中文摘要
目的：
在不同浓度的热敏水凝胶PLGA-PEG-PLGA中选择出合适的浓度，检测其细胞毒性后，装载血管内皮生长因子（VEGF）。建立标准化的wistar大鼠下肢建立缺血模型，给予装载VEGF的热敏水凝胶，观察大鼠下肢缺血肢体的血流恢复状况。
方法：
将PLGA-PEG-PLGA溶解于PBS中，配置不同浓度的热敏水凝胶PLGA-PEG-PLGA在根据溶液-凝胶转变温度，选取合适的浓度装载VEGF。将选取好的PLGA-PEG-PLGA与脐静脉内皮细胞共同培养，在不同时间点用酶标仪测量器吸光度，分析PLGA-PEG-PLGA的细胞毒性。(3)wistar大鼠标准化下肢缺血模型的建立，左下肢股总动脉、股浅动脉及隐动脉结扎并离断切除其动脉分支。
(4)将成功建模的下肢缺血模型的20只wistar大鼠随机分为Gel/VEGF组、Gel组、VEGF组、生理盐水的Control组，在缺血模型建立后第1天，在缺血下肢腓肠肌分别肌注200ul Gel/VEGF、Gel、VEGF、生理盐水。用Moor LTD激光多普勒血流仪分别记录各分组0d、1d、3d、7d、10、14d的大鼠双下肢血流灌注情况，并用血流灌注比（缺血侧/非缺血侧）反映大鼠下肢血流恢复情况。
（5）激光多普勒血流灌注比分析结束后处死wistar大鼠并留取缺血下肢腓肠肌标本，进行HE染色和免疫荧光分析缺血组织的毛细血管数。
结果：
通过对三种不同浓度PLGA-PEG-PLGA（1654-1500-1654）的研究得出。当水凝胶的浓度为别为15%wt、20%wt和25%wt时，水凝胶溶液表现出来的凝胶转变温度分别为：29.1oC、26.9oC、23.1oC，沉淀转变温度分别为：37.7oC、39.3oC、42.9oC。由此可以看出当水凝胶聚合物浓度越高时，其由溶液向凝胶转变所需的温度也就越低，但其向沉淀转变所需的温度也越高。VEGF和PLGA-PEG-PLGA水凝胶能以物理混合的方式构建缓释体系，并能在体外释放VEGF达9d左右。CCK8细胞毒性试验和组织HE染色分别从细胞层面和组织层面表明PLGA-PEG-PLGA水凝胶具有良好的生物安全性，可作为生物可降解材料用于实验。(3)激光多普勒血流灌注分析注射Gel/VEGF组的大鼠缺血下肢能在14d后血流灌注比恢复到87.61%，和对照组两两相比P<0.05，结果有统计学意义。观察Gel/VEGF组的缺血侧腓肠肌的HE切片，可以看出其缺血侧的肌细胞形态更接近于非缺血侧，同时相较与其他三组其组织间隙也更加的小。缺血侧的腓肠肌免疫荧光双标CD31和α-SMA检测证明给与Gel/VEGF组相较于其他三组有更多的微血管生成。
结论：
热敏水凝胶PLGA-PEG-PLGA可以作为缓释材料装载VEGF构建药物缓释体系，是因为该材料具有可降解的特性以及优越的生物相容性。构建成功的热敏水凝胶缓释体系对缺血下肢血流恢复有一定的促进作用。
关键词：下肢缺血；VEGF;PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶，血管新生，药物缓释
1.引言
目前流行病学研究表明在全球范围内, 外周动脉疾病（PAD）在老年人中患病率高达10%-20%[1-2]。并且随着人们生活习惯的改变和全球人口的不断老龄化，导致PAD的发病率在当今的社会中也有很大幅度的上升。PAD的患者由于血管内皮的损伤以及血液动力学的改变，会导致患者的患肢严重的供血不足以及心脑血管疾病的高发，严重者甚至会导致截肢或者死亡[3]。目前，临床上针对于PAD的最主要治疗手段包括药物治疗[4]以及外科血管重建[5]。当前药物治疗主要起到缓解和控制症状为主，多数为抗血小板药物以及降血压药物，在改善患者患肢血供的同时还可以有效的防止心脑血管等疾病的发生，在血管重建术治疗下肢缺血的同时使用抗血小板药物还可以有效的提高患者下肢缺血血管重建术后血管的通畅率和保肢率。但是药物治疗对组织缺血所导致的严重组织损伤起到的治疗效果不佳。血运重建术仍是目前治疗PAD最主要的措施，主要包括动脉旁路移植术以及腔内介入技术等，术后能够极大的改善患者的患肢血供。但是由于术后的移植血管和支架再通的血管再次发生闭塞的风险较高，所以导致这部分患者的远期疗效不佳。
治疗性血管新生[6]的提出在理论上是目前治疗PAD的最佳方式，其原理就是利用各种技术手段，通过各种各样不同的方式将外源性具有促血管新生的一种或多种诱导因子，导入到缺血组织中,进入组织内部的具有生物活性的细胞因子可以促进血管新生，其中这些血管包括：血管、侧支血管以及微血管。这些新生血管功能弥补了缺血组织的功能缺陷从而达到治疗的目的。治疗性血管新生通过以下两种方式发挥效用。一方面：干细胞是体内具有多向分化潜能的细胞，缺血组织中导入干细胞,干细胞既可以在缺血组织中分化为血管内皮细胞又可以产生大量的促血管生长因子，二者相互协调进而实现血管新生[7]。其中，以干细胞作为种子细胞应用范围较广效果较好。治疗下肢动脉缺血性疾病，临床上常常选用以下几种：胚胎干细胞(embryonicstem cell,ES)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)等[8]。但是，由于干细胞本身自己的多分化的潜能导致其的治疗方案在安全性方案有所欠缺，其中，最重要的的表现就是干细胞移植激活机体的免疫应答，产生免疫排斥，以及干细胞本身可能出现的错误分化，错误分化的干细胞可诱发细胞癌变造成患者罹患癌症。尽管，在查阅目前临床报告的研究中还尚未能发现上述所提及的严重移植不良反应，但是由于目前干细胞的研究样本量太小和时间较短，所以，有关自体干细胞移植促进缺血组织血管新生的安全性有待学者们的进一步研究。治疗性血管新生的另一种方式就是：应用各种有促进血管新生的生长因子或者能编码促血管新生因子的基因导入到缺血区域中。在缺血部位发挥促血管新生的作用，从而起到增加患者缺血肢体的血液灌流状况，从而起到治疗效果。血管内皮生长因子（VEGF）促血管新生因子家族中不可或缺的一员, 近年来，许多研究成果已经证实了该细胞因子的促血管生成作用[9]。基于VEGF的疗法需要使用超生理剂量的生物分子，理由是这些生物分子在体内的半衰期短会被身体快速清除，所以为了能够达到所需的蛋白治疗效果，就需要在给药时加大给药剂量。施用治疗性蛋白质的常用策略是通过推注，尽管这种方法的临床成功有限，主要是由于可能的不良副作用[10]。 例如，可以使用推注注射VEGF以诱导缺血组织的血运重建，但由于缺乏对释放的控制，全身暴露于VEGF可能引起危险的副作用，常见血管渗漏，低血压以及肿瘤形成的风险[11]。如何设计有效的以VEGF为基础的治疗方法，通过促进这些生物因子在目标组织[12]内的缓慢定点的释放从而来有效的减少这些不必要的副作用。
