有序的二级结构出现了有规则而粗大的改变所形成的构象。

　　最后是第四种，四级结构：四级结构也是为供价作用形成的，而这种是多种聚集体的集合，是由于多个多聚链通过非共价产生的。这种多糖链并不是只存在于相同的分子之间，不同的分子之间也可可能会形成聚集作用。单糖残基如果是按照单一的个体来观察的话，可以发现在空间上面主要呈现多糖的结构形态特点。进一步研究观察这些空间等位置特点，对于研究多糖生物是有着重要的意义的。

　　1.4.1多糖的提取方法研究

　　多糖的提取方法众多，也各有特点，最具代表性和实操性的有以下五种：

　　1）热水浸提法：

　　上个世纪多用此类方法提取多糖，是一种传统方法。其原理是：可提取物质易溶于水，通过过滤或离心将其与不溶物分离。

　　优点：设备易获得，易操作，环保可靠。

　　缺点：热水浸取法的过程需要数吨水，而且也要大量的使用乙醇进行醇沉淀，最后由于时间和温度也会对多糖产物的结构有或多或少的影响。

　　2）超声波提取法：

　　对于超声波而言，它在对多糖进行提取的时候，一般是按照是空化效应来得到的。如果液体里有特别小的核心，那么就会因为超声波的刺激而不断地被激活，从而导致收缩等现象，由此造成液体里出现高压等情况。按照“先扭曲，再中断，最后释放”包裹物的顺序来减少提取时间。

　　优点：操作实验过程段，效率很高。

　　缺点：此法只能在实验室中实现，大量的工业生产不可行。

　　3）微波提取法：

　　顾名思义，此法需要微波辐射来完成，微波能够对溶剂产生作用，它能够通过细胞壁从而渗透到细胞内部。细胞液以及溶剂会能量进行有效的吸收，而且如果当压力大于了细胞壁容积能力的时候，细胞壁就会撑破，会形成诸多小孔，而活性物质就会通过小孔释放出来。

　　4）酶解提取法：

　　此法是通过酶具有专一性、高效性来实现的。酶解提取法可以无视细胞壁对多糖的阻挡，从而能够得到快速的释放，如此可以将成分提取出来。在所有的反应过程里，它都存在特别温和的条件，能够最大程度地对生物活性进行保障，具备特别大的潜力。按照提取阶段里酶的使用情况能够知道，一般都包含了下列两类不同的方法：单酶提取法以及复合酶提取法。

　　随着生物工程和技术的快速发展，有关酶工程技术的研究也成为生物研究领域的一个新出发点。

　　优点：多糖产率是这几类方法中最高的，实验条件容易达成。

　　缺点：制作成本过高，性价比较低，且酶的引入可能会带纸多糖的纯度受到影响。

　　5）超高压提取法：

　　这种方法是在常温下作为有效对植物成分进行提取的一个有别于以前的技术。它色工作原理对物质展开持续的压力降低，并且这是通过加压装置实现的，与此同时，还会进行降压操作，如此能够让细胞里的压力产生较大的变化，如此能够让细胞壁因为压力的影响而出现破裂的情况，其中的内含物就能够最大程度地进行释放。

　　该方法的优点是提取时间短、杂质少、能耗低、提取率高，是一种有较大潜力的提取方法。但和超声波提取一样，这种方法目前只适用于实验室，工业化生产桑叶多糖还不能实现。

　　总结：根据笔者能开展的实验条件以及工艺方法和流程，通过上述对比，最后决定使用水提法进行实验，同时以超声法辅助提取。

　　1.4.2多糖的分离与纯化研究

　　经过水提取的方法后获得桑叶多糖粗提液，其液体呈现不透明的掩饰，这是因为溶液中含有许多杂质造成的，其中的杂质包括蛋白质、叶绿素、叶黄素、生物碱之类的物质，因此如果想得到纯度较高的多糖溶液，那么必须最大程度上过滤到上述的杂质。实验方法如下：

　　1）除蛋白

　　对于桑叶多糖粗提液而言，在其所有的杂质以蛋白质为主。通过相关的生物技术，例如盐析法、蛋白酶法等技术可以有效去除溶液中大部分蛋白质。然而，仅适用等电点沉淀法以及加热变性法无法百分百除掉溶液中的蛋白质。此外，对于等电点沉淀法而言，其对操作人员的要求较高，并且该方法的成本极高，但是桑叶中多糖的回收率却不高。经过对比研究国内外的祥光资料，发现当前时期Sevag法和三氯乙酸法优势明显。其中，Sevag法的原理为通过三氯甲烷-正丁醇混合溶液可以凝固蛋白质的作用将粗提液中溶解的蛋白质凝固后沉淀，再用萃取法除去桑叶多糖中的蛋白质。通过实践发现，这种方法优势明显，然而效率不高。对于三氯乙酸法而言，其原理为在酸性溶液中由于蛋白质与三氯乙酸的酸根可以结合产生沉淀，进而可以去除粗提液中的蛋白质杂质。

