CLU的基因多态性与非痴呆型血管认知障碍相关性的研究

　　血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是脑血管病变及其危险因素导致的临床卒中或亚临床血管性脑损伤，涉及至少一个认知域受损的临床综合征，涵盖了从轻度认知障碍到痴呆，也包括合并阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)等混合性病理所致的不同程度的认知障碍。根据流行病学研究[1]，我国65岁以上的人群中VCI患病率约为8.7%。非痴呆型血管性认知障碍(vascular cognitive impairment no dementia with，VCIND)，血管性痴呆(vascular dementia，VaD)和混合性痴呆(mixeddementia，MD)是VCI的三种形式。VCIND为血管性痴呆的早期阶段，一些人可能会恢复到“正常”水平的认知功能的健康状态，一些人会进展出现进一步的认知能力下降或血管性痴呆。中国的一项认知与老龄化研究发现[2]，VCIND占总病例的42.0%，是中国最常见的轻度认知功能障碍亚型。在中国，一项对VCIND患者随访2年的研究发现其演变为痴呆的比例高达40%[3]。X一项研究追踪VCIND患者3年内转化为VaD的概率为35%[4]。VCIND临床上主要表现以注意力、执行功能的减退，以及运动操作和信息处理速度的减慢为主，病理上主要表现为新近皮质下小梗死、白质高信号、腔隙、血管周围间隙扩大、脑微出血、萎缩。其可能与额叶-皮质下环路的阻断有关。当然，与记忆相关的海马-内侧颞叶-皮层下功能通路被破坏也会导致记忆损害。鉴于血管性痴呆一旦进入中晚期没有治疗药物和手段，因此在早期阶段的VCIND是血管性认知障碍治疗和预防的最佳阶段。因此明确其遗传易感性及危险因素对于早期预防VD具有重要的临床意义。

　　全基因组关联分析研究鉴定出若干CLU单核苷酸多态性风险基因位点，其中CLU基因的rs11136000、rs2279590、rs9331888、rs933194位点，被认为是目前迟发性阿尔茨海默病（LOAD）显著相关位点。较多的研究证明CLU基因是目前第三大相关基因LOAD的风险基因。CLU基因是单拷贝基因，位于8p21号染色体上，包含9个外显子、8个内含子，含有16580个碱基，编码449个氨基酸组成的多肽链。CLU mRNA表达具有组织特异性，在正常大脑、肝脏和胰腺表达较高，大脑内的表达在膜重构和细胞可塑性方面起到重要的作用。多项研究表明[5]CLU基因也参与了许多严重的生理疾病，如中枢神经系统紊乱、动脉粥样硬化、炎症等。血浆CLU浓度在认知功能障碍、脑萎缩、认知功能快速下降、AD进展中起重要作用。CLU基因编码clusterin，也称为载脂蛋白J，是中枢神经系统中表达最丰富的载脂蛋白之一，可影响Aβ聚集、介导Aβ清除、调节脂质代谢、诱发补体反应以及神经炎症反应。CLU作为高密度脂蛋白的组成部分，参与胆固醇的转运，参与动脉粥样硬化的进展和恶化[6]。而动脉粥样硬化是血管性认知障碍的最重要病因机制，基于以上，我们推测CLU基因可能参与血管性认知障碍的发生和发展。本研究采用病例对照方法探讨基因位点的多态性与VCIND的相关性，明确其在VCI病程进展中可能的作用机制，为VCI的早期预警生物学标志物及干预提供重要的临床依据。

　　血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是脑血管病变及其危险因素导致的临床卒中或亚临床血管性脑损伤，涉及至少一个认知域受损的临床综合征，涵盖了从轻度认知障碍到痴呆，也包括合并阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)等混合性病理所致的不同程度的认知障碍。VCI是痴呆的第二常见原因[7]，我国脑血管疾病发病率高。根据流行病学研究[1]，血管性痴呆的发病率约为3.1/1000人/年。我国65岁以上的人群中VCI患病率约为8.7%。除患病率以外，痴呆症对经济、卫生和社会援助的影响也在增加。故能够及早防控VCI成为全球最急需解决的问题。非痴呆型血管性认知障碍(vascular cognitive impairment-no dementia with small vessel disease，VCIND)，血管性痴呆(vascular dementia，VaD)和混合性痴呆(mixeddementia，MD)是血管认知障碍的三种形式。越来越多的证据表明：VCIND为血管性痴呆的早期阶段，具有很高的危险性转化为痴呆。我国有研究通过对VCIND患者2年随访发现其演变为痴呆的比例高达40%[3]。X一项研究发现[4]：VCIND患者3年内发展成VaD的概率为35%。临床上无症状的脑血管疾病足以引起相关的认知功能障碍[8]，大多病情恶化可能是缓慢和渐进的；通常不会观察到渐进性恶化和局灶性认知障碍，小血管疾病是VCID中最常见的损害[9]。一项前瞻性筛查研究显示，包括腔隙性梗死、微梗死、髓鞘丢失、动脉硬化、软脑膜脑淀粉样血管病、血管周围间隙扩张和大面积梗死在内的七种病理疾病可以预测认知损害[10]。VCIND的主要影像学表现可出现腔隙性脑梗死、脑白质疏松、脑微出血、血管周围间隙扩大、脑萎缩等。影像学特征可作为诊断VCIND的特异性标志物，在早期诊断和预测VCI患者认知功能下降的临床实践中扮演着一个重要的角色，要想实现对痴呆症和脑血管病变进行预防和治疗，可以先对VCIND进行防治来实现。