随着可降解生物材料研究的不断深入，一种可以随着外界接触温度的变化而发生溶液-凝胶相转化的新型生物材料—温敏水凝胶登上历史的舞台。温敏水凝胶是一种品质优良的生物材料，具有可注射性，是目前的研究热点[13]。关于PLGA-PEG-PLGA 三嵌段温敏水凝胶是由材料界知名的Kim教授团队首次报道的，PLGA-PEG-PLGA 三嵌段温敏水凝胶是一种温度敏感性聚合物，可以随着外界接触温度的改变自发向凝胶相转变[14]，根据对不同凝胶的研究发现，凝胶发生溶液-凝胶转变的温度与聚合物分子本身的结构密切相关。即当聚合物分子中PLGA 的链段越长或者当聚合物中丙交酯/乙交酯比例越高，这时凝胶在发生溶液-凝胶转变时所需要的温度就会越低。研究发现PLGA-PEG-PLGA 温敏水凝胶材料具有可降解性以及良好的生物学相容性，可与多种不同药物、蛋白、细胞和基因构成载药体系，通过复合体系的构建从而达到目的用药缓慢释放的意图。有研究表明：PLGA-PEG-PLGA 温敏水凝胶搭载药物或者目的蛋白时，药物或者目的蛋白主要通过自由扩散和凝胶降解这两种方法缓慢释放出来，这种可持续的稳定的释放时间可以长达5周[15]。使用传统水凝胶作为载体的一个主要缺点是，它们无法控制所载分子的释放动力学。事实上，在大多数情况下，爆发性释放是不可避免的，会导致治疗效果下降和治疗失败。作为一个潜在的解决方案，Pacelli[16]提出了一种将纳米金刚石(NDS)配合物纳入可注射水凝胶基质的策略。NDs表面的官能团可以与VEGF建立相互作用，促进聚合物网络的长时间释放，从而提供更长的治疗效果。他们的策略证明了将NDs作为一种新型可注射纳米复合材料系统设计的基本组件的有效性，该系统具有更好的释放能力。Manavitehrani[17]等人在研究中，将骨形态发生蛋白2（BMP2）缠绕在胺官能化的二氧化硅中孔颗粒中，然后其均匀分布地悬浮在水凝胶的结构内。分析显示抑制 BMP2 的爆发释放，证实了这些载有颗粒的可注射水凝胶用于局部和持续递送活性化合物的潜力。除 BMP2 外，该技术还可用于递送抗菌药物，抗炎药物，生长因子和基因。
分析目前研究结果，我们提出合理假设：配制浓度合适的PLGA-PEG-PLGA 温敏水凝胶，利用水凝胶的药物缓释性以及良好的生物相容性和可降解性，将能够促进血管新生的VEGF装载其中构成定点缓释体系，从而在能够大幅度的提高VEGF的生物利用度和降低其副作用。该载体的设计即能提高药物在局部组织的生物利用度，同时也能改善水凝胶自身爆发性释放的缺点。相信在随着人们对PLGA-PEG-PLGA的不断研究，未来这种生物材料可以在治疗严重PAD患者方面带来福音。
2.材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验动物
健康清洁级wistar大鼠，5周龄（购自上海斯莱克公司），平均体重（200±10）g，雌雄不限。
2.1.2实验试剂
PLGA-PEG-PLGA西安瑞禧生物公司
戊巴比妥钠安徽医科大学实验中心青霉素/链霉素 上海碧云天生物技术有限公司盐酸利多卡因 北京紫竹药业有限公司
磷酸盐缓冲液（PBS）XHyclone公司
胎牛血清（FBS） XGIBCO公司
DMEM高糖培养基（H-DMEM） XGIBCO公司
血管内皮细胞生长因子（VEGF） XPeprotechasia公司
脐静脉内皮细胞上海中乔新舟生物科技有限公司二甲基亚砜（DMSO） 上海碧云天生物技术有限公司
0.25%胰酶 XGIBCO公司
二甲苯 国药集团化学试剂有限公司
一抗：CD31+a-SMA+CD68Servicebio公司
DAPIServicebio公司
CCK8 Servicebio公司
ELISA试剂盒CusaBio公司
苏木精伊红 Sigma公司
2.1.3实验仪器：
激光多普勒MoorInstruments LTD
正置荧光显微镜日本尼康
显微体式镜 Olympus公司
细胞培养箱 XThermo公司
器械包 安徽医科大学第二附属医院温度计 常州市希雅仪表有限公司注射器（1ml、5ml、10ml、20ml） 江苏苏云医疗器械有限公司
电子天平 上海天平仪器厂
恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
KS50R台式离心机 湖南凯达科学仪器有限公司
微量移液器 德国Eppendorf公司
SW-CJ-2FD双人单面超净台 深圳市三利有限公司
光学显微镜倒置显微镜 上海虹渐光电科技有限公司
制冰机 浙江冰欧新能源科技有限公司uv型光氧紫外线灯 东海县芮嘉石英制品有限公司
细胞计数板、盖玻片、各种枪头 安徽医科大学第二附属医院中心实验室
2.1.4主要试剂的配制
2.1.4.1
细胞培养基配制（本实验用10%FBS的H-DMEM）：紫外灯消毒的超净台上，用无菌注射器小心吸取50mlFBS加入到本实验室购买的近期的500mlH-DMEM原始培养基中，再加入5.5ml双抗（青-链霉素），充分混合均匀，做好标记，即为配置好的含有10%FBS和1%青-链霉素的H-DMEM完全细胞培养基，于4℃冰箱保存。
2.1.4.2
1%盐酸酒精配制：1ml盐酸加入到500ml酒精中。
2.1.4.3
麻醉药配制：400g的戊巴比妥钠加入到500ml的PBS中。
2.2实验方法
2.2.1.PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶溶胶-凝胶转变