　　2）脱色

　　另外，桑叶多糖粗提液中有许多叶绿素、叶黄素等色素杂质，能够采取多糖与色素理化特性的区别进行去杂质处理。对于这种杂质的去除方法常用的有以及几种：大孔树脂吸附法、澄清剂法、活性炭法。第一种方法才做简便，不仅能保护环境，而且性价比高，能满足大规模生产的需要。脱色后再用乙醇进行沉淀，从而得到多糖的纯化物。

　　1.4.3多糖的分析与检测研究

　　通常使用苯酚—硫酸法量化商业中多糖的含量，其原理为糖类在浓硫酸中可以产生水解，进而出现脱水反应产生糠醛及其衍生物，可以通过苯酚进行染色进行检测。在苯酚-硫酸法中多糖在硫酸的中可以发生水解就形成单糖，然后在脱水的作用下产生糖醛衍生物，接着用苯酚进行着色，用比色法测定多糖的含量。使用紫外分光光度计，波长为490纳米，待测物会在该波长处显示出最大吸收峰。接着再配置葡萄糖标准溶液，空白对照组为经过相同处理之后的蒸馏水，经过测试后得到在490nm处葡萄糖溶液的吸光度值，然后绘制标准曲线图。图中横坐标为葡萄糖的浓度值，纵坐标为吸光度。

　　2.2.1葡萄糖标准试液的配制

　　在烧杯里面放入葡萄糖，它的总量是10.00毫克，并且是通过天平获取的，然后在烧杯里面倒入一定量的蒸馏水进行搅拌（玻璃棒搅拌）溶解。再利用玻璃棒将配置好的溶液转移到100毫升的容量瓶里面去，为了防止溶液的浪费记得用蒸馏水将烧杯进行多次清洗，最后向容量瓶里面继续添加蒸馏水直至达到标记刻度，将容量瓶盖好以后上下左右摇摆均匀，0.1g/mL的葡萄糖标准试液就配制好了。

　　2.2.2苯酚的配制

　　准确称量2.5克苯酚晶体，放入烧杯中，记住要一边加蒸馏水一边用玻璃板搅拌，等到蒸馏水加入完成以后，如2.2.1中玻璃棒引流的作用，再次利用这个原理将烧杯中的溶液转移到容量瓶中（50ML的棕色容量瓶），然后同样用蒸馏水做清洗并定容到规定的刻度处，将容量瓶盖好以后上下左右摇摆均匀，5%的苯酚溶液就配制好了。

　　2.2.3三氯乙酸溶液的制备

　　选取实验室中的天平（电子）称取三氯乙酸5克，并将其放到烧杯里面随后倒入一定量的蒸馏水搅拌溶解，接着同样利用玻璃棒的引流作用将烧杯中的溶液转移到容量瓶中去（50ML的棕色容量瓶），但是与2.2.2中不同的是，这里要立刻将烧杯中的溶液进行转移，不能进行停留，然后同样用蒸馏水做清洗并定容到规定的刻度处，将容量瓶盖好以后上下左右摇摆均匀，10%的三氯乙酸溶液就配制好了。

　　1、分别用滴定管汲取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL已经制备好的葡萄糖溶液放到不同的容量瓶（10mL）中去，同样的继续取蒸馏水加到容量瓶中定容到规定的刻度线；

　　2、取6个锥形瓶，分别加入2mL的溶液，然后再加入1mL的苯酚试液；

　　3、振荡锥形瓶使溶液混合均匀，快速将量取好的5ml浓硫酸溶液滴入锥形瓶，持续振荡锥形瓶2分钟，然后利用恒温水浴加热锅对锥形瓶进行沸水浴加热，加热持续15min后停止；