　　近年来，神经分子影像学、神经功能影像学等对疾病进行认识、诊断、治疗及预防的依据之一，但是目前临床诊断中的主要标准还要依靠神经结构影像学。结构成像如临床使用的MRI序列包括T1加权磁共振成像（T1WI），T2加权磁共振成像（T2WI），液体衰减反转恢复序列（FLAIR），扩散加权成像（diffusion weighted imaging,DWI），弥散张量成像（diffusion tensor imaging,DTI），磁敏感加权成像（susceptibility weighted imaging,SWI）等可以准确识别腔隙性脑梗死、脑白质病变、脑微出血、血管周围间隙、脑萎缩等。每一个序列都反映特定的组织特征。

　　1.腔隙性脑梗死

　　腔隙性脑梗死（lacunar infarction，LI）多分布于皮质下直径为3～15mm的圆形或卵圆形、与脑脊液信号相同的病灶。磁共振FLAIR图像显示中央脑脊液样信号,由环形高信号边缘包围，边缘并不总是存在的，当它们穿过白质高信号区域时，高信号的边缘也可以包围血管周围的空间。在T1和T2上出现类似于脑脊液的高信号,弥散加权成像(DWI)上信号无增强。某些情况下，FLAIR不会抑制中央腔液体，尽管MRI在其他序列(如T1加权和T2加权MRI)上有清晰的脑脊液样信号，但病变可能表现为完全高信号。有研究表明腔隙性脑梗死是信息处理速度和执行功能受损的重要标志，是VCI的重要预测因子[11]。腔隙性梗死也是VCI的结构磁共振的标志物[12]。既往研究表明LI的损害部位决定了认知功能的损害。丘脑通常表现出全脑认知功能损害，若LI出现在丘脑，则会出现运动能力、执行功能降低，而颞叶、海马、基底节的LI则会表现出记忆功能下降［13］,LI数目越多，多领域认知功能损害越明显[14]。

　　DTI即弥散张量成像，可检测脑内神经纤维束是否完整以及反映脑内水分子的弥散运动。平均扩散率（mean diffusivity，MD）、分数各向异性（fractional anisotropy，FA）均是DTI的常见参数，一个是衡量水在白质中扩散的大小，一个则提供了有关水扩散方向性的信息。有研究提示在LI的急性期，梗死在相位细胞毒性水肿的组织平均弥散率显著减少，亦或是早期血管源水肿的脑组织，脑梗塞、血管内皮细胞功能受损、细胞通透性增加、细胞间水积累导致血管源脑水肿的发展时，水分子扩散能力进一步下降，MD值进一步降低。与此同时，由于蜂窝结构损伤和组织显微组织的损失，各向异性显著下降和FA降低。LI梗塞的MD值均显著低于这些LA病变由于缺血区域中总的自由水分子扩散的减少。多项研究通过对腔隙数量、体积以及认知功能的分析发现LI是认知障碍患者比较重要的预测因子[15]。Andrew等人[16]在对腔隙性脑梗死患者5年的随访期内，网络整体效率的下降速度预测了转化为痴呆症和认知能力下降的可能性。

　　2.脑白质高信号

　　脑白质高信号（white matter hyperintensity，WMH）在磁共振T2和FLAIR序列中显示高信号，在T2加权MRI上观察到的WMH在老年人中极为常见。主要分布在白质区域，多分布在脑室周围、大脑半球的深部白质、基底神经核区、脑桥，有时是小脑和脑干，但在T1上表现为等信号或不及脑脊液样低信号的低信号，通常很难找到，T1上脑白质的信号的程度取决于序列参数、病变的严重程度。研究显示白质高信号与隐蔽的神经和认知症状以及步态障碍等身体障碍有关[17]。通过影像学研究发现WMH与包括注意力、执行能力、处理速度等的特定认知领域的损害具有很强的关联[18]。区域性WMH负担与衰老相关的脑萎缩之间存在高度相关性以及与认知表现相关的特定脑区皮质厚度减少[19]。

　　弥散加权成像(DWI)早期研究使用DWI计算的痕迹/表观扩散系数(ADC)，在表征血管性认知损害中异常的WM区域研究显示：纵向研究显示随着WMH严重程度的进展，扩散增加；横断面研究中的主要观察结果是随着WMHs严重程度的增加ADC值增加；两者均有VCI有密切关系[20]。但是DWI模型在描述神经元组织中各向异性扩散方面的局限性导致了在以后的SVD研究中使用DTI模型。白质的损伤大致伴随着MD的增加和FA的减少。O’Sullivan等[19]观察缺血性脑白质疏松患者侧脑室前角白质FA和半卵圆中心的DA与认知功能的衰退明显相关。既往研究表明，VCI患者的全脑白质的MD值、FA值与正常人群相比存在显著差异，并且MD值的增加、FA值的减少均可降低记忆及注意执行功能的评分，他们存在正相关性，提示DTI反映的白质改变与认知表现存在相关性[21]。DTI全脑直方图特征显示1年内MD增加，FA降低，而丘脑和壳核DTI的显著变化与WMHs的增加有关[22]。研究显示DTI测量的白质完整性与认知障碍的相关性比缺血性病变的负荷更好[23]。

