人体益生菌丁酸菌群检测方法的开发

　　摘要

人体肠道微生物对于人体有着不可或缺的重要意义，而现今主要的检测手段有下一代测序技术（NGS）、传统培养法、荧光原位杂交（FISH）和实时荧光定量PCR等，但这些研究方法有着操作繁琐、持续时间长、精度低、成本高、专业化程度高等缺点。我们本次研究准备开发一种TaqMan qPCR方法，该方法有着较高的精确度和灵敏度，可以为丁酸产生菌群的研究提供更可靠的数据。

我们本次研究检测的菌种是产丁酸菌群，为了设计出更准确，特异性更高的引物探针，通过NCBI的基因数据库得到产丁酸菌群的16s rRNA，通过Integrated DNA Technology中的RT-qPCR引物探针设计工具设计出对应的上、下游引物和探针组合。由于需要保证检测结果的准确，因此样本为人体粪便样本，采用QIAamp PowerFecal Pro DNA的样本试剂盒。采用粪便微生物DNA提取试剂盒提取微生物基因组全DNA，先用准备好的引物进行普通PCR扩增检测，经琼脂糖凝胶电泳验证后，再采用qPCR检测验证是否符合实验要求。

本实验通过设计出产丁酸菌群16S rRNA的引物探针组合，检测时间快速，通常在2个小时内就可完成；而且其操作简单，不需要二代测序文库的复杂构建，仅仅需要可靠的测试人员和检测结果，适用于各个领域的广泛微生物检测。

关键词:实时荧光定量PCR；产丁酸菌群；肠道微生物；引物探针

引言

“微生物群”的起源可以追溯到1900年代初。结果发现，包括细菌、酵母菌和病毒在内的大量微生物共存于人体的各个部位（肠道、皮肤、肺、口腔）[1]。此外，人类微生物群，也被称为“隐藏的器官”，贡献的遗传信息是整个人类基因组的150倍以上[2]。虽然“微生物群”和“微生物组”通常是可以互换的，但这两个术语之间存在一定的差异。微生物群描述了在定义环境中发现的活微生物，例如口腔和肠道微生物群。微生物组是指从环境中所有微生物中收集基因组，其中不仅包括微生物群落，还包括微生物结构元素、代谢物和环境条件。在这方面，微生物组包含比微生物群更广泛的范围。在本综述中，我们主要关注微生物群在人类健康和疾病中的功能。

微生物群的组成因地点而异。肠道微生物群被认为是维持我们健康的最重要的微生物群[4]。肠道细菌具有多种功能，例如食物发酵、防止病原体、刺激免疫反应和维生素产生[5]。一般来说，肠道菌群由6个门组成，包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形杆菌门、梭菌门和疣状菌门，其中厚壁菌门和拟杆菌门是主要类型[6]。研究最多的真菌（肠道菌群）是念珠菌、酵母菌、马拉色菌和枝孢菌[7]。除了细菌和真菌，人类肠道微生物群还含有病毒、噬菌体和古细菌，主要是史密斯分枝杆菌[8]。

在本研究中，我们重点研究肠道中的丁酸菌群。丁酸菌群与我们的健康密不可分，它产生的丁酸盐物质也与我们息息相关。产丁酸菌主要存在于盲肠和结肠，主要属于梭菌属、真杆菌属、梭杆菌属[9]。在人体肠道中含有大量的其他细菌，从几种细菌中检测出必需的丁酸菌并不容易，但近年来，分子生物学不断发展，人们进一步提高了检测微生物菌群的技术，特别是RT-PCR技术的成熟，我们的检测方法也得到了改进，变得多样化，其灵敏度和特异性都比传统的培养物分离检测方法高得多，人们可以更好地探索微生物肠道菌群，显着提高其效率，人们可以更好地分析粪便中的一些细菌。因此，我们以该方法为参考，通过科学的设计，开发出了丁酸菌群实时荧光定量PCR探针。

　　第一章文献综述

　　1.1立题背景

在微生物学中，常常需要对某种菌株进行定量或定性分析。常用的菌株鉴定方法有：形态学观察、遗传分析、血清分型和生化分析等。目前，当我们使用基因序列分析时，最常见的候选测序方法通常是16SrRNA和宏基因组测序。由于高通量测序技术的发展已经非常完善，许多基于16SrRNA基因的研究推动了微生物鉴定的进步。

在过去的十年中，细菌16S核糖体RNA基因（16S）序列已成为分析人类肠道微生物群微生物多样性的有用里程碑。对三个人类成体微生物群进行了大规模的16S系统型分析（仅按16S rRNA序列相似性分组），使用了395%序列同一性（%ID）的阈值和三个样品中的单个古菌系统型（史密斯美他白杆菌）在菌株水平上鉴定了99个系统型。拟杆菌属、真杆菌属、梭状芽孢杆菌属和瘤胃球菌属的成员是在成虫微生物群中发现的主要物种。在395种系统型中，约80%代表尚未培育的物种的序列16S分析揭示了人类肠道微生物群中存在大量不可培养的细菌。仅有高达20%的16S数据能够分配给过去四十年中在实验室成功培养的已知物种。另一方面，16S数据没有提供有关微生物群落功能特征的任何信息。