取PLGA-PEG-PLGA（PLGA-1654,PEG-1500）溶于PBS中，配制不同浓度的温敏水凝胶，测定 PLGA-PEG-PLGA 聚合物溶液的 sol-gel 转变温度本实验是通过试管倒置法[18]。将0.5ml 聚合物溶液转移至EP小管中，置于数显恒温水浴锅中，每两次升温间隔 1℃，每个温度下恒温 10min，升温速率1℃/min。在不同时间点，将试管倒置后，观察试管中水凝胶聚合物溶液是否有流动现象：若在倒置后30秒以内试管中的水凝胶聚合物溶液不发生流动，则认为水凝胶已发生了溶液-凝胶转变，那么此时的温度点即为凝胶转变温度。
2.2.2.PLGA-PEG-PLGA水凝胶的细胞毒性实验（CCK8）
（1）称取PLGA-PEG-PLGA聚合物溶解于水，配制出不同浓度的PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液（0%wt、5%wt、10%wt、15%wt、20%wt、25%wt）。
（2）将上述不同浓度的水凝胶以每孔10ul接种于96孔板中，每组接种12孔。置于37oC、5%CO2 的培养箱中10min待凝胶形成。
（3）在每孔中接种生长状况良好的HUVEC，细胞密度我们设定为为 5×104/孔，并在每孔中加入100ul DMEM 培养液，置于 37oC、5%CO2培养箱中培养 24h 、72h小时。
（4）每个实验孔分别加入 cck8溶液（5mg/ml）100μl，小心混匀，于 37oC、5%CO2条件下孵育 4 小时，。
（5）每孔加入 1ml 二甲基亚砜（DMSO），混匀后于酶标仪（Bio-Rad 680）测定溶液吸光度。测量波长为490nm [19]。 （该实验应为避光条件）
细胞活性（Cell Viability）通过下面公式计算：
Cell Viability（%）=（A 样品/A 对照）×100%
其中，A 样品，A 对照分别是样品组、空白对照组的吸光度。
2.2.3.水凝胶的体内降解及生物相容性
（1）5只wistar大鼠用0.8%戊巴比妥钠麻醉腹腔麻醉，待眼睑反射消失、肌肉松弛证明麻醉成功。选定Wistar 大鼠背部皮下为注射点，注射200µl PLGA-PEG-PLGA （20wt%）溶液。
（2）根据实验设计分别在以下时刻处死大鼠（30min、7d、14d、21d、25d），剪开凝胶处皮肤，观察凝胶在体内降解情况。剪取凝胶周围皮肤组织置于组织固定液中，做HE染色及免疫荧光靶向标记CD68[20]观察组织是否改变。
2.2.4VEGF的装载及体外缓释
在配制20%wt的PLGA-PEG-PLGA水凝胶，在其中加入100ng/ml的VEGF[21],在4摄氏度下以60rpm磁力搅拌过夜备用。取底部内径为16mm得消毒玻璃瓶备用，取载药 PLGA-PEG-PLGA 三嵌段共聚物溶液0.5ml，置于玻璃瓶中，小心置入 37℃ 的恒温箱中，放置 10 分钟，待凝胶形成。体外药物释放实验：取3mlPBS溶液，分别加入上述玻璃小瓶，做好标记后，放入 37℃ 的恒温箱摇床中(60strokes/min)进行。根据实验时间间隔取出 2ml 释放液，注意所有小瓶均应避光低温保存，同时注意补充加入等量的新鲜释放液，收集所有样品共同检测。将取出的释放液通过ELISA 试剂盒线定量检测其中累积释放的 VEGF 的量，具体操作步骤参考说明书。分析数据并以时间为横坐标、释放液中血管内皮生长因子累计释放量为纵坐标，描绘出血管内皮生长因子的释放曲线。时间分别为12h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d。2.2.5.下肢缺血模型的建立
(1)20只Wistar大鼠（5w龄）提前一周从上海斯莱克动物中心转移至动物房以适应环境。
(2)wistar大鼠用0.8%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（10ml/kg），观察其眼睑反射消失、肌肉松弛证明麻醉成功，备皮脱毛、消毒手术区。
(3)在腹股沟处纵行切开2cm的切口，以腹壁浅动脉为标志钝性分离脂肪组织暴露腹股沟韧带，在腹股沟韧带下分离出股动脉并向下游离，分别在股总动脉、股浅动脉及隐动脉处使用6-0 Prolene线结扎并离断动脉干支切除其动脉分支。用5-0 Prolene线缝合皮肤置于电暖板上复温。
(4)术后一天确认建模成功后，将20只大鼠分成四组进行干预，分别给与200ul的Gel/VEGF组、Gel组、VEGF组、生理盐水的Control组。
2.2.6.激光多普勒采集下肢缺血血流灌注
Wistar大鼠腹腔注射麻醉后，在多功能电暖板复温，用Moor LTD激光多普勒血流仪分别记录各分组0d、1d、3d、7d、10、14d的大鼠双下肢血流灌注情况，并用血流灌注比（缺血侧/非缺血侧）反映大鼠下肢血流恢复情况。
2.2.7组织学及免疫组织化学分析
待实验结束后将wistar大鼠处死（麻醉+颈椎脱臼法），然后取双侧下肢腓肠肌置于多聚甲醛溶液中，后期石蜡包埋后进行组织切片。HE染色观察肌肉组织的大体形态，免疫荧光染色靶向标记CD31和α-SMA用以评估血管新生[22]。同时为评估PLGA-PEG-PLGA缓释体系的生物安全性，将各组wistar大鼠处死后取心、肝、脾、肺、肾做HE染色。
2.2.7.1:石蜡切片和免疫荧光操作：（1）石蜡切片脱蜡至水：切片放入二甲苯Ⅰ15min后转入二甲苯Ⅱ15min，转入无水乙醇Ⅰ5min接着转入无水乙醇Ⅱ5min。再85%酒精处理5min、75%酒精处理5min，最后蒸馏水洗。
（2）抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸（PH6.0)抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行反应。实验条件设定为：中火10min停火5min转中低火5min，停火2min转中低火5min。自然冷却，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(3)画圈：用组化笔在组织周围画圈。