　　通过研究不同脑白质区域内病变体积与认知障碍之间的关系，发现脑室周围白质缺血性病变与额叶皮层变薄和执行功能障碍有关[24]。但是Delano等人[25]研究发现脑室周围白质损害与年龄相关，但不会影响认知功能，而深部白质损害可导致执行功能和视觉空间功能障碍命名和记忆功能则相对保留。Wright等人[26]大样本研究发现脑白质病变范围越大，其认知功能损害越严重，当白质损害累计体积超过整颅脑体积四分之三时，认知和感觉运动能力将受损明显，故脑白质病变范围决定了认知障碍的程度。Huijts等人[42]的研究是针对189例血管性认知障碍患者，他们发现严重的基底节区EPVs会造成程度较重的认知障碍，他们存在正相关性。但是有人发现EPVS并不是认知能力下降的预测指标。随着大型队列研究的开展，进行手动MRI分割变得越来越困难，对多模式、灵活、可自由使用的分割工具的需求变得更高。相对于以前的基于k-NN的分割方法，[27]脑强度异常分类算法BIANCA提供了不同的选项来加权空间信息，局部空间强度平均，以及不同的选项来选择训练点的数量和位置。Bianca是多模式的，并且高度灵活，因此可以根据他们的协议和特定的网络环境调整该工具。

　　在过去的20年中，使用各向同性高分辨率T1加权MR图像对脑体积的定量评估已被大量应用于评估衰老和神经疾病中发生的宏观结构改变。然而，体积评估并没有捕捉到大脑白质(WM)和皮质灰质(GM)固有的结构复杂性。这种复杂性可以用分形几何来研究，分形几何描述了在适当的空间尺度范围内表现出自相似性的对象的复杂性。分形维数(FD)是一种紧凑的、无单位的几何形状特征，它表示对象填满空间的程度[28]，并产生对象结构复杂性的单个量化指标[29]。大脑WM和皮质GM的FD可以使用常用的高分辨率T1加权图像来计算。脑白质和脑灰质FD值已被发现与老年人的认知表现呈正相关[30]。既往研究提示我们观察到脑血管病和轻度认知障碍患者大脑白质的平均FD为2.4650，明显低于健康对照组。众所周知，FD和体积检查和量化不同的结构方面，因此通常是相辅相成的。综上所述，结合大数据建议，在评估大脑皮层和皮质下脑白质时，应该使用不同的神经成像工具来获得显著的结果。

　　3.脑微出血

　　脑微出血（cerebral microbleeds，CMBs）定义为对T2加权磁共振序列中的磁化效应敏感，直径为2～5mm的圆形信号丢失，在其周围没有发现水肿，在SWI上的呈现形式为低信号，在MRI上为多发性微小信号丧失，大多位于基底节或皮质下区域。它们不仅是未来脑叶内出血的预测指标，而且与认知能力下降独立相关。微量出血也可能对应于血管周围间隙内含铁血黄素的巨噬细胞的局灶性堆积，并且有证据表明血红素降解活性，周围有激活的小胶质细胞的炎症反应，晚期补体激活和凋亡。偶尔发现微量出血周围有胶质增生和不完全的缺血性改变。既往研究发现头顶枕叶和脑岛中的CMBs的增加与执行功能缺陷相关[31]。相关脑微出血研究[32]应用SWI技术检测颅内脑微出血病灶，VD患者的额叶、颞叶皮质下、基底节区及丘脑更容易出现微出血灶，与无VD患者相比，其发生率显著增高。高晓嵘等[33]通过对80例脑微出血组及80例正常对照组应用SWI技术研究，发现前组患者脑微出血的数量较后组多，其抽象能力、视空间执行能力、注意力、定向力、记忆、语言及MoCA评分较差，提示认知功能障碍与脑微出血的数量呈显著的负相关。Ayaz等[34]人的一项纵向研究，通过运用磁共振SWI对患者的脑微出血检测发现，认知障碍患者病灶数目均随时间延长逐渐增加，且认知障碍程度均进行性加重。在社区人群的鹿特丹研究的基础上Akoudad等[35]同样发现：发生痴呆和认知障碍风险会随着脑微出血数量的增加而增加，他们密切相关；大脑中的微出血尤其是脑叶可导致时间、地点定向力，语言能力，即刻记忆以及延迟记忆，注意力及计算力，视空间等能力降低，若是其它部位发生脑微出血，会造成信息运动和加工速度快速下降。

　　研究发现多发性微出血(≥5)的存在与MoCA总分较低以及在认知测试的特定领域(如全局认知功能、信息处理速度和运动速度)的表现较差有关[36]。在健康成人中进行的横断面和纵向研究也表明，CMBs与较低的MMSE测试分数、较差的信息处理能力和较差的执行功能有关，特别是大量的CMBs[37]。有研究[38]发现深层或混合CMBs与言语记忆有关，与脑萎缩无关，这个发现可能提示丘脑核的破坏，与存储和短期记忆有关，与记忆障碍一致，其是AD的标志，也存在于血管相关的认知障碍中。一些研究表明脑微出血也受脑白质损伤影响。Akoudad等[39]研究提示脑白质完整性受损越明显，CMB数量越多。在常规MRI上看不到的组织损伤，可以在未来的研究中利用扩散张量成像或静息MRI等新技术进行评估。

　　4.血管周围间隙

　　血管间隙扩大（enlarged perivascular spaces,EPVS）是指与血管走行一致的穿过灰质或白质的充满液体的具有一定的生理和免疫功能的间隙。动脉、小动脉、静脉和小静脉周围的脑外液体间隙的延伸。在高分辨率下，偶尔可以在血管周围间隙的中心看到中央血管。血管周围间隙通常在下基底节最为突出，也可见向心性穿过半球白质和中脑，但在小脑中很少见到。腔隙和扩大的血管周围间隙之间的一个区别特征可能是腔隙通常更大(>3 mm)，并可伴有病灶周围信号改变。扩大的血管周围间隙在影像学上多表现为边缘光滑且无占位效应的圆形、椭圆形或线形，T1图像上的信号强度同脑脊液相似，FLAIR图像上的信号表现为低信号，且没有高信号边缘。如果它们穿过白质高信号区域，在T2加权或FLAIR成像上会有围绕液体间隙的T2高信号边缘。

