三叶青总黄酮提取工艺的优化

摘要: 目的:建立三叶青中总黄酮超声提取的最佳工艺。方法:通过正交实验优选了超声提取三叶青中总黄酮的工艺参数.通过单因素试验研究了不同工艺条件对三叶青中的总黄酮提取率的影响.结果:三叶青中总黄酮的优选提取工艺为:乙醇浓度为80%,液料比为1:40,

  摘要:目的:建立三叶青中总黄酮超声提取的最佳工艺。方法:通过正交实验优选了超声提取三叶青中总黄酮的工艺参数.通过单因素试验研究了不同工艺条件对三叶青中的总黄酮提取率的影响.结果:三叶青中总黄酮的优选提取工艺为:乙醇浓度为80%,液料比为1:40,提取时间30分钟,提取率为0.913%.结论:上述超声波法提取三叶青中总黄酮为经济、科学的提取工艺。
  关键词:三叶青;总黄酮;超声提取;紫外-分光光度法

  引言

  三叶青(Radixtetrastigmae),又名三叶崖爬藤、石老鼠、小扁藤等,为葡萄科崖爬藤属多年生藤本植物[1-2]。三叶青大多分布于广东,广西,浙江,江西,四川,贵州,X,湖北等地,主要生长在荫蔽地,阳光直射处会影响其生长,产量较为稀少。三叶青药用部位为块根、果实或是全草,具有清热解毒,活血祛风的作用。它可用于治疗肝炎,毒蛇咬伤,肺炎,扁桃体炎,高热惊厥,风湿等。近几年以来,人们发现三叶青在对抗各种炎症、抗癌抗肿瘤[3-4]、解热与镇痛[5]、保肝[6-7]等方面有明显的疗效。
  三叶青提取物之中含有药用的各种成分。三叶青总黄酮发挥抗肿瘤的效果是通过增进凋亡、调节免疫,并通过抑制病毒降低肿瘤风险[8]。三叶青在抗肿瘤药物开发方面显示了良好的应用前景,本文探讨了三叶青中总黄酮的超声提取工艺,为三叶青的进一步研究提供实验支持和参考。

  1材料与仪器

  1.1实验仪器
  UV-755紫外-可见分光光度计(上海昂拉仪器有限公司);DFY-500中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司);BS224S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,万分之一);KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);W201B数显恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司)。

  1.2试剂

  NaNO2溶液;Al(NO3)3溶液;NaOH溶液;无水乙醇。

  1.3药材

  三叶青(浙江泰丰生物科技有限公司);芦丁(上海源叶生物科技有限公司)。

  2方法

  2.1标准曲线的制作[11]

  精密移取芦丁标准品溶液2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml将其分别置于10ml的容量瓶中,再依次加入5%NaNO2溶液,并摇匀,放置6分钟,然后分别加10%Al(NO3)3溶液,摇匀,放置6分钟,之后依次加入1mol·L-1NaOH溶液10mL,定容至刻度,摇匀,静置到15min时,于510处测吸光度(A)。

  2.2单因素试验设计

  称取0.25g三叶青的粉末放置于10ml锥形瓶中,用超声波辅助提取。分别改变其液料比、乙醇浓度、提取时间,进行单因素实验。超声提取后的供试品进行滤过,精密量取1ml,用NaNO2-Al(NO3)3比色法来测定吸光情况,以求得总黄酮含量。

  2.3超声提取工艺参数优化试验

  本次实验是在参考文献[9]和单因素实验的基础之上,为了更好地研究三叶青总黄酮的超声提取工艺,影响因素选择乙醇浓度、提取时间和料液比三个方面,分别取3个水平,采用L9(34)正交表格[10]设计此次实验,其考察指标为总黄酮的含量,因此对三叶青总黄酮超声提取的工艺条件进行优化,各水平因素的安排见表3-1。
  表3-1正交试验因素水平
 三叶青总黄酮提取工艺的优化

  2.4方法学考察

  2.4.1精密度试验
  将芦丁对照品溶液用同样的步骤依次加入5%NaNO2溶液,并摇匀,使其静止大约6分钟,加入10%Al(NO3)3溶液,摇匀,再放置6分钟,然后分别加入1mol·L-1NaOH溶液10mL,定容至刻度,摇匀,再静置15min之后,测得吸光度(A)并吸光度计算RSD。
  2.4.2稳定性试验
  精密量取同一供试品溶液1ml,在室温的条件下,分别再配后的60、120、180、240、300min经过NaNO2-Al(NO3)3比色法后,在波长510nm处测吸光度(A),并计算吸光度的RSD值。
  2.4.3重复性试验
  依照正交试验选出的最佳工艺,平行制备6分供试品溶液,依次取续滤液1ml,经过NaNO2-Al(NO3)3比色法的处理,在紫外波长510nm处测吸光度(A),并计算得出三叶青总黄酮的含量(mg/g),同时计算总黄酮含量的平均值与RSD值。
  2.4.4加样回收率试验
  取6份约0.1g已知含量的干燥三叶青粉末,精密称定,之后分别加入精密量取的芦丁对照品溶液1.5ml,充分振摇均匀,然后在液料比1:40,乙醇浓度80%的条件下提取0.5h,过滤,取续滤液1ml,经NaNO2-Al(NO3)3比色法处理后,在波长510nm处进行测定,并计算出回收率和RSD,如表3-6,均符合要求。