　　4、停止加热后将锥形瓶取下并静置冷却直到室温，采用紫外分光光度计测量锥形瓶中溶液在490nm时的吸光度；

　　5、依次对不同浓度相应的吸光值进行记录，并且根据记录结果绘制曲线图。

　　2.4.1水提法工艺步骤：

　　1、在机器中加入适量的桑叶研磨，完成后收集起来置于通风干燥处等待取用；

　　2、称取5g步骤1中研磨好的粉末置于容器里面，随后加入适量的蒸馏水，加热到相应的温度提取多糖；

　　3、静置一定的时间以后，收取步骤2中获得的提取液置于锥形瓶中；

　　4、采用离心机对经过乙醇溶液沉淀析出的提取液进行离心过滤，最终得到粗多糖物质；

　　5、将上述的粗多糖产品进行烘干处理，一段时间后测量其重量。

　　2.4.2水提法实验环境的设定

　　通过相关文献了解到，利用水提法对桑叶中的多糖进行提取时，具体提取过程中的温度、时间、次数以及液固比都是影响提取结果的重要因素，所以针对这四个因素进行了单变量对照试验的设计；

　　水提法最佳提取环境的确定步骤：分别在50、60、70、80摄氏度的温度条件下进行提取；时间每个一个小时，分别是1小时、2小时、3小时、4小时；提取液的固比分别为10:1,20:1,30:1,40:1。

　　2.4.3超声提取法实验步骤

　　1、在机器中放入数量干燥的桑叶，完成碾碎研磨后将桑叶拿出置于干燥通风的环境中；

　　2、将称量好的5克桑叶粉末放入超声波细胞粉碎机，关闭装置门，对需要的超声功率及时间进行设置；

　　3、经过一定的时间就可以将不同条件下产生的多糖提取液收集到锥形瓶中；

　　4、将适量的乙醇加入到在锥形瓶中使溶液沉淀，再由离心机对沉淀进行离心过滤操作后得到多糖的粗产品；

　　5、对多糖粗产品进行烘干操作后，将其静置一会儿，用电子天平进行称重。

　　2.4.4超声法实验条件设计

　　根据相关记载了解到，利用超声法对桑叶中的多糖进行提取时，具体提取过程中超声提取的功率、时间、液固比都是影响提取结果的重要因素，所以针对这三个因素进行了单变量对照试验的设计；这里设定三个超声功率分别为200、300、400瓦，然后是设定提取的时间，这里分别把三个时间设定为15、20、25分钟，还有液体固体物质的比例，这里分别取其为10、20、30。以此三种参数分别做对照试验，我们就能逐步逼近这种方法的最佳实验条件。

　　2.5.1首先去除蛋白质

　　使用合适的蒸馏水来溶解上面获得的多糖产物，随后把的三氯乙酸溶液添加到其中，借用试纸来测定知道在上下，之后把该溶液放在的冰箱里冷却，随后把该溶解做离心过滤，对滤液进行减压使得其达到浓缩的效果，随之我们要使其沉淀，这里加入乙醇即可，乙醇的浓度在95%左右；之后需要在低温下对溶液进行静置处理，这里放到冰箱里36小时即可，最后把该溶液取出来，把获得的沉淀物质在低温条件下晾干，就能够得到高质量的桑叶多糖。

　　2.5.2然后对活性炭进行脱色处理

　　前面制备了多糖成品，下一步要将之溶解在蒸馏水里，溶解完毕之后，便要加入活性炭粉做回流脱色，得到活性炭含量，过滤需要热环境，冷却待以后使用。

　　2.5.3使用乙醇进行沉淀纯化

　　使用合适的蒸馏水来溶解脱色后的多糖成品，在把乙醇溶液加入其中，

　　这里选取的乙醇浓度分别为50、60、70、80%，在这几种不同的乙醇浓度下进行过滤，就可以得到不同的沉淀物了，然后进行烘干后就能够获得质量很高的多糖，待其冷却以后称量。

　　称量完毕之后，取其中最重的多糖成品，取1mg即可足够使用，然后像前面的操作一样，加入蒸馏水配成标准溶液，标准溶液的浓度为0.1mg/mL，然后取出标准溶液2ml，滴入锥形瓶中，加入苯酚，1ml，浓度为5%；然后手摇进行震荡，等待其震荡均匀之后，加入浓硫酸，这里要迅速的加入约5mL；然后再次进行反复的振荡，等待振荡两分钟之后，将其置入恒温水浴箱中进行进行持续加热，等待其加热大约15分钟后，取出进行降温处理，等待其降低至室温，然后就可以测定样品的吸光度了，再之后使用吸光度来计算其含糖量。

　　桑叶中含有的多糖属于混合物，不可以直接加以测量，因此就必须找到其它的能够替代三爷里多糖含量的物质当作合格品，采用紫外可见分光光度计检测合格品葡萄糖溶液在之内的数据，可以把吸光度的光谱图表示如下：