(4)血清封闭:在圈内滴加BSA，封闭30min。
(5)加一抗：在切片上滴加配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
(6)加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
(7)自发荧光淬灭：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
(8)DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。圈内滴加DAPI染液（切片稍甩干），避光孵育10min室温条件。
(9)封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
(10)镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。
2.2.8数据分析与讨论
所有数据均以平均值±标准差（SD）表示，每组数据至少平行实验三次获得。使用Spss 17.0通过t检验分析统计学显着性。p<0.05被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶溶胶-凝胶转变
PLGA-PEG-PLGA 温敏水凝胶凝胶转变机制是温度依赖性胶束间的桥联作用[23]。低温时PLGA-PEG-PLGA可完全溶于水，但随着温度逐渐升高，PLGA 链的疏水作用增强而形成胶束。胶束通过 PLGA 链段间的疏水作用继续相互交联，发生凝胶转变。随着温度进一步升高，PEG 链段发生脱水作用，不断增强的脱水诱发体系发生凝胶-沉淀相转变。通过对三种不同浓度PLGA-PEG-PLGA（1654-1500-1654）的研究得出。浓度为15%wt、20%wt、25%wt的水凝胶溶液凝胶转变温度如图（1a）分别为：29.1oC、26.9oC、23.1oC，沉淀转变温度如图（1b）分别为：37.7oC、39.3oC、42.9oC。聚合物浓度越高，发生凝胶转变所需的温度越低，但转变为沉淀所需的温度-凝胶转变温度图如图（1c）所示
图1a分别为15%、20%、25%三种浓度水凝胶的凝胶转变温度，图1b分别为15%、20%、25%三种浓度水凝胶的沉淀转变温度，图1c为该水凝胶的溶液-凝胶温度转变图。
3.2PLGA-PEG-PLGA水凝胶的细胞毒性实验
配制0%wt、5%wt、10%wt、15%wt、20%wt、25%wt不同浓度的水凝胶分六组分别与HUVEC共同培养24h和72h后。在490nm处测其吸光度。并根据公式计算出其细胞活性如图（2）。
图2 不同浓度PLGA-PEG-PLGA水凝胶的体外生物相容性
3.3水凝胶的体内降解及生物相容性
如图（3）可见，20%wt的PLGA-PEG-PLGA水凝胶在注入体内30min后，可在注射部位形成稳定的凝胶。并随着时间的推移而慢慢降解。最终在25d后在注射部位完全降解。HE染色（图4）可见不同时间点凝胶周围皮肤组织都保持正常形态。免疫荧光标记CD68（图5）[24]可见凝胶注入到体内的30min后，周围组织可见明显的炎性细胞浸润，而随着时间的推移，组织内的炎性细胞慢慢减少。可见20%wt的PLGA-PEG-PLGA水凝胶生物相容性良好。是具有研究前景的良好生物可降解材料。
3.4VEGF的体外缓释
研究表明装载药物、蛋白的PLGA-PEG-PLGA 温敏水凝胶主要通过自由扩散和凝胶降解缓释出来。根据ELISA检测结果显示本实验所用载药体系的VEGF前12h释放量为8.86%，24h的累积释放量达15.61%。在第5d的累积释放量达到49.07%，第8d就已经达到92.83%。由图（图6）可知随着时间的增长，VEGF的累积释放量也在逐渐增大，在第9d可累积释放96.15%。其中在第1d、7d和8d的缓释量较大，存在爆发性释放的情况。在第1d因凝胶中VEGF与外界浓度差最大，所以缓释量较多，随着外界浓度的增加，缓释也逐渐平稳。在第7d和第8d的缓释量又较之前明显增加，此时缓释的方式除了VEGF本身的自由扩散同时还包含水凝胶自身降解所带来的释放量。
图6 载药水凝胶的缓释图，横坐标代表时间，纵坐标代表释放百分比
3.5激光多普勒血流灌注比分析
通过激光多普勒扫描各组大鼠双侧下肢血流图像如图（7）所示。利用mLDIMainV53软件分析缺血侧/非缺血侧血流灌注图如图（8）。下肢缺血模型建立后1d，缺血侧/非缺血侧血流平均灌注比在0.1，证明缺血模型建立成功。而在14d后，Gel/VEGF组的两侧血流灌注比恢复至0.8761，单纯Gel组两侧血流灌注比为0.6470，VEGF组两侧血流灌注比为0.6692，空白对照组两侧血流比为0.6041。由此可见Gel/VEGF的水凝胶缓释体系能很好的促进下肢血流恢复。
图7 四组wistar大鼠下肢血流灌注比的激光多普勒图
图8 四组wistar大鼠下肢血流灌注比
3.6组织学及免疫组织化学分析
通过对大鼠双侧下肢腓肠肌进行HE染色（图9），发现非缺血侧肌细胞排列更加致密，细胞形态更加饱满。其余三组的HE 染色可以看出肌细胞间隙不同程度增大，细胞形态不规则。而Gel/VEGF组相较于其他三组无论细胞间隙还是形态结构都更加接近正常组织。免疫荧光双标CD31和α-SMA分别用来标记血管内皮细胞和肌细胞来评价微血管数量。然后利用CaseViewer软件系统分析免疫荧光双标如图（10），放大100倍的视野下可见Gel/VEGF组相较其余三组有更多的毛细血管。四组间各个组织器官的HE染色未见异常如图（11），说明载药水凝胶具有良好的组织相容性。
图9 Normal代表非缺血侧腓肠肌的HE，Gel/VEGF代表Gel/VEGF组缺血侧腓肠肌HE，Gel代表Gel组缺血侧腓肠肌HE,VEGF代表VEGF组缺血侧腓肠肌HE,Control代表Control组缺血侧腓肠肌HE.