  3结果与分析

  3.1标准曲线的建立

  横坐标为芦丁对照品浓度,纵坐标为吸光度,标准曲线绘制后,得线性回归方程Y=5.9864X-0.0139,R2=0.9992如图3-1。
  药学

 

  三叶青总黄酮提取工艺的优化

  3.2单因素实验结果

三叶青总黄酮提取工艺的优化
  由图1-3可知,超声波提取时间的增加,总黄酮的提取率也会有所增加,但随着提取的时间增长,也让无效成分的溶出量增多,从而提取效率被影响了,这大概是因为黄酮提取物被氧化发生改变。当乙醇的浓度增大,随之总黄酮的提取率增大,然后乙醇浓度继续增大,溶剂亲水性则相对降低,而黄酮为亲水性物质,导致提取率的降低。从单因素的实验得出进行正交试验的液料比为1:20、1:30、1:40:;提取时间为10min、30min、50min;乙醇浓度为30%、60%、80%。

  3.3正交实验结果

  表4-1可见正交试验结果,表4-2可见正交试验方差分析。
  表4-1正交试验结果
  三叶青总黄酮提取工艺的优化
  表4-2正交试验方差分析
三叶青总黄酮提取工艺的优化
  从表4-1中的数据得到,在所选因素的范围水平内,三叶青总黄酮提取率被影响的大小顺序是:乙醇浓度>液料比>超声时间。从方差分析可得到乙醇浓度A是三叶青总黄酮提取率最大的影响因素,并且是主要影响因素,提取时间B对提取率有一定的影响。根据正交实验结果,优选出最佳的提取工艺条件为A3B3C2。在乙醇浓度80%的条件下,在液料比1:40时超声提取30分钟。

  4方法学考察

  4.1精密度试验

  精密度试验结果如表3-3,表明仪器的精密度良好。
  表4-4芦丁对照品的吸光度
 
 三叶青总黄酮提取工艺的优化
 

  4.2稳定性试验

  稳定性试验结果如下表所示,说明样品在300min内稳定。
三叶青总黄酮提取工艺的优化
  表4-5三叶青总黄酮供试品的吸光度

  4.3重复性试验

  表3-5为重复性试验结果,说明方法重复性良好。
  表4-6三叶青总黄酮供试品的总黄酮含量
 三叶青总黄酮提取工艺的优化

  4.4加样回收率试验

  如下表所示加样回收实验的结果,说明该方法的可行性比较强。

  表4-7三叶青总黄酮的回收率测定结果(n=6)

三叶青总黄酮提取工艺的优化

  5讨论

  本文以三叶青块根为原料,建立了紫外-分光光度法分析三叶青总黄酮的方法,采用了NaNO2-Al(NO3)3[12]比色法,最大吸收峰出现在510nm。采用超声提取法,排除杂质的干扰,该方法简单、可行性高。且所得的实验结果比较准确,为三叶青总黄酮的研究提供依据。通过对方法学的考察,证实了该方法的稳定性并且线性关系较好。

  参考文献

  [1]江苏新医学院.中药大词典:下册[M],上海:上海人民出版社,1977:2123.
  [2]国家中医药管理局(中华本草)编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1999:296.
  [3]钟良瑞,魏克民.三叶青黄酮对肺癌A549细胞生长抑制与MAPKs通路关系的研究[J].中国药理学通报,2014,30(1):101-104.
  [4]李华美,浦锦宝,郑军献等.三叶青乙酸乙酯提取物对小鼠Lewis肺癌移植性肿瘤的抑制作用及免疫功能的影响[J].中国中医药科技,2012,19(3):229-230.
  [5]黄真,毛庆秋,魏佳平.三叶青提取物抗炎、镇痛及解热作用的实验研究[J].中国新药杂志,2005,14(7):861-864.
  [6]杨雄志,巫军.三叶青提取物抗乙肝病毒活性的研究[J].南京中医药大学学报,2009,25(4):294-296.
  [7]XuCai-Ju,DingGang-Qiang,FuJian-Yun.Immunoregulatoryeffectsofethyl-acetatefractionofextractsfromTetrastigmahemsleyanumDielset.GilgonimmunefunctionsofICRmice.[J].BiomedicalandEnvironmentalSciences,2008,214.
  [8]JuhuaZhou,DapingFan,XiaoyangLing.AntitumoractivityoftotalflavonoidsfromTetrastigmahemsleyanumDielsetGilgisassociatedwiththeinhibitionofregulatoryTcellsinmice[J].OncoTargetsandTherapy,2014.
  [9]王维华,吴志庄,牛广俊.超声提取三叶青总黄酮工艺研究[J].中药与天然药物,2016:3.
  [10]黎颖青,付金娥,韦树根.广西不同产地三叶青中总黄酮含量分析[J].农业研究与应用,2016:6.
  [11]高文秀,祝波.正交实验优选山楂中总黄酮的超声提取工艺[J].吉林化工学院学报,29:11.
  [12]何孝金.三叶青有效成分测定方法的优化及栽培三叶青的品质评价[D].福建农林大学.2015.
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