　　葡萄糖的标准溶液吸光度曲线

　　葡萄糖标准溶液在紫外可见分光光度计扫描图

　　上图葡萄糖合格品在紫外可见分光光度计的照射下，形成的扫描图清晰的表明了其最大吸光度的峰值波长，即在葡萄糖合格品中添加苯酚-硫酸试剂的情况下，通过紫外光照射，在490nm波长位置获得最大吸光度，因此该波长位置可以选作样品的特征吸收峰。

　　通过对不同浓度的样品溶液在选定波长处的吸光度检测值进行平均值计算，将检测到的吸光度值定义成纵坐标，葡萄糖溶液浓度定义成横坐标，得到的标准曲线如下所示：

　　葡萄糖溶液的标准曲线

　　得到回归方程是：，R2，说明在的区域内葡萄糖的溶液浓度与吸光度之间有明显地线性关系。

　　3.2.1最佳提取温度的确定

　　葡萄糖粗产物质量与提取温度的关系图

　　由上图可知，当另外的三个因子不变时，提取时溶液温度越高，获得的多糖产物的量就越大，造成这种结果的原因是：多糖溶解度随温度的上升而提高，也在一定程度上使得多糖的传质速度变快，另外桑叶的细胞壁经受不了高温，容易被破坏，从而使得多糖更容易析出，在温度为80℃的时侯，最多可获得0.105g多糖，的提取率；同时温度越高提取工艺越高端的现象也是不存在的，细胞壁内别的物质也被同时分离出来，也会影响多糖的含量。整体考虑，在明确最佳提取温度的时候，将其设定成80℃

　　3.2.2最佳提取时间的确定

　　葡萄糖粗产物质量与提取时间的关系图

　　从该图能够了解到，如果选取最合适的温度是时，当把液固比和提取次数当作定量来考虑时，则得到的多糖产物在开始时是增加的随着时间的推移会慢慢的减小，是它的最合理提取时间，得到粗糖产物，的提取率；得出的结论是因为提取的时间太长了，细胞壁内别的物质也被同时分离出来，再加上多糖的成分也可能改变了，进而影响了它的提取率。掌握时间不但能降低提取的时间，还能够获得更高的粗糖提取率，所以这里最合理的时间定在。

　　2.2.3最佳提取次数的确定

　　葡萄糖粗产物质量与提取次数的关系图

　　从该图能够了解到，如果选取最合适的提取温度80℃和最佳提取时间2h时，固定液固比，通过给实验得到的多糖在开始时增加的很快，随着时间的推移就会慢慢的走向平稳；次提取获得的粗糖产物是，的提取率；次提取获得的粗糖产物是，的提取率，和整体的提取率来比较，这增加了；在一定的环境下对此可能的因素做剖析，细胞壁内分离出来的多糖随着时间的增加慢慢的趋于饱和，必要要增加其他条件或者是改变外界的环境也许会都它的分离物有影响；受工艺的限制影响，次提取以后就可以缩短时间，同时还可以得到更多的粗糖提取物，所以经过实验吧定位最合理的提取次数。

　　2.2.4最佳提取液固比的确定

　　葡萄糖粗产物质量与提取液固比的关系图

　　从上图中能够了解到，如果另外三个使用最合理的提取条件时，则其取得的粗糖产量和液固比成正向关系，的液固比，能够得到粗糖产物，就可以算出提取率是；的液固比，能够得到粗糖产物，算出提取率是，通过比较能够知道，这两个的提取率都是比较高的；同时它们的液固比也是比较大的，另外还要主要实验操作的实施性和材料的浪费原则，经过整体考虑得出，其最合理的液固比应该是。

　　3.3.1最佳超声功率的确定

　　葡萄糖粗产物质量与超声功率的关系图

　　由上图可知，在其他两个工艺条件一定时，功率逐渐增加时使用超声法提取的粗糖产物的质量先增加后减少，当功率为300w时得到的粗糖产物质量最多，达到0.382g，多糖提取率为7.64%；产生上述现象的原因可能是超声的功率过大时会导致桑叶细胞壁内侧部分成分损坏甚至导致多糖的流失变性，所以应该选择一个最佳的超声功率来提取葡萄糖粗产物，根据实验可知当功率为300w时得到的粗糖产物最多。

