NS1619对脑胶质瘤u87细胞活性作用

　　【摘要】目的：胶质瘤是颅内恶性肿瘤的一种，发生率最高，接近一半。由于该肿瘤细胞长得很快，而且呈浸润性生长方式，因此即使通过手术也很难将肿瘤切干净，而且复发率很高。其中，胶质母细胞瘤的恶性程度最大，预后效果也是最差，病患的平均生存率最多也只有几个月。但限于医学水平的发展，目前，胶质瘤还是以手术切除，术后放、化疗为主，对于不能手术的，只能采取放、化疗的方式。虽然神经导航和术中MRI的应用一定程度上保障了手术切除的安全性和彻底性，但是仍不能解决复发的困扰。但不论手术与否，化疗是治疗胶质瘤的一种重要方式，因此，如何研制、生产出“对症下药”的化疗药是胶质瘤研究领域的重要方向。NS1619作为选择性电导钙激活钾通道开放剂，对于U87细胞活性产生一定的影响。本文将以此为切入点，试图表明NS1619在浓度不同的情况下对大鼠脑胶质瘤U87细胞是否会产生不同的抑制影响。

　　方法：作者将采取培养脑胶质瘤细胞的方式来建立脑胶质瘤大鼠模型，然后通过颈内动脉灌注BK、KC，激动剂NS1619,以此观察毛细血管内皮细胞是否发生变动，同时，使用不同浓度的NS1619液体作用于大鼠脑胶质瘤U87细胞，以得到U87细胞活性的变化情况。本文也将采取CellCountingKit-8（简称CCK-8）方法来制作细胞生长存活率柱状图。

　　结果：NS1619的浓度越高，U87细胞活性越低，即二者成反比。

　　结论：NS1619能够有效地扼制u87细胞的增长，其浓度越高，作用力越强。

　　【关键词】NS1619、u87、细胞活性

　　脑胶质瘤是一种原发性肿瘤，其病因为存在于大脑和脊髓的胶质细胞发生癌变。脑胶质瘤的形态不固定，因此可以根据其形态特征将其划分为星形细胞瘤和少枝细胞瘤，此外还有混合胶质瘤和室管膜瘤。世界卫生组织也对脑胶质瘤进行了分级：1级到4级。其中，1级脑胶质瘤的偏良性，预后为最好，随着级数增加，脑胶质瘤的恶性程度也增大，4级脑胶质瘤为严重恶性，预后为最差。

　　在已发现的所有颅内肿瘤案例中，脑胶质肿瘤所占比例约为46%。世卫组织1998年的报告数据表明恶性脑胶质瘤对54岁以下患者的影响最大，其中在34岁以下患者中，恶性脑胶质瘤是引起死亡的第二大原因；在35岁至54岁之间的患者中，恶性脑胶质瘤是引起死亡的第三大原因。偏良性的脑胶质肿瘤如1级脑胶质肿瘤，其肿瘤细胞增殖较慢，潜伏期长，症状不明显，在症状出现约2年后患者才会有明显不适；恶性脑胶质肿瘤如4级脑胶质肿瘤，其肿瘤细胞增殖迅速，瘤体增大明显，患者一般在3至6个月内会有明显不适。

　　脑胶质瘤对患者所产生的影响都是由于其具有的占位效应，所谓占位效应，即脑胶质瘤在产生部位不断生长具有一定的空间体积后会对周围组织器官造成挤压或导致其他组织器官移位，影响这些组织器官的正常功能行使，进而引发患病症状。常见的脑胶质瘤症状有头痛、癫痫和恶心呕吐。具体地，作为脑胶质瘤的一种类型，视神经胶质瘤可能会使患者视力下降甚至失明；脊髓胶质瘤患者会经常性发生肢体疼痛与麻木；中央区胶质瘤患者可能在运动和感觉方面存在障碍；语言区胶质瘤影响患者的表达与理解能力。由于不同位置的胶质瘤会产生不同的症状，不同级别的胶质瘤会有不同的病程，因此通过对患者病程的考量和症状的了解，可以对胶质瘤的发生位置和恶性程度有一个初步的判断。为保证判断的准确性以及后续治疗的针对性，患者还需要进行包括磁共振在内的一些其他的相关检查，通过病理诊断后基本可以确诊。