因此，基于培养和基于16S的方法对于进一步的研究，特别是功能分析具有重大局限性。宏基因组测序使全面探索这些复杂群落的生物学性质成为可能。这种独立于培养的方法包括对微生物群制备的微生物DNA进行鸟枪测序，微生物群包含直接从环境中分离的不可培养物种，然后对获得的基因组序列进行密集的计算分析。宏基因组学是收集和分析微生物群落中存在的基因信息的一种相当有效和有力的方法，因为细菌基因组中蛋白质编码区的比例可以高达80%，因此获得的大多数宏基因组序列至少包含与功能直接相关的部分基因区域。但是，宏基因组测序成本较高，准确性也不高。

因此，我们采用QPCR技术对特定的微生物菌株进行检测。这种方法快速、高效而且准确，相比其他检测方法具有很大优势。其原理是实时荧光定量PCR技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1.2肠道微生物群

肠道微生物平衡与人类疾病和健康密切相关。与身体的其他区域相比，人体胃肠道（GI）含有丰富的微生物群落，聚集了100万亿个微生物10。已经进行了广泛的研究，以揭示肠道微生物群与基本人类生物过程之间的重要关系。例如，目前的进展表明，人类微生物群与营养物质的提取、新陈代谢和免疫密切相关11。微生物群可能通过多种机制影响生物过程。对于从食物中提取能量和营养物质，微生物群起着至关重要的作用，因为多功能代谢基因提供了独立的独特酶和生化途径12。此外，维生素、氨基酸和脂质等生物活性分子的生物合成也高度依赖于肠道微生物群13。关于免疫系统，人体微生物群不仅通过产生抗菌物质来保护宿主免受外部病原体的侵害，而且还是肠粘膜和免疫系统发育的重要组成部分。

在健康条件下，肠道微生物群表现出稳定性、弹性和与宿主的共生相互作用。关于“健康”肠道微生物群的定义及其与宿主生理功能的联系，有很多研究。肠道微生物群由细菌、酵母菌和病毒组成。健康的微生物群落通常表现出高分类多样性、高微生物基因丰富度和稳定的核心微生物群14。由于微生物群在人类福祉中起着重要作用，也积极参与多种生物过程和疾病发展，因此对人类微生物群的研究正在超越成分研究和成员协会调查。具体而言，人们越来越关注解释微生物群功能的因果关系，特别是随着高通量测序、微生物群互动建模和模拟新技术的蓬勃发展。总体而言，仍需要进一步研究以揭示人类微生物群的作用，以支持基于微生物组的诊断和个性化医疗的发展。

益生菌被定义为“当以足够的量施用时，会给宿主带来健康益处的活微生物”。作为益生菌菌株来源的多种发酵产品，如酸奶、开菲尔、酸菜、豆豉和辛奇，是不同文化中人类饮食的一部分。根据目前的知识水平，益生菌包括细菌（乳酸杆菌、乳球菌、明串珠菌、足球菌、丙酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、一些链球菌、肠球菌、大肠杆菌）和酵母（酵母菌属）。

许多因素会影响益生菌的有效性，包括益生菌与宿主及其微生物组的相互作用。为了产生积极影响，益生菌必须通过免疫、激素和神经元操作，化学或物理抑制致病菌（例如粪肠球菌、肠道沙门氏菌肠道血清型肠炎沙门氏菌亚种、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）的生长。重要的是，它们还要刺激有益微生物的生长。

越来越多的研究声称益生菌可以缓解许多与免疫系统、心血管健康、癌症转移、抑郁、焦虑、2型糖尿病和肥胖有关的疾病。最近，不同益生菌作为不同属、物种和菌株的功能的安全性，以及它们与不同个体或高危人群的相关性，引起了人们的关注。粮农组织/世界卫生组织（粮食及农业组织/世界卫生组织）2002年的益生菌评估指南报告说，益生菌理论上可能与患有基础疾病的患者的特定类型的副作用有关。高危人群的广泛特征是免疫系统减弱、肠道生态失调和/或肠道屏障受损，因此，仔细评估与故意使用益生菌相关的安全性非常重要，丁酸菌群也为益生菌的一种。

　1.3丁酸菌群简介

肠道微生物群由超过100万亿种细菌组成，包括1000种不同的物种，对人类健康产生重要影响15。丁酸是一种在肠道调节性T细胞成熟中起重要作用的物质1617，由丁酸产生菌（BAPB）产生，如部分短链脂肪酸（SCFA）（拟杆菌目）；梭状芽胞杆菌、真杆菌和梭状芽胞杆菌目。报道称，在某些疾病患者中，如特发性肾病综合征1819、食物过敏20、脑血管疾病21和2型糖尿病患者中2223，肠道内BAPB和粪便丁酸浓度下降。因此，增加肠道微生物群中的BAPB可能有助于预防和治疗各种慢性疾病。尽管益生菌已被广泛用于纠正肠道微生物群失衡，但其作用有限，因为大多数益生菌只通过肠道，而不驻留在和调节肠道微生物组成中2425。

