摘要
目的基于厚叶岩白菜根和叶转录组测序数据，本研究对厚叶岩白菜bHLH基因进行鉴定和表达分析。方法本研究基于厚叶岩白菜的测序数据，对厚叶岩白菜bHLH基因进行鉴定、生物学信息分析，包括理化性质、亚细胞定位、系统发育、保守基序等，并对其进行表达分析。结果本研究共鉴定到44个具有完整bHLH保守结构域的BcbHLH基因。BcbHLH中富含酸性氨基酸，41个BcbHLH为不稳定蛋白，均为亲水性蛋白。BcbHLH的进化树显示其可分为17个亚家族，BcbHLH蛋白与AtbHLH蛋白具有有较高的保守性。大部分BcbHLH的保守基序以Motif 1和Motif 2为主。BcbHLH基因表达在根和叶中存在差异，4个基因在根中表达较高，6个基因在叶中表达较高。结论本研究共鉴定到44个BcbHLH基因，为进一步深入探究厚叶岩白菜bHLH基因的功能研究奠定了理论基础。
关键词：厚叶岩白菜；bHLH基因；进化树；表达分析
1前言
1.1厚叶岩白菜的生物学特性和价值
厚叶岩白菜（Bergenia crassifolia（L.）Fritsch），为虎耳草科岩白菜属多年生常绿草本植物，主要分布在俄罗斯、蒙古及我国新疆阿尔泰山。厚叶岩白菜株高30~60 cm，叶片肥厚常绿，呈倒卵形或宽椭圆形；极早春开花，圆锥花序，小花6~7朵，花瓣玫瑰红色或紫色，花期3~5月[1]。厚叶岩白菜生长环境独特，数量稀少，生长缓慢，喜欢温暖、潮湿和半荫蔽的环境，耐寒冷，不耐干旱，怕高温和强光，夏季喜凉爽环境[2]。
厚叶岩白菜具有药用、美容、观赏等开发价值，在药用价值方面，厚叶岩白菜含岩白菜素、单宁酸及熊果苷等化学成分，有镇咳、镇痛、消炎、止血、和抗菌作用，可用于治疗妇科月经不调、宫颈糜烂及慢性支气管炎、肺结核咳嗽、支气管哮喘、肺气肿等呼吸系统疾病[3-4]。在美容价值方面，厚叶岩白菜中含有的熊果苷，能够使酪氨酸酶失去活性，有效抑制皮肤黑色素的生成，同时还有杀菌、消炎的作用[5-6]。在观赏价值方面，厚叶岩白菜极早春开花，花型美观，花期长，花粉红色或紫色，花色绚丽，叶色常绿，露红烟紫[2]，若用于地栽，可栽种于花坛或园林下，有清新宜人的山野自然气息，令人身心舒畅，可在园林中广泛应用；也可盆栽置于室内美化环境，既美观又有净化空气之效。
1.2bHLH基因结构特点及功能研究
bHLH（basic/Helix-Loop-Helix）基因的命名是因为该基因具有特有的高度保守的bHLH结构域，即碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）结构域。bHLH结构城由60个左右的氨基酸组成，包含位于N端的碱性区域（basic region）和位于C端的α螺旋1-环-α螺旋2（helix-loop-helix），其可以参与DNA的结合以及蛋白质的二聚体化[7]。N端约15个氨基酸，保守氨基酸可以识别E-box和G-box，主要与DNA结合；C端约40个氨基酸，由疏水性氨基酸形成疏水区，能够与另一单体结合，形成同源或异源二聚体[8,9]。
bHLH基因普遍存在于植物中，在植物的生长发育、胁迫响应和次生代谢等方面起重要作用，同时也参与各种物质的合成与信号传导。1989年首次从玉米中发现并克隆得到第一个bHLH转录因子，研究发现，它可以与其他蛋白质协同形成蛋白质复合物，共同调节叶片和果皮等组织的颜色，这引起了人们对植物bHLH基因的探索欲望，并利用不断发展的生物学技术对其功能进行了更加深入、全面的研究[10]。Ⅲf亚家族的AtbHLH1（GL3）、AtbHLH2（EGL3）调控拟南芥中根表皮细胞的分化，并且发现GL3和EGL3基因表达和RNA积累优先发生在发育中的根毛细胞中[11]。Ⅲb亚家族的AtbHLH116可以参与增强植物的抗寒特性的响应胁迫应答，是一种抗低温调节子[12]。同样，研究人员将西瓜幼苗置于低温、高盐胁迫时，检测到ClabHLH41表达水平大幅度提升，在ABA胁迫下亦是如此，这些极大概率地验证了该基因与以上3种胁迫应答存在紧密联系[13]。在植物次生代谢方面，从红花中分离出参与调控类黄酮合成途径的转录因子CtbHLH1在花瓣中表达量高，表达量会在花期初始时开始明显提升直至开花第3 d达到最高，而后又随着花期至末期到达最低，表明其可能在类黄酮早期合成中发挥重要作用[14]。在海南龙血树的研究中，Ⅲf亚家族的DcbHLH5可以与类黄酮生物合成相关基因中的DcCHS1、DcCHS2和DcCHI1启动子结合并激活它们的表达，表明该基因参与海南龙血树茎中类黄酮的生物合成[15]。IbbHLH2与甘薯块根中花青素的含量显著相关，并且IbbHLH2在紫色甘薯的各个组织中表达量都明显高于在非紫色甘薯中的表达量[16]。Ⅺ亚家族的PqbHLH42和Ⅶ（a+b）亚家族的PqbHLH27可能与西洋参中人参皂苷等萜类物质合成有关，PqbHLH21可能通过正调控Rb1生物合成途径进而影响到西洋参总皂苷的生物合成，而PqbHLH22可能通过正调控Re生物合成途径影响西洋参总皂苷的积累[17,18]。虽然对bHLH基因的研究已有明显重大的进步，但这些功能研究仍具有一定的局限性，仍有大部分bHLH基因未得到功能鉴定。