　　在人体组织细胞中，有许多负责物质转运的通道，其中钾离子通道分布极广，几乎存在于全身的组织细胞中，同时钾离子通道在细胞增殖和分化过程中发挥着极其重要的作用，也与肿瘤细胞的转移关系密切。从目前的研究来看，已有大量实验数据证明，多种钾离子通道在胶质瘤细胞中高水平地表达，且该种表达具有特异性，影响着胶质瘤细胞的增殖与迁移。在众多高表达的钾离子通道中，一些钾离子通道可以开发作为胶质瘤的标志物，对这些钾离子通道的检测结果可以作为诊断和预防的重要依据，同时在治疗胶质瘤的过程中，也可以针对性地给药治疗。和其他部位和种类的肿瘤相同，胶质瘤的产生一方面是由于家庭遗传，另一方面是由于环境影响，两者也可共同作用。在我国，胶质瘤主要的治疗方法有手术切除、放射性疗法和化学药物疗法，此外还有比较前沿的疗法即药物靶向治疗。但脑胶质瘤的生长模式为浸润生长，瘤体和周围正常的组织不能明显区分，因此手术切除难度很大，也难以完全切除瘤体。此外，脑胶质瘤对目前的放疗条件和化疗药物敏感性不强，治疗后经常性复发，预后效果极差。

　　NS1619是选择性电导钙激活钾通道开放剂，它可来自不同组织的肿瘤细胞中进行选择性地表达，从而影响肿瘤细胞的增殖分化与侵袭凋亡过程，同时它在正常组织细胞中表达能力被完全抑制或表达能力弱。本实验通过观测不同浓度NS1619对大鼠脑胶质瘤u87细胞的抑制作用效果并绘制细胞活性柱状图来研究NS1619对u87细胞活性的影响。

　　1实验材料和仪器

　　（1）实验材料

　　u87细胞购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心

　　KCa通道激动剂NS1619

　　DMEM培养基Gibco

　　FBSGibco

　　磷酸缓冲盐溶液（PhosphateBufferSaline，PBS）国药集团化学试剂有限公司

　　胰蛋白酶上海积丰生物科技有限公司

　　青霉素链霉素双抗（PS）Gibco

　　（2）实验设备

　　细胞培养瓶华美生物工程公司

　　台式离心机X贝克曼库尔特公司

　　96孔板上海熠科生物科技有限公司

　　倒置显微镜日本OLYMPUS公司

　　Co2培养箱XThremoFisherScientific

　　可调式液压枪eppendorf

　　多功能酶标仪 thermoscientific

　　高压灭菌锅 济南鑫贝西生物技术有限公司

　　电子恒温水浴锅北京长安科学仪器厂

　　钾离子通道开放剂NS1619购自XSigmaChemical公司

　　根据实验要求，配置成不同浓度的样品备用。

　　（2）样品的配制:

　　样品配制成储备液浓度为100mg/ml，实验时用无菌的PBS溶液稀释成终浓度为（5ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml）。

　　把U87细胞放置到培养细胞的容器里，然后把含有百分之十的FBS和百分之一的PS的DMEM高糖培养液放在容器里面，将温度控制在37度，二氧化碳的含量控制在百分之五。同时，要注意每3到5天换一次培养液。等到细胞融合率超过百分之八十的时候，按照1比5的比例进行传代。

　　对于贴壁细胞消化传代，一般采用两种手段。一种是先加入胰酶，等到细胞脱落以后再把培养基放进去阻止胰酶发生作用，进行离心传代，这种方法相对麻烦。第二种是加入胰酶后，在细胞快要脱落的时候，把胰酶拿出来，把培养液放进去。这种方法相对简单，但是这种做法会导致对胰酶的要求更高，因为一般来说，贴壁能力不强的细胞总是更早脱落。但对于肿瘤细胞而言，这部分的细胞基本上属于恶性程度较高的细胞亚群。细胞生成致密单层之后几乎趋于饱和，这时候要让细胞数量变多，体积变大，就得进行传代。当贴壁细胞长成以后，首先在超净工作台上把培养液倒掉，取一定量的PBS液洗两到三次，再放进一定数量（最好是刚盖住细胞）的胰蛋白酶（0.25%），然后慢慢地摇晃容器，当消化液盖住细胞层时，将其放在工作台上。过两三分钟后，在倒置的显微镜下可以看到，细胞慢慢收缩变圆，细胞的间隙慢慢变大，这时候把胰蛋白酶消化液倒掉，然后加一定量的培养液（含有百分之十FBS），用吸管搅拌，这样单细胞悬液便做好了。此时，将制作好的悬液倒一半到另一个培养瓶里面去，盖好瓶盖，再放进再放入 CO2培养箱中进行传代培养；另一半则放进碎冰里去保存以备用。