　1.4丁酸菌群与人类健康的关系

　　1.4.1丁酸菌群与抗炎作用

人体的丁酸菌群会产生大量的丁酸物质。大量证据表明，异常量的脂质、高血糖和胰岛素敏感性受损都可能导致内皮功能障碍和低度慢性炎症，这与心血管疾病有关2627。SCFA中的丁酸物质也具有非常有效的抗炎作用，可阻断炎症介质的释放，从而减少免疫细胞流入炎症部位，免疫细胞迁移，增殖并促进细胞凋亡28。

通过这种方式，由GPCRs激活介导的功能可以阻止白细胞通过内皮调节炎症过程29。此外，丁酸盐和乙酸盐已被证明通过增加一氧化氮（NO）的生物利用度并减少氧化应激，对血管紧张素II诱导的小鼠内皮功能障碍产生有益作用30。总之，丁酸具有抗炎作用，这是基于以上不同机制产生的。

1.4.2丁酸菌群和食欲和血糖的调节

已经证明，丁酸菌群产生的短链脂肪酸（SCFA）可以与肠道内分泌L细胞中的GPR41和GPR43结合，从而增加餐后肠道激素肽YY（PYY）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和胰高血糖素样肽-2（GLP-2）的释放31。这有可能改善血糖控制和食欲调节，因为GLP-1可增加胰腺的胰岛素释放，而GLP-1和PYY都是抑制食欲的激素32。GLP-2对于保持肠道完整性很重要33,34。

动物研究表明，丁酸盐通过促进肠道产生GLP-1和PYY以及保护肠道屏障来改善葡萄糖控制35,36。根据Sakakibara等人37的说法，基于体内和体外研究，SCFA还可以通过激活GPR43来增加食欲抑制激素瘦素的分泌

　1.4.3丁酸菌群和脂质代谢

丁酸菌群产生的SCFA物质可以作为肝脏脂质和胆固醇合成的底物进入循环，但也可以作为脂质代谢的调节因子。SCFA可以增强脂肪酸氧化和热量的产生，阻断脂肪酸合成，减少体内脂肪的储存38。血管生成素样4（ANGPTL4）是一种具有多种不同功能的信号蛋白，可在大多数组织中合成39。研究表明，ANGPTL4是对肠道微生物环境有反应的关键宿主蛋白。通过控制组织中脂肪酸的摄取和代谢，ANGPTL4可以改变人类的肥胖4041。特别是丁酸盐，

通过诱导人结肠细胞系中ANGPTL4的分泌来影响脂质代谢，从而刺激过氧化物酶体增殖物激活的受体γ（PPARγ），从而阻断脂蛋白脂肪酶（LPL）的活化42。LPL对于脂肪酸从乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDL）转移到脂肪细胞很重要43。此外，ANGPTL4在白色脂肪组织中的过度表达会减少脂肪量。

最后，丁酸盐通过解偶联蛋白（UCP）增加产热和脂质利用率。UCP在脂质代谢中起着至关重要的作用，并通过激活脂联素来改善脂质代谢。因此，可以得出结论，丁酸菌群产生的丁酸等物质对于人体健康具有重要意义。

1.5荧光定量PCR原理及介绍

诊断微生物学正处于一个新时代。在分子诊断领域，PCR已经广泛应用，现在已被接受为从许多样品和微生物类型中检测核酸的标准方法。然而，传统的PCR仍然是研究实验室中必不可少的工具。实时荧光定量PCR不同于传统的PCR技术，因为它更快速、更灵敏且可实时观测，同时将残留污染的风险降至最低。越来越多的化学品用于检测PCR产物，因为它们在实时荧光定量PCR期间积聚在封闭的反应容器内。

　1.5.1 qPCR技术

传统的诊断微生物检测包括显微镜检查、微生物培养、抗原血症和血清学。这些方法可能受到敏感性差、微生物生长缓慢或存活不良、检测窗口窄、解释复杂、免疫抑制、抗菌治疗、高水平背景和非特异反应的限制。因此，我们尝试使用qPCR技术进行检测。与传统PCR相比，扩增子的检测可以随着扩增的进展而可视化，这是一个受欢迎的可能性。这将PCR的作用从纯粹的研究工具扩展到多功能技术，允许为高通量和低通量临床微生物学实验室开发常规诊断应用分子生物学技术中，qPCR具有比普通PCR灵敏度高的特点，且检测结果准确性高，比普通PCR法高100-1000倍。

在此过程中，实时测定提供了对PCR动力学以及不同核酸提取方法的效率以及某些化合物在抑制扩增中的作用的见解。实时荧光定量PCR是核酸成功扩增的关键因素之一。如今，实时荧光定量PCR用于检测食品中的核酸、基因治疗方案中使用的载体、转基因生物以及人类和兽医微生物学和肿瘤学领域。荧光定量PCR的原理是在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

其中荧光定量PCR又分为两种方法且各有利弊：

01染料法

在国内，染料法一般采用DNA染料SYBRGreenⅠ。染料法使用简单，成本也相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。在染料法荧光定量PCR实验中，染料能够与双链结合，从而发光，而在游离状态下，SYBRGreen I发出微弱的荧光。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。但是染料法检测的是体系中的所有双链DNA，因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现，会极大的影响真实结果的准确性。