　　一些研究已经将更突出的血管周围间隙与较差的认知功能联系在一起。一部分研究[40]显示PVS与认知损害之间存在正相关关系。Maclullich等[41]研究年龄在65-70岁之间的老年人的头颅MRI资料中发现，颅内EPVs越多，其视空间能力和非语言推理能力等认知能力减退明显，他们存在明显的相关性。Huijts等[42]对189例血管性认知障碍患者进行磁共振检查发现，认知障碍损伤的程度受基底节区EPVs的严重程度的影像，他们存在负相关。有趣的是，有人发现PVS并不是认知能力下降的预测指标，Philip Benjamin等人[43]研究得出在5年的随访期内PVS与认知功能下降无关。

　　优先使用T2加权MRI来评估EPVS,EPVS在中到重度认知障碍患者中很难评级，因为它们经常被WMH掩盖[40、44]。使用T1加权成像测量容积是评估PVS负荷的另一种方法，在小血管疾病和WMH患者中可能更准确。除了混杂因素外，造成这种不一致的一个原因可能是因为Lacunes和EPVS很难区分。有研究者提出了一种基于学习的EPVSs自动分割方法，使用脑解剖结构和血管信息来确定感兴趣区域（region of interest，ROI）,在分割准确性方面超过其他EPVSs分割方法，可以用于EPVSs形态的定量研究[45]。EPVSs的定量研究也十分重要。随着7T MRI扫描仪信噪比的增加，即使在健康受试者扫描的MRI图像中也可以显示EPVSs[46]。

　　5.脑萎缩

　　脑萎缩（encephalatrophy）是指由各种原因导致脑组织本身发生器质性病变而产生萎缩的一种现象。临床症状多为时间及定向力下降，语言功能障碍等高级智能功能减退。许多影像学研究报告了脑萎缩的严重程度以及全局、胼胝体、中枢(脑室大小和基底节)、中脑等部位影响着认知障碍的严重程度。全局性和局灶性萎缩的进展程度和速度与认知恶化和转化为痴呆症有关。Van等[47]通过观察大量具有轻度认知障碍患者的脑MRI资料发现多数患者大脑内侧颞叶发生器质性病变，萎缩是其特征性改变。研究基于体素的形态测量比较了有一个或多个认知领域损害的缺血性卒中患者的灰质体积[48]，结果提示认知障碍组年龄较大，受教育年限较短，更大的病变体积，以及多个认知领域的缺陷，包括定向、注意力、工作记忆、语言、视觉空间技能、精神运动速度和记忆；与那些丘脑、额叶、颞叶、顶叶和枕叶没有认知功能受损的患者相比，有认知障碍的缺血性中风患者的灰质体积显著减少，且主要部位在丘脑。一项研究发现，在非痴呆老年人中，海马萎缩和WML的组合与认知功能障碍的风险增加有关[49]，而海马萎缩或WML本身与认知功能障碍无关。这些发现表明，大脑中血管病变的存在放大了海马萎缩与认知功能之间的联系。在动脉粥样硬化性疾病患者中，较小的总脑体积、较大的脑室体积和较小的皮质灰质体积与较差的执行能力相关，并且这种关联随着脑血管病变的存在而变得更强[50]。一项多中心横断面及纵向研究显示脑萎缩可增强脑白质疏松及腔隙性脑梗死对认知功能的影响，该研究还指出脑萎缩可能会掩盖脑白质疏松对认知功能的影响[51]。且脑萎缩和WML在认知功能上有协同作用。同时通过结构影像学研究得出腔隙性梗死与不同萎缩程度的脑运动速度纵向下降之间的协同作用。也有研究提示皮质萎缩是步态障碍的一个神经影像学标志，这种相关性也可能由额叶、顶叶和双侧胼胝体白质的FA介导[52]。有研究表明皮层下萎缩显著预测了所有认知指标的变化，而皮层萎缩只与精神运动速度的下降有关。一项在MRI薄层T1成像上进行的对短暂性缺血性卒中患者的特殊评估发现萎缩是显著的，而且影响前循环的TIA患者在TIA后3个月丘脑远端萎缩约10%，这导致3个月内MoCA的认知能力平均下降11%[53]。

　　在临床中VCIND是一种常见且损害患者脑功能的一种疾病，因此明确该病的高危因素、临床表现及影像学表现，及时诊断并寻找出有效的治疗方法至关重要。目前诊断主要依靠影像检测，由于对VCIND的影像学证据和其诊断标准并不是很统一在临床中，通过MRI技术对VCIND患者进行研究，发现其相应的影像学标志物，从而对预防和及早干预血管性认知障碍，并减少血管性痴呆疾病的发生。

　　本研究采用临床评估结合神经心理学量表测评的方法在牡丹江医学院红旗医院招募右利手VCIND 42人，认知正常对照组23人。在牡丹江医学院伦理委员会的批准下征得所有被试者的同意并且签署知情同意书。

　　1.1.1 VCIND入组标准：根据中国血管性轻度认知损害诊断指南（2016）[54]进行收集。

　　（1）患者或知情者或医生证实认知功能较前有轻度下降至少一个认知功能领域的损害证据，认知障碍由脑血管病导致，符合以下标准：

　　A.存在高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟等心脑血管病危险因素。认知损伤发生在脑血管事件3个月内；或存在信息处理速度和/或执行功能障碍且具小便、人格异常特征之一，但无脑血管事件发生；