　　将冻存管从支架上取出来放到三十七度的水里去，然后不停地晃动让其尽快融化。如果冻存管没有密封好，那么在保存的过程中就会跑进去液氮，这时候冻存管可能会因为温度上升，液氮气化而导致爆炸，对人身安全产生一定威胁，所以，在拿冻存管的时候最好要戴上眼镜和手套。等冻存管融化后将其拿出来，先用酒精消毒，然后打开冻存管，用吸管把细胞悬液吸出来，再把离心管放进去，同时加入至少十倍的培养液，混合后低速离心，除去上清液，如此再用培养液洗一次。用培养液稀释到一定程度后，接种培养瓶，然后放在三十七度的保温箱里，第二天换一次培养液，继续培养。细胞复苏的时候发现密度比较高的话就要马上进行传代。对于数生长期的细胞来说，已经长满的细胞被冻存的话，它们很难存活，所以在冻存的头一天要先换一次培养液。将冻存管放到四度的冰箱里两个小时；零下二十度的冰箱里两个小时；液氮表面一个晚上。然后把冻存管放到液氮容器里去，这个时候也最好要戴上手套。虽然细胞可以无限期的在液氮里存放，但是由于很多细胞在第一次冻存后都要在短期内复苏一次以观察其适应性，因此，最好能够每年取一次。

　　一般来说，培养的细胞要有一定的密度才有可能更好地生长，因此，有必要计算细胞的数量。该结果用每毫升细胞数表示。

　　2.3.1活细胞计数法

　　最普遍的计数法叫做平板菌落计数法，其设计原理是每一个活的细菌都可以长出一个菌落。按照这个方法，首先要取适量的菌悬液，并将其稀释到一定程度，然后将这个稀释液进行平板培养，最后，根据培养出的菌落数计算出培养物中的活菌数。这种做法是目前国际上普遍采用，用以计算污染活菌数的手段。在采取这种手段的时候要记住：一是菌落数要控制在三十到三百之间，否则会导致结果不精确；二是可以在培养基里面放进0.001%2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)以避免菌落蔓延；三是这种手段只能用在形成菌落的微生物，反之则不能。

　　对于实验得出的所有结果都用X ± S表示，并使用SPSS16.0统计软件进行分析，对不同的结果采用方差分析法进行检验。当P小于0.05，则表示差异具有统计学意义，P小于0.01

　　产生的所有数据以X ± S表示，采用SPSS16.0统计软件进行分析，对各组间的差异使用方差分析法进行检验，P＜0.05为差异有统计学意义，反之则表示没有统计学意义，而当P小于0.01时，则表示意义显著。

　　CellCountingKit-8（简称CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。产生的甲瓒物的数量越多，活细胞的数量也越多。所以，可以根据这个结论来直接研究细胞增殖和毒性。

　　（1）配置细胞悬液：细胞计数

　　（2）接种到96孔板中：和铺板细胞数相对应，每孔大概为100ul细胞悬液。

　　（3）放到三十七度的培养箱里：细胞在接种后，大概需要二到四小时的时间贴壁，如果不要贴壁的话，这步也就不要了。

　　（4）加入10ulCCK8：因为放进的CCK8的数量不多，可能会导致试剂粘在孔壁上，从而影响结果的准确性。所以，笔者建议在加入试剂之后要轻轻地拍打下培养板帮助混匀。也可以以换液的办法直接加入含10%CCK8的培养基。

　　（5）放置一到四个小时。尤其血液细胞形成的Formazan非常得少，更需要时间来显色（大概五到六个小时）

　　（6）测定450nm吸光度（A）值

　　（7）计算公式：细胞生长抑制率%=[对照组吸光度(A)－实验组吸光度(A)）/对照组吸光度(A)]×100%[9]。

　　（1）把数生长期的u87细胞拿出来，将细胞悬液配置成每孔五千个接种到96孔板上，每孔100uL，然后放在温度为三十七度，二氧化碳浓度为百分之五，湿度为百分之九十五的培养容器里，一天后上清。

　　（2）分别放入浓度为5ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml的NS1619液，空白对照组加入10μl的PBS。

　　（3）每种浓度设三到六个复孔，分别在加药后的三天每天倒入10μL5mg/mL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡），放在三十七度的二氧化碳培养箱里。四个小时后，再用多功能酶标仪于450nm波长下计算每孔的吸光度(A)值。