图10 免疫荧光标记CD31+α-SMA标记各组腓肠肌
图11各组wistar大鼠的心、肝、脾、肺、肾的HE切片
4 讨论
下肢缺血动物模型是了解临床肢体缺血疾病病理生理发生、发展过程以及探索其治疗手段的重要措施，急性下肢缺血的常见建模手段为动脉结扎切除法。根据干预方式的不同，结扎切除法又可细分; 还可以根据其干预血管的名称分类。模型的建立成功与否，将直接决定实验的成败。所以建立标准化、符合实验需求的下肢缺血模型是很有必要的。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种可以增加血管通透性蛋白质，最初是从肿瘤血管中分离得到。又被人们称作血管通透性因子, 具有强烈的促血管生成作用，对血管内皮细胞具有高度特异性的肝素结合蛋白[25]。
迄今为止，促血管生成因子中，研究最为完善的细胞因子即为VEGF。整个血管新生过程均有VEGF信号通路的参与，有重大意义。VEGF是分子量23 kD 的单链蛋白，最早由 Senger 等人的研究团队在 1983 年发现[26]。在转录过程中，由于mＲNA 拼接方式的不同，可以形成 6 种 VEGF 的异构体。
外伤、炎症、缺氧等应激情况的影响，导致机体组织发生病理改变。病变组织局部可诱导产生促血管生长因子的产生，其中包括:VEGFs、EGF、bFGF 等。上述促血管生长因子可通过与分布在内皮细胞膜上的相应受体结合，触发相关信号通路活化。该信号的激活本质上是一系列的级联的酶促反应，首先级联反应导致现存血管基底膜的分解，该分解过程可以促进内皮细胞增殖和迁移。
内皮细胞的芽生及迁移是血管新生过程中的必要环节。血管内皮细胞不断增殖分化，不断发育出顶端细胞和茎细胞( stalk cell) ，然后继续生长出可以继续下一步迁移的丝状伪足和板状伪足等细胞结构。
顶端细胞和茎细胞不断发育，是血管芽的前体细胞。血管芽结构的产生同样离不开生长因子的调控，该过程由VEGF 介导胞内Notch-Dll4 等信号通路完成。伪足结构是细胞迁移的前提，VEGF可以刺激顶端细胞和茎细胞产生伪足，以利于后期微血管网络的形成。新生血管网络的供血能力是不足的，因为其新生的网状结构杂乱无序，这样的结构不足以产生有效的血流灌注。新生血管网络必须在此基础上进一步成熟才能具备对组织进行有效血流灌注的能力，不断的成熟以利于弱化这种血流的无效灌注。
VEGF 信号减弱后，内皮细胞的状态可以逐渐从激动转变为静息态。这种转化依赖于一下两方面：其一，Notch /Dll4 对内皮细胞膜上的VEGF 受体反馈调节机制[27]; 其二，新生血管中新出现的血流灌注使得血流冲击血管壁的剪切力发生改变，这种力学改变可以被血管内皮细胞敏感的感受器捕捉，导致激活转录因子 KLF2 ，该因子的活化可以促使 eNOS 与血栓调节蛋白表达水平提高，进一步负反馈调节 VEGFＲ2，使内皮细胞膜上 VEGFＲ2 数量减少。Nicoli 教授等人[28]使用斑马鱼作为实验对象，完成实验研究发现，MAPK/PI3K 信号通路参与调节KLF2 。进一步证明：血管内皮细胞凋亡、血管的阻塞和分解与新生微血管网络的血管内皮细胞中KLF2含量减少相关。
研究表明：在正常组织中VEGF 的含量水平并不高, 在胚胎和有血管形成(新生)的组织中VEGF 的含量较高 。原因在于，VEGF在血管生成中扮演着可以促进毛细血管融合以及大血管的生成的角色。大量研究表明将装载有 VEGF 的基因导入到缺血模型实验动物体内，实验结果可出现：局部缺血坏死组织中可以检测到VEGF 基因的存在并可检出VEGF 蛋白。大量的新生血管可以在大体标本组织中可见。但是，VEGF 是一种半衰期相对较短的细胞因子，带来了利用血管内皮生长因子蛋白这种治疗手段治疗下肢缺血性疾病存在诸多劣势：重复给药、成本高、给药过程繁琐、患者依从性差[29]。
载体控释技术的研究不断成熟，与生物载体研究相关的工艺技术突飞猛进，可以帮助广大临床医师解决上述弊端。因此，采用载体缓释血管内皮生长因子的方式是目前在临床上用来加快促使血管能够得以新生的趋势所在。目前，临床上常采用的控释载体主要就包括了水凝胶、藻酸盐、介孔二氧化硅等。
有研究团队把 VEGF 包裹于藻酸钙微球中进行临床观察，实验结果表明含量在6ng*ml/(L*d) 的VEGF其有效释放时间可达到10-14ｄ。张铁慧[30]等更是制备了含 VEGF 缓释微粒显微缝线促进大鼠小血管吻合后的内皮再生。水凝胶溶液的温敏特性指的是，溶液可以随温度的改变其状态发生改变，随着温度的升高，可以由液态转变为具有多孔三维结构的凝胶态,它兼具固体和液体的性质。因其具有医用可注射性及良好的生物相容性，使其在药物缓释、伤口敷料等诸多领域拥有极好的发展前景[31], 已被X FDA[32]批准用于人体 。然而，水凝胶的强度一般较弱，往往不能满足现实应用。所以，制备高强度水凝胶成为研究的热点。其中，典型的高强度水凝胶主要指有机／无机纳米复合水凝胶、拓扑水凝胶、双网络水凝胶及离子型水凝胶[33]等。随着纳米科技和复合技术的进步，有机／无机纳米复合水凝胶成为了研究的热点。同时，随着纳米粒子的引入，往往赋予水凝胶以新的功能，如自修复能力[34]、刺激响应性、抗菌性等。制备含 VEGF 缓释药物载体将成为治疗下肢血管新生的新方向。