02 TaqMan探针法

PCR扩增时，在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。Taqman探针为一段线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（FAM或Hex等）和一个荧光淬灭基团，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号。当PCR扩增时（在延伸阶段），Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，这也就是探针法定量的原理。

相比之下，TaqMan探针比SYBRGreen具有更高的识别能力，这取决于所使用的引物和探针的特异性。为了保证实验的准确性和精确度的要求，本次实验中采用的方法是TaqMan探针法。以上就是qPCR的基本原理以及两种方法的选择。

　1.5.2 RT-qPCR技术

RT-PCR将逆转录反应与基于PCR的扩增结合，从mRNA中生成cDNA。一个RNA序列作为逆转录酶的模板。由此得到的单链DNA然后作为PCR的模板。针对已知mRNA编码区的引物将优化特定转录本的反应，也用于克隆。否则，多聚-dt寡核苷酸将通过退火到其poly-A尾巴来启动大多数mRNA。

RT-PCR可以作为两个单独的反应进行，也可以作为一个需要更具体的商业酶的单一反应进行。由于其敏感性，RT-PCR具有优势；它只需要相对较少的样本。例如，RT-PCR可以用于检测单个细胞的基因表达。

1.5.3标准曲线的制作

PCR阈值标准曲线基于PCR运行的初始阶段的指数模型，其中模板复制效率是恒定的循环到循环。因此，它要求阈值处于不高于复制效率从其初始值下降的扩增模板的水平。第二个要求是所有扩增谱（校准和测试）具有相同的初始效率。然而，可能未检查是否满足这些要求，并且似乎明显意识到阈值可以设置为高于效率从初始值下降的地方，而不损害结果有效性。阈值标准曲线法被认为是定量PCR的金标准，其基于PCR运行的初始阶段的指数模型。在文章、教程、商业指南等中提出的阈值标准曲线的直线模型的推导中，明确要求阈值处于放大指数的水平，即在运行的初始恒定效率阶段。

　1.6研究意义

实时荧光定量PCR检测对于研究微生物疾病非常有用，像近些年来的核酸检测采用的方法就是荧光定量PCR的方法，它们有助于阐明许多疾病过程。与非PCR技术相比，这使得实时荧光定量PCR的实施对许多人具有吸引力，现在我们要将这种技术应用于菌群检测上，在我们人体中，我们与大量细菌、古生菌、真核生物和病毒共生，它们统称为微生物群，分布在身体的不同部位。在人体肠道内就分布着大量的益生菌对人体起着不可或缺的作用，产丁酸菌群就是其中的一种，但对于这种菌群的检测方法我们还知之甚少，因此，我们本次课题就是要开发出对于丁酸菌群的QPCR探针，并使用这种方法更快更准确检测人体肠道内的丁酸菌群。

　第二章丁酸菌群实时荧光PCR检测方法

　　2.1实验仪器设备及试剂

　　2.1.1仪器设备

实验所需的主要仪器设备见表2.1：

　　2.1.2主要试剂

4S Green Plus无毒核酸染料上海BBI生命科学

　2.2方法

　　2.2.1靶标筛选

通过人类肠道宏基因组公共数据库（GMrepo：https://gmrepo.humangut.info./home）获得大量肠道微生物样本的数据，并在出现频率和相对丰度的条件下对样本数据进行筛选，得出所需的流行物种列表，选择从门到属与人类健康关联较大的靶标分类群选择到丁酸菌群的靶标。

　2.2.1 TaqMan qPCR检测方法的建立

为了识别针对特定肠道微生物群的引物和探针，分析基因序列以识别在给定群体中高度保守的区域以及足以将该群体与肠道微生物组的其他成员区分开来的区域。

首先使用NCBI设计引物和探针。在选择每个靶标的特定保守区序列后，通过NCBI-BLAST算法获得所选基因序列的物种特异性，设计参数（如引物长度、探针长度、扩增子长度、熔解温度、GC含量等）以获得更高的成功率。

使用primer 3.0软件设计了引物和探针，先前选择了每个目标物种的特定基因。选择目标基因的标准是：

（i）通过NCBI的BLAST算法1研究所选择基因/序列的物种特异性，

（ii）每个目标物种中只存在所选择基因/序列的一个副本

（iii）所选择序列适合primer 3.0软件设计引物和探针（例如，序列的GC含量）以达到更高的设计成功率。多重检测引物-探针集设计的参数（例如引物、探针和扩增子的长度，熔解温度和GC含量）是根据软件默认设置定义的。为了增加TaqMan探针的稳定性、特异性和灵敏性，每个探针都包含四个Locked Nucleic AcidTM（LNA）碱基。在表2中，总结了本研究中产生的目标菌群引物-探针序列的信息。