　　B.有脑血管病导致的局灶症状或体征，如白质损伤、腔隙性梗死和微出血等；

　　C.辅助检查有脑血管病病变的证据：影像学评估涉及脑梗死、白质高信号、出血、血管间隙扩大等方面。

　　（2）日常生活能力正常或轻微受损，有独立生存能力；

　　1.1.2 VCIND排除标准：

　　（1）引起认知功能障碍的神经系统其他疾病（如脑肿瘤、帕金森病、脑炎等）、脑外伤导致的认知障碍；

　　（2）甲状腺功能异常、严重贫血、梅毒、HIV等其他可引起认知损害的疾病；

　　（3）有精神病史者；

　　（4）不能配合完成检查者。

　　1.1.3认知正常对照组入组标准：

　　选取同期入组年龄、性别、受教育程度相匹配的右利手健康受试者。

　　（1）没有认知下降主诉；

　　（2）校正了年龄、性别、教育程度，在标准化认知功能检测中成绩在正常范围内；

　　（3）神经系统检查与大内科检查没有阳性症状与体征；

　　（4）病史包括现病史、既往史、家族史等阴性，查体无阳性所见，既往神经影像学等辅助检查资料无可引起认知损害的阳性所见。

　　1.2.1详细记录患者一般资料及病史等材料。

　　1.2.2神经心理测验主要包括：

　　1.2.2.1简易智能精神状态检查量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)：该测试用于筛查认知功能障碍，由多个认知评估测试组成。MMSE中文版采用张明园修订版。低于以下分数则可诊断为认知障碍：MMSE评分≤19分(文盲），≤22分(小学），≤26分(初中及以上）。

　　1.2.2.2蒙特利尔认知评估（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）：一个用来对轻度认知功能异常进行快速筛查的评定工具。MoCA中文版采用北京版。MoCA评分≤13分(文盲），≤19分(小学），≤24分(初中及以上）。

　　1.2.3影像学评估：

　　使用荷兰飞利浦公司3.0T TX磁共振仪进行影像学检查。所有受试者均接受T1、T2、弥散加权成像、液体衰减反转恢复序列以及磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging，SWI)，以识别各种标志性影像学改变。获取sMRI数据，对sMRI数据进行分析，拟采用SPM8包完成。其中T1结构像：选用SPGR序列，TR=1.9s，TE=2.48ms，FA=9°，FOV=256mm×256mm，MATRIX=256×256，层厚1mm，176层。

　　采用总SVD评分项目[55]包括：腔隙性数量≥1个，CMBs数量≥1个，EPVS,WMH脑室周围Fazekas评分≥3分或深部，上述项目各计1分，各项相加为总SVD评分。(采集入组患者头部磁共振成像例图如下图1、2、3、4)

　　1.腔隙性脑梗死2.脑微出血3.血管周围间隙4.脑白质高信号

　　1.3.1实验仪器

　　1.3.3软件与网络资源

　　表3主要实验软件与网络资源

　　软件版本开发商或网址

　　实验涉及1 Primer 3 online Version 0.4.0 http://frodo.wi.mit.edu/

　　2 Oligo Version 6.31 Molecular Biology Insights Inc.,USA

　　3 NCBI（National Center for Biotec-hnology Information）/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

　　1.3.4目的基因引物序列

　　DNA提取收集空腹静脉血5ml并置于-80℃冰箱中，分批进行DNA的提取。

　　研究中SNP基因库信息来自公共数据库NCBI GeneBank数据库，查询基因CLU标准序列。其序列号为rs11136000及rs9331888位点。采用Primer Premier 3.0软件设计SNPrs11136000及rs9331888位点的KASP引物rsl1136000snp位点Primer Allele FAM引物序列为5'-CCCTGAATCTTACCTTTCTATTGC-3',Primer Allele HEX引物序列为5'-AAACTCCTGACCCCAAGTAATATG-3'，rs9331888snp位点Primer_Allele FAM引物序列为5'-CAATTCCCTTCGGAGAGTAGAG-3',Primer_Allele HEX引物序列为5'-GAAAGGGTCCATTGTGTAAGAC-3'。

　　1.3.5文库制备

　　1.3.6多重PCR的引物调整。以多重引物工作液对质控品及NTC进行首轮扩增，将扩增后的产物稀释后进行二轮扩增。

　　1.3.7扩增结束后，将3%琼脂糖凝胶，PCR产物上样5ul进行电泳，观察电泳条得纯度等。

　　1.3.8稀释小样本后，根据Ct值调整初始的多重引物mix。

　　1.3.9经过PCR扩增进行产物生产。

　　1.3.10扩增结束后，将PCR产物进行电泳检测，3%琼脂糖凝胶，PCR产物上样，观察电泳条带是否均一，是否有杂带等。

　　1.3.11文库混样。用孔板将产物转移至U型槽中，然后用移液枪将U型槽中的产物mix转移至圆底离心管中，涡旋震荡，最后将产物mix震荡过夜。

　　1.3.12纯化。将混样后的文库电泳完毕后，割取目标片段，将片段切碎加入内置凝胶的EP管中混匀直至胶块完全溶解。再加入平衡液BL，漂洗液PW，重复、离心，收集DNA溶液。