5结论
（1）热敏水凝胶PLGA-PEG-PLGA可作为良好的生物可降解材料装载VEGF构建药物缓释体系。
（2）构建成功的热敏水凝胶缓释体系对缺血下肢血流恢复有一定的促进作用。
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致谢
三年的硕士研究生时光飞逝，回顾已逝的时光，感恩过往。首先感谢我敬爱的老师，万圣云教授。在研究生期间万圣云教授以身作则不仅仅教会了我在临床工作中的技能，同时在科研实验中也给予了我许多帮助。在导师的帮助下让我有幸结识安徽大学的教授、中国科技大学合肥物理研究所的钟凯教授以及上海交通大学附属第九人民医院的陆信武教授。正是在导师的帮助下我才有机会与各位老师，并在各位老师的帮助下才使得我能顺利完成学业。
同时还要感谢安徽医科大学第二附属医院普外科XXXXXXXX等诸位老师在临床工作中给予的教导与帮助。
感谢和我一届的XXX同学、XXX同学、以及XXXX师弟，是你们在我最困难的时候给与我鼓励与帮助，才使得我们能够共同进步。
当然还要由衷的感谢各位答辩委员会的各位专家老师，感谢你们能够在百忙之中抽出时间来指导审阅我的答辩论文。
感谢安徽医科大学以及附属第二医院为我创造的良好的学习环境。
最后感谢我的父母在背后给予我的无私奉献和默默支持。我将铭记于心。
综述
PLGA-PEG-PLGA作为可降解材料的研究进展
摘要：近年来随着生物可降解材料的研究深入，药物的靶向治疗以及定点缓释成为了研究热点。温度敏感型水凝胶材料，其特征即为随温度的改变，发生不同相的转变，制备在人体温下发生溶液-凝胶转变的水凝胶是近年来的研究热点。PLGA-PEG-PLGA作为可降解材料水凝胶生化性质与机体生物组织十分相似，具有良好生物相容性。并可装载药物、蛋白、细胞或基因等物质从而在体内达到治疗的目的而广泛应用于生物医用领域。本文就对PLGA-PEG-PLGA作为可降解材料的研究进展做一综述。
关键词：PLGA-PEG-PLGA 药物缓释 可降解肿瘤 缺血
研究发明生物替代物来代替缺损的器官或者完成结构不完整的组织重建，是组织工程这门学科的意义所在。利用生物材料与“种子细胞”，将二者搭建在一起组合后通过手术的发方式植入体内，是传统的组织工程学常用的技术手段。此时生物材料作为骨架供细胞附着和扩增。因此，生物材料的生物学相容性以及生物可降解性是考察该生物材料是否可行的必备条件[98, 99]。详细说来，该生物材料作为生物支架材料，其内部结构应当为三维立体孔状，这种松散的结构可以为种子细胞在其内部附着和扩增提供充足的空间。为达到修复受损的组织或者器官的目的，需要手术手段将支架材料植入，但是这就不可避免的造成了对于机体的手术创伤。而可注射型温敏水凝胶则提供了另一种避免了手术创伤的可能，温度低时水凝胶为溶液，将药物、蛋白、基因或者细胞等与温度低时成水凝胶的溶液混合均匀，只需要对患者给与常规注射器注入，将携带有目的药物的凝胶混合液注射至局部病变位置，在水凝胶在体温条件下可于局部快速形成凝胶，此后，持续缓慢的释放目的药物，发挥治疗效果。同时载有药物的水凝胶缓释体系注射入到目的部位，液态的水凝胶具有可流动性。可以根据受损部位的不同而形成对应形态的凝胶，利于不规则形状缺损的治疗。
PLGA-PEG-PLGA 三嵌段温敏水凝胶聚合物具有温度敏感性，可随着温度改变而自发发生凝胶相转变[121, 126, 127]，凝胶转变温度的影响因素是聚合物本身的分子结构，PLGA 链段越长、丙交酯/乙交酯比例越高，凝胶转变温度越低。研究证实，PLGA-PEG-PLGA 温敏水凝胶主要通过自由扩散和凝胶降解缓释等方式完成药物释放。
1.PLGA-PEG-PLGA 的合成
利用 PEG 作为大分子启发剂，辛酸亚锡催化乙交酯、丙交酯，诱导开环聚合反应的发生，人工合成PLGA-PEG-PLGA 三嵌段聚合物。具体方法如下：取干燥、洁净的 500ml 反应瓶，反应瓶中投入 PEG，油浴加热至 130 ℃，搅拌下真空抽滤三个小时,以去除 PEG 中残留的水分。然后向反应瓶中按照比例加入丙交酯、乙交酯，丙交酯/乙交酯摩尔比为 2:1，油浴加热至 130 ℃，搅拌下真空抽滤 30 分钟,待所加试剂熔融完全，向反应瓶中加入甲苯（体系重质量×0.8）和催化剂辛酸亚锡（体系质量×0.6%）。搅拌下油浴加热至 130℃，反应 24 小时。待上述反应完毕，初产物冷却至室温（淡黄色、油状）后，用 8-10 倍体积的甲醇/乙醚（1：10）沉降反应物，可见白色絮状沉淀，减压过滤获得 PLGA-PEG-PLGA 初产物。再次将初产物溶解于二氯甲烷中，待完全溶解后缓慢置入冷乙醚中，可见大量白色絮状沉淀，减压过滤获得 PLGA-PEG-PLGA 聚合物，真空条件下抽干 PLGA-PEG-PLGA 聚合物。将 PLGA-PEG-PLGA 聚合物溶液进行透析，除去参与有机溶剂后冻干反应物，即PLGA-PEG-PLGA 三嵌段聚合物，产率约为 88%。