首先，通过进行NCBI的BLAST验证引物、探针和扩增子的特异性。然后，使用BLAST搜索将扩增子序列针对整个相应微生物基因组进行检查。在探针合成之前，通过在单重或多重PCR反应中使用常规PCR来检查所有引物对的特异性（由Sigma-Aldrich，德国合成），以研究目标物种预期扩增子的产生，以及验证非目标物种中没有产物的存在。为此，PCR混合物的10µL（最终体积）包含2µL绿色GoTaq反应缓冲液、0.05µL GoTaq DNA聚合酶（5 UµL-1；Promega，德国）、0.2µL的dNTP混合物（每种10 mM）、每个引物的适当量以达到单重PCR反应中的最终浓度为1.2µM或多重PCR中的0.8µM，以及0.7µL的DNA模板。单重PCR和多重PCR都在Eppendorf MasterCycler下进行，具体循环条件如下：95℃，5分钟；35个周期的95℃，30秒，45℃，30秒和72℃，20秒；最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物在含有GelRedTM染料（Biotium，Inc.，X）的2%琼脂糖凝胶（Roth，德国）中分析。

然后，每对引物分别在有或无DNA模板的qPCR运行中使用，以研究目标微生物中单个产物的扩增和引物二聚体的缺失。

接着使用PCR与qPCR扩增验证引物、探针的稳定性与特异性。通过BLAST搜索将扩增的序列与相应的微生物基因组进行比较，验证引物和探针靶向微生物的覆盖度。使用PCR扩增验证引物特异性，反应体系为50μL（最终体积）的PCR混合物由上游下游各1μL引物（终浓度0.4μM）、25μL Mix（2×Taq PCR Mix，Vazyme）和1pg~50ng DNA模板组成。得到PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证目的条带，再通过qPCR检测多重反应中所有引物的稳定性。

　2.2.3粪便DNA的提取

使用QIAamp®PowerFecal®Pro DNA Kit粪便DNA提取试剂盒用于从粪便和肠道样本中分离微生物基因组DNA，旨在用于含有粪便中常见的抑制物质的样品，如多糖、血红素化合物和胆盐。改进的IRT与更高效的珠打和裂解化学相结合，可以获得高质量的DNA，可立即用于下游应用，包括PCR、qPCR和下一代测序。QIAamp®PowerFecal®Pro DNA Kit粪便DNA提取试剂盒甚至可以有效地去除最困难的粪便类型中的PCR抑制剂。将样品加入到珠打管中，以快速和彻底地均匀化。细胞裂解是通过机械和化学的方法发生的。总基因组DNA以旋转柱的形式被捕获在硅膜上。然后将DNA从膜上洗脱，准备用于NGS、PCR和其他下游应用。

按照如下的步骤进行提取：

1.短暂地旋转电源珠子Pro管，以确保珠子已经固定在底部。加上250毫克的粪便和800µl的CD1溶液。漩涡会短暂地混合起来。

2.将PowerBead Pro管水平固定在一个涡旋适配器上，为1.5-2毫升的管(猫。编号：13000-V1-24)。漩涡下的最大速度为10 min。

3.离心P管15000xg1 min。

4.将上清液转移到一个干净的2 ml微离心管中（提供）。注意：预计将为500-600µl。上清液中可能仍含有一些粪便颗粒。

5.加入200µl溶液CD2，涡旋5 s.

6.15,000 x g离心机，共离1 min。避免将颗粒化，将高达700µl的上清液转移到一个干净的2 ml微离心管中（提供）。注意：预计将为500-600µl。

7.加入600µl溶液CD3，涡旋5 s.

8.将650µl的裂解液载入MB旋转柱上，以15,000 x g离心1 min。

9.丢弃流动通过液，并重复步骤8，以确保所有的裂解液都已经通过了MB旋转柱。

10.小心地将MB旋转柱放入一个干净的2 ml收集管中（提供）。避免飞溅到MB旋转柱上

11.将500µl的做好的EA添加到MB旋转列中。15,000 x g离心机，共离1 min。

12.丢弃流式旋转柱，并将MB旋转柱放回相同的2 ml收集管中。

13..将500µl的溶液C5添加到MB旋转列中。15,000 x g离心机，共离1 min。

14..丢弃流经装置并将MB旋转柱放入新的2 ml收集管中。

15.离心机设置最高为16000xg，离心2 min。小心地将MB旋转柱放入一个新的1.5 ml洗脱管中。

16.在白色滤膜的中心加入50-100µl的溶液C6。

17.设置15,000 x g离心机，共离1 min。丢弃MB自旋列。

该DNA现在已经准备好在下游应用了，实验时，每份粪便样本称取0.2g用于提取DNA。提取后测量DNA浓度，并储存在-20℃以便进一步分析。

　2.2.4 TA质粒构建

使用自杀基因来判断样本是否为重组后的样本，如果片段成功重组，那么自杀基因将不会表达，细胞正常。但如果所筛选的片段没有接入，该基因将会正常表达，导致此细胞不能生长，即为零背景。

（1）PCR产物的制备。选用无磷酸化的引物，使用Taq系列DNA聚合酶，在反应后5到10分钟进行延伸，反应完成后检测。如果扩增产物有多条带，凝胶回收目的片段。

（2）克隆反应体系。首先加入PCR Product 0.5-4微升，pEASY®-TS Zero Cloning Vector 1微升。将上述所取得溶液轻轻混合后，在常温环境下等待反应300 sec完成后低温放置。

（3）克隆反应条件如表4。

（4）转化产物于50微升的Trans1-T1感受态细胞中，稍微摇晃使其混合均匀后，放在低温处理25分钟，在42摄氏度激热半分钟后放入冰浴120 sec。在Luria-Bertani培养基上200转每分钟，37摄氏度培养60分钟后培养一晚上。