　　1.3.13稀释。纯化产物精确定量并稀释至测序所需浓度。

　　1.3.14高通量测序

　　1.3.15桥式PCR。将双链DNA文库变性为单链，杂交，与引物合成，以合成的第一链为模板进行循环的桥式PCR。

　　1.3.16测序反应。桥式PCR产物上机测序，操作流程按照标准SOP进行。

　　使用社会科学统计软件包（SPSS，21.0）进行统计分析。使用卡方检验、独立样本T检验评估人口统计学变量的分类。采用卡方检验进行HardyWeinberg平衡定律吻合度，检验采用卡方检验、随机区组设计资料的多因素方差分析进行比较。所有的统计检验都是双侧概率检验，检验水准以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　1.人口学资料及血管性危险因素的比较

　　VCIND组和对照组在年龄、性别、种族方面，P＞0.05；两组在吸烟、饮酒史、糖尿病、心脏病、高脂血症等方面，P＞0.05，无统计学无差异，在高血压方面有统计学差异(P<0.05)，高同型半胱氨酸(P=0.071，＜0.1)，其存在较弱显著性(见表4)。

　　rs11136000snp位点实验组与对照组SVD总分对比，F＝12.869，P＜0.001，总SVD评分存在显著性，提示CLU基因rs11136000位点与VCIND影像学存在交互作用（表11）；携带rs11136000snp位点的两组比较，在腔隙性脑梗死、脑白质高信号中，P＜0.05（表12）。rs9331888snp位点实验组与对照组SVD总分对比，F＝11.288，P＜0.001，总SVD评分存在显著性，提示CLU基因rs9331888位点与VCIND影像学存在交互作用（表13）；携带9331888snp位点的两组比较，在脑白质高信号、血管间隙扩大中，P＜0.05（表14）

　　血管性认知障碍是指导致任何程度的认知损害的各种血管性脑部病变，范围从主观认知能力下降到痴呆。典型的VCI患者经常出现心理迟缓和执行功能等问题，包括高级认知功能，如记忆力问题、行为症状和心理症状，以及冷漠、焦虑和抑郁。其他神经体征和症状也经常会发生，包括反射不对称、构音障碍、肌强直、尿失禁或帕金森综合征。痴呆症影响着全世界4750万人，这个数字预计每20年翻一番。痴呆症人群给全世界的医疗保健系统带来了巨大的压力[56]。除了使负担过重的医疗系统不堪重负之外，患者的生活质量以及包括死亡在内的不良后果风险增加。血管性痴呆患者从确诊开始的中位生存期为3至5年。VCIND是具有高危险性转化为痴呆的血管性痴呆的早期阶段。我国的一项对VCIND患者随访2年的研究发现其演变为痴呆的比例高达40%[3]。因此，及早进行对VCIND的干预至关重要。对于VCIND，目前还没有明确的遗传危险因素，如果能够寻找简单的遗传和生物诱发因素将会预测VCI疾病的发生并及早干预，将会大大降低血管性痴呆的发生率。

　　预防VCI的大多数危险因素是可以改变的，因此，针对这些危险因素可能会降低VCI的发生率。根据对大型数据集和计算机模型的分析，导致血管性痴呆的七个最常见的可干预的危险因素：肥胖、高血压、糖尿病、高胆固醇、吸烟、低教育水平和心血管疾病，消除这些危险因素估计将减少痴呆症病例的三分之一[57、58]。本研究结果提示高血压与认知障碍具有相关性，高同型半胱氨酸血症与其具有弱相关性，而吸烟、饮酒史、糖尿病、心脏病、高脂血症等P值＜0.05，不具有统计学意义。高血压促进认知功能下降的机制可能是多方面的，有强有力的证据表明瞬时改变血流影响血管运动能力的功能变化，高血压还会促进微血管稀疏、内皮功能障碍、血脑屏障破坏、神经血管耦合减少、神经炎症反应等，从而导致脑部缺氧引起神经功能障碍[59]。一项前瞻性、以社区为基础的檀香山亚洲老龄化研究发现中年期血压升高而未降压治疗者VaD的风险增加[60]。Tzourio等[61]通过4年的随访发现有高血压病史的老年人认知功能下降的比例是无高血压病史的2.8倍。同型半胱氨酸转化成的半胱氨酸减少，则谷胱甘肽水平下降，导致活性氧增加、氧化应激，从而导致脑部缺氧。既往研究[62]证实了同型半胱氨酸水平的升高与执行功能障碍表现的降低之间的正相关关系。以上结果均支持我们的研究。然而在本次研究中不具有统计学意义的危险因素考虑可能受本次样本量影响。

　　语言和视觉建构领域的损害以及注意力、言语和视觉记忆、视觉运动速度和执行功能领域的损害等功能缺陷均能被MMSE和MoCA量表迅速检测出。目前，被最广泛应用的认知功能评估量表是MMSE量表，因为它具有高敏感性、高特异性且简便的特征。本研究结果显示VCIND患者与认知正常患者在视空间及执行功能、语言、即刻和延迟记忆力、定向力、抽象等方面均存在显著差异。海马-颞叶-皮层下功能通路功能障碍或血管性病变引起海马和皮质萎缩均可产生记忆功能受损；额叶-眶面外侧环路及前扣带回环路、前额叶-丘脑背内侧核环路参与情绪及抽象思维的控制、颞叶与记忆环路、基底节区参与皮质－纹状体-苍白球-黑质-丘脑-皮质环路系统等通路受损，则会出现相应的执行功能障碍、精神障碍等。一项研究[63]提示视觉运动处理速度障碍是VCI患者中最常见的认知域损害，可高达61.4%。研究表明视觉执行功能的认知障碍可以预测卒中后的不良生存率[64]，而VCI的严重程度与痴呆相关，通过MoCA筛查VCI的严重程度可以帮助临床医生进行干预和改善预后[65]。MoCA量表能够评价的认知领域更多且更加复杂，更加强调了对执行功能和注意力方面的认知功能的评估，可能在执行功能和注意力方面功能更突出，但也有研究[66]提示可能因为执行功能的测试非常简短，MoCA在中重度的认知障碍中差异并不明显。Gluhm等人[67]研究得出结论：在40岁以上的患者中，MoCA在记忆、语言和视觉空间能力领域检测到的百分比高于MMSE。本研究结果在MMSE与MoCA的亚项方面均有统计学差异，未表现出明显的不同，第一有可能与样本量较少有关，第二可能是入组患者来源于病房，曾多次发生脑血管疾病，整体认知障碍水平中、重型较多，本研究有超过50%的患者多个领域受损。第三VCIND患者可能也有潜在的AD[68]；因此，执行功能障碍可能不是最显著的特征。