2三嵌段 PLGA-PEG-PLGA 水凝胶体内降解及生物相容性实验
体外和体内研究表明，这些热胶凝共聚物具有良好的生物相容性和机械性能。注射后水凝胶迅速形成，并且在注射部位周围未观察到
明显的免疫反应。 6,37。PEG-PLGA共聚物可降解，并且在体外和体内，凝胶状态持续更长的时间。实验室合成的线性PLGA-PEG-PLGA共聚物在皮下注射Sprague Dawley大鼠后，相关的物理水凝胶持续
了3周以上。根据Jeong 等人的研究，PLGA-g-PEGGA基质在体内持续2个月以上，而PEG-g-PLGA基质在一周内消失；通过将两种聚合物以不同的比例混合，可以将凝胶的持续时间调整为1周至3个月。一些添加剂还可以显着改变这些热胶凝体系的相变温度。 NaCl作为典型的盐溶性溶质，可以使相图中的溶胶-凝胶转变边界转变为较低的温度，而NaSCN作为典型的盐溶性溶质产生相反的作用。 22因此，胶凝点在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的溶液不同于在纯水中的溶液。出乎意料的是，发现添加PEG均聚物22,35或PEG化药物35可以降低溶胶-凝胶转变温度。这种现象提供了一种在医疗应用中调节可注射材料的胶凝温度的实用技术。但是，添加亲水性聚合物增强两亲性嵌段共聚物的物理胶凝的原因仍然未知。24
3.PLGA-PEG-PLGA装载药物分子在肿瘤方面的应用
PEG-PLGA共聚物水凝胶已被用作药物输送载体。PEG-PLGA-PEG水凝胶的酮洛芬（一种亲水性药物）和螺内酯（一种疏水性药物）在体外的释放分别持续了2周和2个月。6各种其他治疗剂已被封装进去，然后也从PLGA-PEG-PLGA共聚物水凝胶中释放出来。药物包括紫杉醇，刺激粒细胞集落的因子，猪生长激素，胰岛素，溶菌酶，睾丸酮等。紫杉醇是一种抗癌药，在体外从23 wt％的PLGA-PEG-PLGA共聚物水凝胶（ReGel）连续释放超过50天，而相应的Pluronic F127则为 1天。37上述制剂的肿瘤内直接注射显示该药物是从注射部位缓慢清除的，几乎没有分布到任何其他器官中。针对人类乳腺肿瘤异种移植的ReGel-paclitaxel制剂显示出更高的效率，且与药物相关的副作用更少。37现在，这种新颖的ReGel-pacli-taxel制剂正处于临床试验的后期阶段，预计将在不久的将来投放市场。为了治疗因胰腺β细胞功能异常和胰岛素抵抗而引起的疾病，Kim的研究小组评估了ReGel制剂体内和体外的胰岛素持续释放。38零级释放曲线为观察到体外释放持续超过2周。在Zucker糖尿病脂肪大鼠中单次注射后，持续的胰岛素释放将血糖水平维持在正常血糖范围内近2周。38此外，胶束的形成可能会增加疏水性药物如紫杉醇和环孢霉素A的溶解度。以阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤为基础的联合载药凝胶治疗骨肉瘤，获得较好的临床效果[36]，给与患者载药凝胶治疗后，检测肿瘤组织内基因 Bcl-2、Caspase-3 和 Caspase-9表达，可发现抗凋亡基因其含量明显降低，凋亡基因表达增高。联合阿霉素、顺铂和甲氨蝶呤水凝胶组的基因表达量改变最高，证明联合用药对于骨肉瘤治疗具的治疗效果最佳。
4.PLGA-PEG-PLGA载药体系在缺血组织内的应用
为改善单一水凝胶释放过快的弊端，有学者将纳米金刚石（ND）或者介孔二氧化硅作为纳米填料掺入水凝胶中以增强机械性能，而且它们还可以与 VEGF 非共价连接并从水凝胶中提供血管生成生长因子的持续释放。然而，将该技术推向潜在临床转化作为伤口愈合系统的未来工作包括优化 VEGF 的释放曲线以实现将引起愈合反应的浓度，以及评估小动物模型中的体内治疗功效。此外，为了有效设计纳米复合水凝胶应该能够调节伤口愈合过程中涉及的多种生长因子的释放，包括血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子-b（TGF-b）[51,52]。多孔支架可用于组织工程特别是肽激素的药物装载和递送。但是，肽激素迅速通过其多孔结构扩散出去，从而难以实现所需的功能。近来，已经进行了各种努力以通过向用于细胞移植的可生物降解的聚合物中引入官能团来控制在细胞移植的支架中生长激素的释放在通过用基质胶包被含有VEGF的支架来控制VEGF的释放。VEGF从多孔支架上的释放在30分钟内饱和，此后没有变化。当支架涂有Matrigel时，VEGF能够以受控方式释放超过210分钟这表明在水凝胶支架上引入Matrigel涂层可能允许VEGF的控制释放和延长的功能。