　　（4）按照细胞生长抑制率%= [对照组吸光度(A)－实验组吸光度(A)）/对照组吸光度(A)]×100%[9]得出不同浓度的NS1619液下u87细胞增值抑制率。

　　结果表明，当药物的浓度增加，细胞生长抑制率降低。由此可见，钾离子通道开放剂NS1619对u87细胞增殖的起到抑制作用。

　　（见表1）

　　表1KCa通道激动剂NS1619对u87细胞增殖的抑制作用

　　在我国，胶质瘤主要的治疗方法有手术切除、放射性疗法和化学药物疗法，此外还有比较前沿的疗法即药物靶向治疗。但脑胶质瘤的生长模式为浸润生长，瘤体和周围正常的组织不能明显区分，因此手术切除难度很大，也难以完全切除瘤体。此外，脑胶质瘤对目前的放疗条件和化疗药物敏感性不强，治疗后经常性复发，预后效果极差。因此，开发靶向药物，对脑胶质瘤进行针对性治疗是脑胶质瘤治疗方法发展的必然趋势。在众多高表达的钾离子通道中，一些钾离子通道可以开发作为胶质瘤的标志物，对这些钾离子通道的检测结果可以作为诊断和预防的重要依据。这些钾离子通道极有可能成为脑胶质瘤治疗的新靶点，成为该种肿瘤治疗方法的新突破。

　　本实验中，先使用不同浓度的NS1619处理脑胶质瘤细胞u87，然后使用CCK8对细胞的抑制程度进行检测，从而探讨NS1619对脑胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。与MTT相比，CCK8检测速度快，且灵敏度高，检测效率高，同时在对低密度细胞测定时表现出较强的优势；此外，在重复性和细胞毒性方面，CCK8也具有一定的优势。

　　本实验选用了钾离子通道开放剂NS1619，将不同浓度的该种试剂添加到u87细胞培养皿中，实验发现：随着NS1619浓度的增加，u87细胞的活性逐渐降低，同时活细胞数目也在减少，该现象表明脑胶质瘤细胞的生长增殖受到NS1619的影响，即NS1619对u87细胞有抑制作用。

　　本实验表明，钾离子通道开放剂NS1619对脑胶质瘤u87细胞有抑制作用，且NS1619的浓度越高抑制作用越明显。

　　1.RicardD,IdbaihA,DucrayF,LahutteM,Hoang-XuanK,DelattreJY．Primarybraintumoursinadults：Lancet，2012：379(9830):1984-96

　　2.徐建堃,徐庚．胶质母细胞瘤的治疗进展[J]：神经疾病与精神卫生，2005：256-258

　　3.林庆堂，张宇航，徐庚．恶性胶质瘤应用替莫唑胺（TMZ）化疗的临床分析：中国全科医学，2012：15(6C):12-17

　　4.姜志超，胡力，，汪立刚，杨孔宾.钾离子通道与胶质瘤关系的研究进展

　　5李佳怡，熊霞.大电导钙激活钾通道与肿瘤[J].西南军医，2010，5，12，(3)：519-521.

　　6活细胞计数.百度百科

　　7不同U87细胞数量对裸鼠原位恶性胶质瘤模型构建的影响.百度百科

　　8大鼠脑胶质瘤模型的建立及意义.山东医药2016年第56卷第16期

　　9MicroRNA-34c在人脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞生物学特性的影响和机制研究.武震东

　　10梁君.钙激活性钾通道在缓激肽选择性开放血脑肿瘤屏障机制中的大鼠在体研究.中国知网

　　转眼间，也接近尾声了，论文的完成也意味着这一段时间的学习生活将划上一个句号了。

　　特别感谢尊敬的张雪梅老师。在这段时间里，老师严谨的治学态度、丰富渊博的知识、敏锐的学术思维、精益求精的工作态度以及侮人不倦的师者风范是我终生学习的楷模，导师们的高深精湛的造诣与严谨求实的治学精神，将永远激励着我。这三年中还得到众多老师的关心支持和帮助。在此，谨向老师们致以衷心的感谢和崇高的敬意！此外还要感潘万马师兄在这段时间的帮助，为我分析及解决试验中遇到的一系列问题，才使我的论文得到顺利的完成。在本次论文设计过程中，师兄对该论文从选题，构思到最后定稿的各个环节给予细心指引与指导，使我得以最终完成毕业论文设计。

　　在此，谨向老师们致以衷心的感谢和崇高的敬意！