1.3研究目的及意义
厚叶岩白菜具有较高的药用价值及观赏价值，厚叶岩白菜含有岩白菜素、熊果苷等化学成分，有清热解毒、止咳、抗炎、调经等功效。对厚叶岩白菜的需求量也日益增加，而目前大部分研究集中在厚叶岩白菜的无性繁殖、离体培养、化学成分、生物活性等[1,3,19,20]方面的研究，对厚叶岩白菜bHLH基因的研究鲜见报道，其bHLH功能仍然未知。由此开展了对厚叶岩白菜bHLH基因的鉴定及分析研究，本研究利用厚叶岩白菜根和叶转录组测序数据，对bHLH基因家族成员进行了鉴定和表达分析，为进一步研究厚叶岩白菜bHLH基因的生物学功能提供科学依据。
2材料与方法
2.1实验材料
本研究材料取自于平顶山学院的三年生厚叶岩白菜，分别取根和叶，液氮速冻，−80℃保存备用，提取RNA，三次生物学重复。从PlnTFDB数据库中获取拟南芥bHLH蛋白序列，相应的在线分析工具见表1。
2.2BcbHLH基因的鉴定
将厚叶岩白菜进行转录组测序，从PFAM数据库下载bHLH（PF00010）的隐马尔可夫模型，以该模型作为探针，利用HMMER 3.0软件对厚叶岩白菜转录组数据进行BLASTP检测，获取候选基因，E-value设为1e-05，并去除重复和少有的明显错误的序列。进一步使用在线程序SMART和NCBI-CDD筛选，手动删除不完整或不具有bHLH结构域的序列。
2.3BcbHLH的理化性质的分析与亚细胞定位预测
利用在线程序ExPASy中Protparam模块对鉴定得到的BcbHLH蛋白进行理化性质分析，预测其分子量、等电点、平均疏水性等。使用WoLF PSORT在线软件实现BcbHLH基因的亚细胞定位。
2.4BcbHLH的系统进化树分析
本研究以拟南芥为参考，利用MEGA 7.0软件对BcbHLH蛋白采用邻域连接法建立了无根系统发育树，选择Bootstrap测试，重复次数1000，分析BcbHLH和AtbHLH之间的系统进化关系，输出为NWK格式的文件，最后根据进化树分类情况利用ITOL网站进行修饰并丰富颜色。
2.5BcbHLH的MEME分析与多序列比对
将厚叶岩白菜bHLH的蛋白序列提交到在线网站MEME SUITE进行保守基序分析，基序数量设为9，宽度10~70，输出MAST XML文件，并用TBtools软件作图。利用Clustalx1.83软件对厚叶岩白菜蛋白序列进行多序列比对，选择File中Append sequences上传蛋白序列，在选择Alignment中Do Complete Alignment获得多序列比对图。
2.6BcbHLH的表达分析
利用厚叶岩白菜根和叶的转录组测序数据分析bHLH基因的表达特征，以FPKM值表示转录本丰度。
3结果与分析
3.1BcbHLH基因注释筛选
本研究基于转录组测序得到104个厚叶岩白菜bHLH基因，以拟南芥bHLH蛋白序列进行隐马尔可夫模型和BLAST P搜索，并利用在线程序PFAM和NCBI-CDD对目标序列进行结构域注释，确定将具有完整保守结构域的序列作为最终的bHLH序列，最终获得44个bHLH基因，分别命名为BcbHLH1~BcbHLH44，结果见表2。
3.2BcbHLH的理化性质分析与亚细胞定位预测
利用ExPASy在线程序对厚叶岩白菜bHLH蛋白的理化性质进行分析，结果如表3所示。BcbHLH基因长度为906到6676，平均值为2150.0；BcbHLH的ORF长度为354到2169，平均值为1185.28；BcbHLH蛋白序列的氨基酸数目为117到722，平均值为384；预测其分子量为13407.04到80139.14Da，平均值为43514.19；等电点在4.88到9.51范围内。从整体看，75%的厚叶岩白菜bHLH蛋白的理论等电点在4到7范围内，表明大多数厚叶岩白菜bHLH蛋白理论等电点是酸性的，其蛋白分子中富含酸性氨基酸。不稳定系数在35.11到75.23范围内，其中只有BcbHLH15、BcbHLH26和BcbHLH43的不稳定系数<40为稳定蛋白，其余41个均为不稳定蛋白；脂肪系数在46.21到94.19范围内；蛋白平均亲疏水性分析结果表明，44条序列的平均亲疏水性均为负值，判断厚叶岩白菜bHLH蛋白质均为亲水性蛋白，但是不同蛋白之间亲水性存在差异。利用WoLF PSORT在线软件对厚叶岩白菜bHLH蛋白进行亚细胞定位预测，所有的bHLH蛋白均定位于细胞核中，推测BcbHLH可能通过调控细胞核基因的转录来发挥功能。