PLGA-PEG-PLGA载药体系加速皮肤伤口愈合皮肤在保护人体免受伤害和微生物入侵方面起着重要作用。但是，由于受伤，烧伤或人身伤害，它经常遭受不同程度的缺陷。[1,2]在某些严重情况下，例如大的全层皮肤缺陷，需要很长时间才能完成完整的伤口修复。一般而言，愈合过程的时间越长，获得的结果越差。因此，已开发出各种伤口敷料，包括但不限于橡胶，泡沫，膜和电纺纳米纤维，以加速伤口闭合，促进伤口愈合并减少疤痕形成。[3−8]
其中，水凝胶敷料因其优异的性能而备受关注，例如保持湿润的伤口床，提供气体交换和吸收伤口的液体。[9−15]特别是，可注射原位形成的水凝胶是伤口更理想的选择敷料和其他生物医学应用。[9,16−23]这些材料通常在应用前处于低粘度溶胶状态，通过简单的物理混合即可捕获各种药物，然后在给药后填充不规则的缺陷，原位转化为水凝胶并粘附在伤口上。]此外，PLGA-PEG-PLGA 水凝胶的降解产物还含有乳酸，可以刺激血管生成和辅助角质形成细胞和成纤维细胞的
增殖和迁移[36,37] 此外，理想的伤口敷料应具有抗感染的抗菌性能。实际上，细菌感染是伤口治疗中的一个严重问题，不仅刺激渗出液形成，而且严重延迟了愈合过程，甚至可能导致败血症，从而增加了截肢和死亡的风险。替考拉宁（TPN）作为一种具有与万古霉素相似的活性谱的糖肽抗生素，对革兰氏阳性细菌（包括耐甲氧西林
的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌）具有更好的抗感染作用，但毒性副作用较小[49−51]，载有 TPN 的热凝胶系统作为伤口敷料可以促进全层皮肤缺损模型中的伤口愈合过程。合成了两种具有不同 PEG / PLGA 嵌段比的 PLGA-PEG-PLGA 三嵌段共聚物，并用于构建具有可调节胶凝性能的共混热凝胶。载有 TPN 的热凝胶配方可通过将 TPN 粉末
溶解在共混热凝胶。聚合物混合物水溶液可能会在人体温度下原位形成热凝胶储库，显示出对皮肤，组织和皮肤的良好粘合性在体外表现出超过3种持续释放的方式周。同时，药物释放概况已准备就绪
通过改变载体聚合物的混合比例来调节以及药物装载量在体内测试中给予热凝胶制剂抑制炎症反应，加速再上皮化，促进胶原的合成和处置，以及刺激的血管生成，从而增强伤口愈合过程。这个功能归因于生物活性的组合TPN和热凝胶基质的酸性。总体而言结果表明，TPN加载的PLGA-PEG-PLGA热凝胶是用于皮肤的有希望的伤口敷料伤口愈合。
3.总结
在过去的十年中，见证了各种各样的新型可注射水凝胶。注射系统是给药前的低粘度水溶液或悬浮液，但会通过化学交联或物理缔合在体内半固化或渗透。因此，细胞或药剂能够简单地通过在目标位置以最小的侵入性通过注射器注射其水溶液来原位包埋。化学水凝胶具有相对强而稳定的机械性能。但是体内化学反应可能对人类有害。考虑到这一点，物理胶凝是有益的。热凝胶共聚物水凝胶由于其操作的便利性而特别有吸引力。逆热敏性对于生物医学应用是有意义的，因为
在注射前对包封的蛋白质或细胞的保护很重要。在这些新型材料中，PEG-聚酯共聚物水凝胶具有潜力。它们具有生物相容性且可生物降解，且降解速率可调。可以通过改变分子量，嵌段共聚物的组成（包括端基）和浓度以及添加剂来调节胶凝行为。PEG-聚酯嵌段共聚物的两亲性是引起热敏性的关键内在因素。由疏水相互作用驱动的宏观自组装是引起热胶凝的原因。
随着再生医学的迅速发展，对受控药物或细胞递送的需求正在增加。与传统的药物载体和组织工程支架相比，可生物降解和可注射的合成水凝胶提供了替代材料。除了生物相容性以外，对于任何作为药物或细胞载体的特定应用，都应牢记植入物基质的适当生物降解速率。就毒品媒介而言，还应考虑各种毒品的渗透性和对其释放曲线的精确控制；作为组织工程材料，细胞粘附性的增强和细胞对凝胶柔软度的响应是两个具有挑战性的课题。物理胶凝的详细机理，特别是逆热敏性，是一个了不起的话题。还值得注意的是，在加入药物，细胞或什
至细胞培养基后，共聚物体系的相变行为可能会改变。因此需要对可注射水凝胶进行进一步的基础研究。任何一种水凝胶都不可能满足所有生物医学应用的评论。因此，未来将不得不针对特定应用量身定制新型的可注射材料。对于潜在的应用，应该考虑材料特性的集成，而不是仅使用一种。尽管在包括热凝胶嵌段共聚物在内的可注射水凝胶的基础研究方面已经取得了很大进展，但是这种软物质或湿材料的丰富物理性质无疑将使可注射水凝胶成为未来十年化学和材料科学领域的重要课题。
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