　　本研究在VCIND组与认知正常组的比较中发现CLU基因的rs11136000snp位点携带者更容易出现认知障碍。考虑CLU基因多态性从以下方面影响血管性认知障碍的发展。

　　一、CLU基因多态性的表达可使颅内Aβ的沉积增加，破坏血脑屏障，造成大脑功能障碍和损害。CLU编码的糖蛋白在淀粉样蛋白斑中沉积，结合可溶性Aβ肽，与Aβ相互作用影响其构象和毒性，也参与血脑屏障Aβ的清除[69]。一项小鼠模型证明没有ClU的情况下，Aβ的清除转移到更多的血管周围引流[70]。相关研究[71]提示CLU聚集素不仅存在于斑块，而且还存在于大脑内的小动脉和毛细血管。Aβ可能通过降低脑灌注、减少血管储备和增加缺血性损伤而导致血管调节失调。Hee小组[72]研究表明：大约30%的皮质下血管认知障碍，其特征是广泛的脑小血管疾病，在正电子发射断层扫描上有显著的Aβ负荷。Huang等人[73]的研究招募了5名因一侧颈动脉狭窄而患有脑低灌注的痴呆症患者，他们接受了18F-AV1451PET的检查，结果显示痴呆症和单侧颈动脉狭窄的患者与正常对照组相比，整体淀粉样蛋白沉积明显增加。动物研究[74]也表明，急性缺血增加了缺血损伤后不久Aβ前体蛋白的表达和Aβ的产生，从而增强了Aβ在脑中的沉积和清除。Ye等人[75]的研究使用了纵向的队列设计，结果表明淀粉样蛋白负荷独立地导致了小血管疾病患者的认知能力下降。一项相关研究[76]结果显示脑卒中患者血浆Aβ、β-42和tau水平虽低于AD患者，但均高于认知正常组，最重要的是，有痴呆症的卒中患者的Aβ-42血浆水平明显高于非痴呆症患者。一项对72例卒中后认知受损的患者的研究与随访发现[77]，选择入组患者均为非AD患者，与无Aβ沉积的病人比较，颅内存在Aβ沉积的病人在卒中后3年内认知功能下降显著。近期有研究发现，WML患者血浆Aβ水平升高与脑白质损伤严重程度及记忆力下降程度相关[78]。综上，CLU基因多态性的表达可使Aβ增加，从而改变大脑的血流调节，消耗血管储备，破坏血脑屏障，降低大脑的修复潜力，造成大脑功能障碍和损害。故CLU基因的多态性可能与血管性认知障碍的发病有关。本研究得出的数据如预期的证实了这一观点。

　　二、CLU基因多态性可能通过血脂代谢途径影响血管性认知障碍。血管内膜脂质集聚，脑血管内皮功能减弱,损害大脑的新陈代谢,继而出现认知功能障碍。相关研究[79]发现高脂血症患者的血清载脂蛋白J水平高于血脂正常的受试者。Anna Rull团队的研究[79]发现在致密高密度脂蛋白颗粒的子集中存在CLU表达的蛋白，它可以抑制脂质过氧化或降解生物活性的低密度脂蛋白氧化。一项研究是在日本人群中525名无症状的高血脂患者中检测CLU多态性，得出CLU基因多态性可提高女性胆固醇、低密度脂蛋白的水平，增加颈动脉内膜中层厚度，是斑块发生的独立预测因子[80]。既往研究表明血脂可增加血管内皮功能的损伤和血流动力学的改变，容易造成卒中及认知障碍的发生[81]。在曼哈顿北部卒中研究[82]—以人群为基础的病例对照研究中，高密度脂蛋白水平的升高与老年人以及不同种族和民族之间卒中风险的降低有关，增加了与卒中相关的脂质证据；在一项关于颈动脉斑块形态相关危险因素的基于人群的横断面的病例对照研究中[83]，发现有回声斑块的受试者未来发生缺血性脑血管事件的风险更高。在动物研究中也发现了同样的现象，给大鼠长期进食富含饱和脂肪和胆固醇，其血脑屏障通透性增加，同时伴随着认知障碍［84］。结合上述结果，CLU基因多态性可能通过加剧脂质沉积造成血管性认知功能障碍。