阳性克隆检测，使用PCR方法鉴定阳性克隆，然后用限制性酶切分析阳性克隆，最后进行引物测序和序列分析

　　2.2.5肠道微生物群的TaqMan qPCR检测

使用CFX connect™荧光定量PCR检测系统（BioRad）并在0.1 mL PCR八连管（NEST）中进行反应。引物和TaqMan探针的序列见表3-4。每个样品设置两组平行实验，反应总体系为20μL（Animal Detection U+Probe Master Mix，0.4μM引物，0.2μM TaqMan探针和1μL模板DNA）。

所有qPCR反应均通过以下热循环程序进行：37℃，2分钟（此步使用UDG酶，建立PCR防污染体系，保证PCR扩增结果的准确性）；95℃30s；95℃10s，60℃30s，40次循环。

通过qPCR获得的基因扩增水平显示为与初始DNA浓度成反比的CT值。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，通过获得的样品Ct值，从标准曲线上计算出该样品的拷贝数。CFX connect™（BioRad）软件控制程序根据设定的校准曲线值自动计算数量平均值。在数据自动处理之后，通过手动校准来校正某些曲线自动读取的不准确性。将定量值导出到电子表格中，进一步分析数据。

　2.2.6琼脂凝胶电泳验证

琼脂糖凝胶电泳步骤：电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，准确的称取一定量的琼脂糖干粉，加入到合适体积的锥形瓶中，加入一定量的电泳缓冲液（30ml左右1×TAE）；放入到微波炉内加热融化，冷却片刻（不烫手即可）后加入1μL的染料；融化后的琼脂溶液摇晃混匀，倒入电泳槽中，等其凝固；室温下凝固30-40min左右，小心的拔出梳子，取出凝固好的凝胶放入电泳槽内，没过胶面1mm左右，去除胶孔内的气泡，准备上样；5μL DNA样品加入1μL上样缓冲液（loading buffer），用枪混匀后加入到凝胶孔内；上样结束，接通电源，红色正极，黑色负极，DNA样品有负极往正极运动，加样孔侧为负，电压100V，恒流400 mA，40分钟；时间结束，关闭电源，凝胶成像仪上观察样本位置并比对marker判断大小。

　第三章结果与分析

　　3.1引物探针设计结果

根据前文所述的分析，从分类单元特定的保守区中得出一致序列。通过一致序列的基础使用NCBI设计引物和探针。引物和探针的设计需满足以下要求：引物的熔解温度（Tm）为58-62℃，探针的熔解温度为65-75℃，GC含量为40-65%。基于TaqMan qPCR的方法每个分类单元包含一对引物和一个寡核苷酸探针。

接着以人类粪便DNA为模板，使用PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳验证了引物的特异性，结果显示了清晰单一的条带，片段大小与引物设计时一致，没有出现非特异性扩增条带图。

　　为了得到测试反应条件，我们通过改变反应中的引物浓度与退火温度，分别设置了0.25μM~2μM的浓度梯度与50℃~65℃的温度梯度，通过扩增曲线与CT值的结果和在成本上的考虑，以及防止出现非特异性扩增，将引物终浓度为0.5μM，退火温度为60℃作为最终反应条件（图3-3）。

　　3.2标准曲线与TaqMan qPCR

在RT-qPCR中，对扩增过程进行实时监测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。

整条曲线可以分为3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含量而进行定量分析。

图3-2梯度稀释图

　　由图可以看出随着样本浓度梯度稀释，浓度降低，Ct值等差增加，图中曲线近似平行基本没有相差，各个浓度下Ct值具有相对稳定的差异变化，由此可以证明，本实验中我们所设计的引物探针检验效率较好。

根据数据库中已覆盖微生物基因组序列选择一段并合成质粒（金唯智）作为标准品。用稀释10倍的标准品绘制标准曲线（具体拷贝数可根据浓度计算）以其作为模板，在最优反应条件下进行荧光定量RT-PCR反应扩增,以模板对数值为x轴，Ct值为y轴，绘制标准曲线.图3-5。【】

在图3-4中扩增效率（E）计算公式：E=10-1/斜率-1。通过检测效率图到标准曲线，斜率为-3.788，得到标准曲线R方大于0.98，拟合度高，因此我们证明检测结果可靠。

　第四章结论

肠道微生物和人体健康的关系备受关注，因为肠道微生物不仅参与消化和营养吸收，还对免疫调节和疾病预防起着重要作用。随着现代生活方式和饮食习惯的改变，肠道微生物失调引起的疾病也越来越多。因此，了解肠道微生物的组成和功能，以及如何检测肠道微生物的变化，对预防和治疗肠道相关疾病具有重要意义。

目前，微生物检测技术不断提高，如高通量测序等。但由于时间长、准确度低、费用高等问题，它们在临床应用中受到限制。相比之下TaqMan QPCR检测方法是一种快速、准确、低成本的检测方法，可用于检测肠道微生物的数量和种类，对研究肠道微生物和人体健康的关系具有重要意义。与其他微生物检测方法相比，TaqMan QPCR检测具有更高的灵敏度和特异性，能够检测微生物的细微变化，因此被广泛应用于肠道微生物研究和临床诊断。

实验开发了匹配特定TaqMan引物的专用探针方法，并利用荧光PCR技术进行了实时定量TaqMan引物检测。用这一技术已成功检出从人体肠道中的丁酸菌群，还在粪样中得到了证实，表明该系统高效可靠。并将其作为标准模板用于糖凝胶电泳分离和TA克隆获得的重组质粒。结果表明：所构建的快速简便的DNA分子标记体系在一定程度上可以满足分子生物学研究工作的需要。所建立的方法能够实现粪便中丁酸菌群的准确识别。

　参考文献

1.Ursell LK,et al.The intestinal metabolome:an intersection between microbiota and host.Gastroenterology.2014;146:1470–1476.