　　3.3.2最佳超声时间的确定

　　葡萄糖粗产物质量与超声时间的关系图

　　由上图可知，在使用了最佳的超声波功率后，在提取的液固比一定时随着提取时间的增长粗糖产物的质量逐渐增加，在此条件下粗糖产物最佳的超声时间为25min，此时超声波法提取的粗糖产物为0.414g，提取率达到8.28%；然而并不是随着超声波照射时间的增加提取物就会增加，当照射时间达到一定限度时就会出现和功率过大一样的问题，一是导致细胞壁中的某些成分被破坏，部分杂质流失；导致一些杂志的析出；二是导致多糖变性变质；根据上述现象可知，利用超声波法提取多糖的最佳时间为25min

　　3.3.3最佳液固比的确定：

　　葡萄糖粗产物质量与超声时间的关系图

　　由上图可知，在使用了最佳的超声功率和超声时间提取多糖后，发现当固液比增加时提取物增多，但是当固液比达到一定值时提取物的质量的增加速度变慢，当液固比为20:1时，粗糖产物质量为0.446g，提取率为8.92%；当液固比为30:1时，粗糖产物为0.452g，提取率为9.04%，总提取率提高了约0.1%，鉴于操作流程、成本和繁琐性等原因，最后得出的最合适的提取液固比为20:1

　　根据以上实验，我们得出了以下结论：在使用超声法提取桑叶中多糖时最佳提取工艺为：超声提取功率为300w，超声提取时间为25min，提取所用的液固比为20:1,在上述条件下得到的粗糖产物为0.446g，提取率达到了8.92%

　　多糖含量与乙醇浓度的关系图；

　　由上图可知在使用醇沉法提取多糖时在乙醇浓度为80%时得到的多糖产物最多，产量达32.19mg，产率为10.52%

　　在使用最佳的水提法提取多糖后，将获得的多糖粗产物进行除蛋白和活性炭脱色，之后用浓度为80%的乙醇进行醇沉法提取，最后将得到的多糖精品溶解在500mL蒸馏水中，对溶液进行和苯酚—硫酸法相同的操作，最后当其位于490nm位置的时候，获得的的吸光度数值是0.8187，这是它的平均值。

　　通过葡萄糖的标准曲线可以计算出待测样品中的多糖浓度为：a=(0.8187-0.2668)/14.225=0.038mg/mL

　　所以可以计算出精糖样品中多糖的含量为w=0.038/0.1x1x100%=38.8%

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　　本文对桑叶中的多糖进行了提取、分离纯化和分析检测，根据目前的实验室条件进行了很多单因素变量实验得到了多糖水提法和辅助超声提取法的最佳提取条件和使用最佳条件提取多糖时的提取率，同时还分析了粗多糖的分离提纯和醇沉工艺，利用苯酚-硫酸法可以得到相关数据，进而能够画出葡萄糖的标准浓度曲线，并且在这个图形的基础上检测多糖精品中的多糖重量。可以得到下面几个结论，希望可以有助于桑叶中多糖的提取和检测工作并提供相关的经验参考。

　　1、发现了葡萄糖的检测分析方法：可采用苯酚-硫酸法，使用紫外光光度计在490nm处实施检测工作。

　　2、使用苯酚—硫酸法对不同标准浓度的葡萄糖溶液在490nm处的吸光度值进行测算，在这个基础上将吸光度值放入纵坐标中，将葡萄糖浓度值放入横坐标中，进而可以得到标准曲线，进而得到的回归方程为y=14.225x+0.2668,相关系数R²=0.9471＞0.9，和有关精度一致。

　　3、改进了桑叶中多糖的提取法，体现在提取条件方面，进而得到水提法的最优实施条件，即溶液温度为80℃，提取共两个小时，提取了两次，液固比为30:1。在这个最优的条件下可以得到粗糖产物0.306g，提取率为6.12%。

　　4、对使用超声法提取桑叶中的多糖的提取条件进行了改良，进而得到超声法的最优提取条件，即超声波300W，提取持续了一刻钟，液固比为20:1，在此最优条件下共获得0.446g粗糖，提取率达到了8.92%。

　　5、改良了使用醇沉纯化方法对多糖进行提取时的提取条件，得出了使用醇沉法对多糖进行提取时的最合适条件为：使用浓度为80%的乙醇，此时得到的多糖精品为32.19mg，提取率为10.52%

　　6、使用苯酚—硫酸法计算出多糖精品中多糖的质量为12.5mg，含量为38.8%，提取率还是比较高的；以上数据为对多糖进行大规模工艺化提取和纯化提供了理论支持

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