　　我们还发现VCIND在核磁共振上表现为腔隙性脑梗死、脑微出血、脑白质高信号、血管周围间隙扩大。且在腔隙性脑梗死、脑白质高信号、血管周围间隙扩大中P值均＜0.05，腔隙性脑梗死占90.5%，脑白质高信号次之，占50.0%，血管间隙扩大占42.9%。小血管疾病是血管性认知障碍中最常见的损害；小血管疾病以动脉硬化和腔隙性梗死为特征，可引起皮质和皮质下微梗死，并对白质造成弥漫性缺血性损害[85]。Hanna Jokinen等人[86]在3年的随访中发现：在MRI测量的多变量模型中，总的WMH、腔隙仍然是认知功能的独立预测因子。上述结论与本研究的结果相同。其机制可能是阻断了脑内传导通路从而导致认知功能障碍。既往Reitz等人通过对LI对VCIND患者的影响的研究发现：额叶与运动性活动和判断、记忆、抽象思维、情绪、心境等精神活动有关；颞叶与行为、精神、记忆有关；内囊前肢、膝部参与投射到额叶或颞叶的路径；丘脑受损后易产生记忆、言语、定向障碍，故上述部位的腔隙性脑梗死也会引起明显的认知功能障碍[87]。脑白质联系着联合纤维、联络纤维、投射纤维，脑白质的损伤可导致各个脑区的信息传递中断，同时也会导致广泛的胆碱能系统受损，从而导致认知障碍。Chua等人[88]证明VCIND患者有更广泛的脑白质改变所有幕上白质，包括额叶、顶叶、颞叶、枕叶和胼胝体。Wright等人[26]大样本研究发现脑白质病变范围越大，其认知功能损害越严重，当白质损害累计体积超过整颅脑体积四分之三时，认知和感觉运动能力将受损明显，故脑白质病变范围决定了认知障碍的程度。Huijts等人[42]的研究是针对189例血管性认知障碍患者，他们发现严重的基底节区EPVs会造成程度较重的认知障碍，他们存在正相关性。但是有人发现EPVS并不是认知能力下降的预测指标，Philip Benjamin等人[43]研究得出在5年的随访期内EPVS与认知功能下降无关。这点与本研究结果不同，可能存在EPVs与Lacunes难以区分，或者被WMH掩盖。

　　CLU基因多态性与VCIND相关的影像学存在交互作用P＜0.01，具有较强的相关性，因此携带CLU基因rs11136000位点、rs9331888位点的VCIND患者颅内更易表现出腔隙性脑梗死、脑白质疏松、血管间隙等影像学变化，导致认知障碍。更加证实了CLU基因多态性通过使颅内Aβ的沉积增加，破坏血脑屏障，造成大脑功能障碍和损害；通过影响血脂代谢途径，使血管内膜脂质集聚，脑血管内皮功能减弱,损害大脑的新陈代谢,继而出现认知功能障碍的可能。在亚组分析中，携带CLU基因rs11136000位点的VCIND患者中，腔隙性脑梗死、脑白质高信号更显著，携带CLU基因rs9331888位点的VCIND患者中，血管间隙扩大、脑白质高信号更显著，综上考虑CLU基因多态性的VCIND可能更多表现出脑白质高信号。深部白质是一个分水岭区域，容易受到血流量和氧气供应减少的影响。脂代谢异常可加重其缺血。Aβ的沉积可导致血脑屏障破坏，从而导致脱髓鞘改变，最终形成WMH，导致血管认知障碍。[89]。有在脑淀粉样血管病患者的研究中，淀粉样蛋白摄取与WMH相关，这表明WMH与淀粉样蛋白之间的相关性可能更强[90]。故CLU基因多态性通过使颅内Aβ的沉积增加，破坏血脑屏障，或脂代谢异常，造成WMH从而导致大脑功能障碍和损害的可能性大。上述结果仍需扩大样本量进一步证实。本研究以一家医院为基础，样本量相对较小。今后应推广以人群为基础的多中心研究和大样本量相结合的研究。另外，CLU基因最初被认为与AD有关的认知障碍密切相关，对于其与血管性认知障碍的研究较少，可加强纵向随访、增加相关研究。

　　1.高血压、高同型半胱氨酸血症是VCIND的独立危险因素。

　　2.VCIND患者的主要表现在视空间及执行功能、注意力及计算力、命名、语言功能、记忆力、定向力、抽象力降低，认知的损伤为多领域。

　　3.CLU基因多态性的rs11136000SNP位点可以作为VCIND出现的生物标志物。

　　4.VCIND患者头部MRI表现为腔隙性脑梗死、脑白质高信号、脑微出血、血管间隙扩大；携带CLU基因的rs11136000SNP位点、rs9331888位点的VCIND患者更易出现上述表现。且CLU基因多态性与脑白质高信号的关系更明确。

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　　英文缩写英文全称中文全称

　　VCI vascular cognitive impairment血管性认知障碍

　　AD Alzheimer’S disease阿尔茨海默病

　　VCIND vascular cognitive impairment-no dementia with small vessel disease非痴呆型血管性认知障碍

　　VaD vascular dementia血管性痴呆

　　MD mixeddementia混合性痴呆

　　LI lacunar infarction腔隙性脑梗死

　　DTI diffusion tensor imaging弥散张量成像

　　MD mean diffusivity平均扩散率

　　FA fractional anisotropy分数各向异性

　　WMH white matter hyperintensity脑白质高信号

　　CMBs cerebral microbleeds脑微出血

　　EPVS enlarged perivascular spaces血管间隙扩大

　　DWI diffusion weighted imaging弥散加权成像

　　SWI susceptibility weighted imaging敏感加权成像

　　T1WI T1 weighted MRI T1加权磁共振成像

　　T2WI T2 weighted MRI T2加权磁共振成像

　　FLAIR fluid attenuated inversion recovery磁共振成像液体衰减反转恢复序列

　　MMSE Mini-mental State Examination简易智力状态检查量表

　　MOCA Montreal Cognitive Assessment蒙特利尔认知评估量表