2.Grice EA,Segre JA.The human microbiome:our second genome.Annu.Rev.Genom.Hum.Genet.2012;13:151–170.

3.Berg G,et al.Microbiome definition re-visited:old concepts and new challenges.Microbiome.2020;8:103.

4.Shreiner AB,Kao JY,Young VB.The gut microbiome in health and in disease.Curr.Opin.Gastroenterol.2015;31:69–75.

5.Hillman ET,Lu H,Yao T,Nakatsu CH.Microbial ecology along the gastrointestinal tract.Microbes Environ.2017;32:300–313.

6.Laterza L,et al.The gut microbiota and immune system relationship in human graft-versus-host disease.Mediterranean J.Hematol.Infect.Dis.2016;8:2016025.

7.Auchtung,T.A.et al.Investigating colonization of the healthy adult gastrointestinal tract by fungi.mSphere.3,e00092–18(2018).

8.Lozupone CA,et al.Diversity,stability and resilience of the human gut microbiota.Nature.2012;489:220–230.

9.Ley RE,Turnbaugh PJ,Klein S,Gordon JI.Human gut microbes associated with obesity.Nature.2006;444:1022–1023.

10.Bouskra D,et al.Lymphoid tissue genesis induced by commensals through NOD1 regulates intestinal homeostasis.Nature.2008;456:507–510.

11.Turnbaugh PJ,et al.An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.Nature.2006;444:1027–1031.

12.Roberfroid MB,Bornet F,Bouley C,Cummings JH.Colonic microflora:nutrition and health.Summary and conclusions of an International Life Sciences Institute(ILSI)[Europe]workshop held in Barcelona,Spain.Nutr.Rev.1995;53:127–130.

13.Fan Y,Pedersen O.Gut microbiota in human metabolic health and disease.Nat.Rev.Microbiol.2021;19:55–71.

14Sender,R.;Fuchs,S.;Milo,R.Are We Really Vastly Outnumbered?Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.Cell 2016,164,337–340.

15Atarashi,K.;Tanoue,T.;Oshima,K.;Suda,W.;Nagano,Y.;Nishikawa,H.;Fukuda,S.;Saito,T.;Narushima,S.;Hase,K.;et al.Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota.Nature 2013,500,232–236.

16Furusawa,Y.;Obata,Y.;Fukuda,S.;Endo,T.A.;Nakato,G.;Takahashi,D.;Nakanishi,Y.;Uetake,C.;Kato,K.;Kato,T.;et al.Commensal microbe-derived butyrate induces the differentiation of colonic regulatory T cells.Nature 2013,504,446–450.

17Tsuji,S.;Akagawa,S.;Akagawa,Y.;Yamaguchi,T.;Kino,J.;Yamanouchi,S.;Kimata,T.;Hashiyada,M.;Akane,A.;Kaneko,K.Idiopathic nephrotic syndrome in children:Role of regulatory T cells and gut microbiota.Pediatr.Res.2020,89,1185–1191.

18Yamaguchi,T.;Tsuji,S.;Akagawa,S.;Akagawa,Y.;Kino,J.;Yamanouchi,S.;Kimata,T.;Hashiyada,M.;Akane,A.;Kaneko,K.Clinical Significance of Probiotics for Children with Idiopathic Nephrotic Syndrome.Nutrients 2021,13,365.

19Yamagishi,M.;Akagawa,S.;Akagawa,Y.;Nakai,Y.;Yamanouchi,S.;Kimata,T.;Hashiyada,M.;Akane,A.;Tsuji,S.;Kaneko,K.Decreased butyric acid-producing bacteria in gut microbiota of children with egg allergy.Allergy 2021,76,2279–2282.

20Zeng,X.;Gao,X.;Peng,Y.;Wu,Q.;Zhu,J.;Tan,C.;Xia,G.;You,C.;Xu,R.;Pan,S.;et al.Higher Risk of Stroke Is Correlated with Increased Opportunistic Pathogen Load and Reduced Levels of Butyrate-Producing Bacteria in the Gut.Front.Cell Infect Microbiol.2019,9,4.

21Qin,J.;Li,Y.;Cai,Z.;Li,S.;Zhu,J.;Zhang,F.;Liang,S.;Zhang,W.;Guan,Y.;Shen,D.;et al.A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes.Nature 2012,490,55–60.

22Sato,J.;Kanazawa,A.;Ikeda,F.;Yoshihara,T.;Goto,H.;Abe,H.;Komiya,K.;Kawaguchi,M.;Shimizu,T.;Ogihara,T.;et al.Gut dysbiosis and detection of“live gut bacteria”in blood of Japanese patients with type 2 diabetes.Diabetes Care 2014,37,2343–2350.

23Suez,J.;Zmora,N.;Segal,E.;Elinav,E.The pros,cons,and many unknowns of probiotics.Nat.Med.2019,25,716–729.

24Kristensen,N.B.;Bryrup,T.;Allin,K.H.;Nielsen,T.;Hansen,T.H.;Pedersen,O.Alterations in fecal microbiota composition by probiotic supplementation in healthy adults:A systematic review of randomized controlled trials.Genome Med.2016,8,52.

25Grundy SM,Cleeman JI,Daniels SR,Donato KA,Eckel RH,Franklin BA,et al.Diagnosis and management of the metabolic syndrome:an American heart association/national heart,lung,and blood institute scientific statement.Circulation.2005;112(17):2735–52.

26Ades PA,Savage PD.Potential benefits of weight loss in coronary heart disease.Prog Cardiovasc Dis.2014;56(4):448–56.

27Nogal A,Valdes AM,Menni C.The role of short-chain fatty acids in the interplay between gut microbiota and diet in cardio-metabolic health.Gut Microbes.2021;13(1):1–24.

28González-Bosch C,Boorman E,Zunszain PA,Mann GE.Short-chain fatty acids as modulators of redox signaling in health and disease.Redox Biol.2021;47:102165.

29Robles-Vera I,Toral M,de la Visitación N,Aguilera-Sánchez N,Redondo JM,Duarte J.Protective effects of short-chain fatty acids on endothelial dysfunction induced by angiotensin II.Front Physiol.2020;11:277.

30Holst JJ.The physiology of glucagon-like peptide 1.Physiol Rev.2007;87(4):1409–39.

31Cani PD,Everard A,Duparc T.Gut microbiota,enteroendocrine functions and metabolism.Curr Opin Pharmacol.2013;13(6):935–40.

32Hare KJ,Vilsboll T,Asmar M,Deacon CF,Knop FK,Holst JJ.The glucagonostatic and insulinotropic effects of glucagon-like peptide 1 contribute equally to its glucose-lowering action.Diabetes.2010;59(7):1765–70.

33Scheppach W,Weiler F.The butyrate story:old wine in new bottles?Curr Opin Clin Nutr Metab Care.2004;7(5):563–7.

34Lin HV,Frassetto A,Kowalik EJ Jr,Nawrocki AR,Lu MM,Kosinski JR,et al.Butyrate and propionate protect against diet-induced obesity and regulate gut hormones via free fatty acid receptor 3-independent mechanisms.PLoS ONE.2012;7(4):e35240.

35Gao Z,Yin J,Zhang J,Ward RE,Martin RJ,Lefevre M,et al.Butyrate improves insulin sensitivity and increases energy expenditure in mice.Diabetes.2009;58(7):1509–17.

36Sakakibara S,Yamauchi T,Oshima Y,Tsukamoto Y,Kadowaki T.Acetic acid activates hepatic AMPK and reduces hyperglycemia in diabetic KK-A(y)mice.Biochem Biophys Res Commun.2006;344(2):597–604.

37Kimura I,Ichimura A,Ohue-Kitano R,Igarashi M.Free fatty acid receptors in health and disease.Physiol Rev.2020;100(1):171–210.

38Fernández-Hernando C,Suárez Y.ANGPTL4:a multifunctional protein involved in metabolism and vascular homeostasis.Curr Opin Hematol.2020;27(3):206–13.

39Barja-Fernández S,Folgueira C,Castelao C,Pena-León V,González-Saenz P,Vázquez-Cobela R,et al.ANGPTL-4 is associated with obesity and lipid profile in children and adolescents.Nutrients.2019;11(6):1340.

40Ortega-Senovilla H,van Poppel MNM,Desoye G,Herrera E.Angiopoietin-like protein 4(ANGPTL4)is related to gestational weight gain in pregnant women with obesity.Sci Rep.2018;8(1):12428.

41Robciuc MR,Skrobuk P,Anisimov A,Olkkonen VM,Alitalo K,Eckel RH,et al.Angiopoietin-like 4 mediates PPAR delta effect on lipoprotein lipase-dependent fatty acid uptake but not on beta-oxidation in myotubes.PLoS ONE.2012;7(10):e46212.

42Alex S,Lange K,Amolo T,Grinstead JS,Haakonsson AK,Szalowska E,et al.Short-chain fatty acids stimulate angiopoietin-like 4 synthesis in human colon adenocarcinoma cells by activating peroxisome proliferator-activated receptorγ.Mol Cell Biol.2013;33(7):1303–16.

9于卓腾，杭办琴，姚文，朱伟云．肠道产丁酸细菌及其丁酸产生机制的研究进展．世界华人消化杂志2006；14(25)：2531—2534

[44]徐匆,黄皓,黄晓彦等.齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立[J].贵州农业科学,2023,51(04):86-92.

人体益生菌丁酸菌群检测方法的开发

价格 ¥9.90 发布时间 2023年12月11日

下载查看全文内容

已付费？登录 或 刷新