表3 BcbHLH的理化性质与亚细胞定位
3.3BcbHLH的系统进化树分析
为了确定BcbHLH的分类和进化模式，构建了厚叶岩白菜bHLH的44个成员与来自拟南芥的AtbHLH成员的系统发育进化树见图1。基于拟南芥bHLH成员的分类情况，BcbHLH可以分为17个亚家族，其中X、Orphans亚家族均仅有1个bHLH成员，而Ⅻ亚家族具有最多的7个BcbHLH成员，其他亚家族有2～4个bHLH成员。其中除II、Vb、Ⅷb、Ⅲ（a+c）和XV亚家族不含BcbHLH，其余亚家族均有分布。其中Ⅲb亚家族含BcbHLH21，BcbHLH35；Ⅹ亚家族含BcbHLH22；Ⅶ（a+b）亚家族含BcbHLH9、BcbHLH18、BcbHLH42；Ⅲf亚家族有BcbHLH30、BcbHLH33。
图1厚叶岩白菜bHLH系统进化树
3.4BcbHLH蛋白Motif分析与多序列比对
本研究对BcbHLH蛋白进行保守基序（Motif）的预测，44个BcbHLH蛋白的Motif位置见图2。Motif 1~Motif 9用不同的颜色来显示出。结果显示，BcbHLH含有的保守基序数量在1~5不等。已有研究表明，bHLH结构域是由某些基序共同组成的，有32个BcbHLH蛋白质都含有Motif 1和Motif 2，推测其是厚叶岩白菜bHLH蛋白质保守结构域的特征保守基序。通过InterPro数据库搜索这些基序发现，Motif 1和Motif 2匹配到basic helix-loop-helix结构域，结果见图4。结合进化树可以看出，同一亚家族的大多数bHLH蛋白的基序组成相同且分布位置相近，同时同一亚家族的Motif模式也存在差异。Ⅲ（d+e）亚家族有5个Motif，最为复杂且除BcbHLH28不含Motif 3外，其他蛋白含有完全相同的Motif类型。在某些特定的亚家族中，存在一些特殊的基序，如Motif 8仅存在于Ⅻ亚家族，暗示着这些成员可能具有多种功能。
为了研究这些厚叶岩白菜bHLH结构域的序列特征，对44个bHLH氨基酸序列进行了多序列比对见图3。比对结果表明，35条bHLH序列同时在13位点和17位点同时为E和R，该序列组成可以结合E-Box，有29条bHLH序列同时在9位点、13位点和17位点同时为H、E和R，主要有结合G-Box的功能。N端碱性结构域富含碱性氨基酸精氨酸（R）、组氨酸（H）和赖氨酸（P），C端的HLH结构域的α螺旋富含疏水性氨基酸亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、丙氨酸（A）、脯氨酸（P）、异亮氨酸（I），其中第27位点的L高度保守，这表明其对促进bHLH蛋白之间的二聚体形成极为重要。
图2 BcbHLH结构分析
（A）BcbHLH进化树；（B）BcbHLH保守基序分布；（C）BcbHLH保守结构域
3.5BcbHLH基因表达分析
本研究分别取厚叶岩白菜的根、叶，对其44个bHLH基因的FPKM值进行分析，发现厚叶岩白菜各bHLH基因在不同部位有不同程度的表达，结果见表3。总体上看，44个BcbHLH基因在根中表达量高于叶。相对于叶中的基因表达量，BcbHLH12、BcbHLH17、BcbHLH33、BcbHLH39在根中的表达量较高，而BcbHLH9、BcbHLH16、BcbHLH18、BcbHLH21、BcbHLH30、BcbHLH42在叶中表达量较高。其中有4个基因在不同组织中表现出特异性，BcbHLH4在叶中特异性表达，而BcbHLH11、BcbHLH20和BcbHLH25在根中表现出特异性。BcbHLH19、BcbHLH24、BcbHLH28、BcbHLH34、BcbHLH38在根和叶呈现组成型表达。
表3 BcbHLH不同组织的FPKM值
4讨论与结论
4.1讨论
本研究通过对厚叶岩白菜bHLH基因进行鉴定，最终筛选出了44个BcbHLH基因。对BcbHLH的保守基序（Motif）分析中，Motif 1和Motif 2匹配到basic helix-loop-helix结构域，推测其在保守功能方面起关键作用。44个BcbHLH的保守基序组合模式与其系统进化树的聚类结果趋向一致，同一亚家族蛋白保守基序基本一致，但是各组之间存在显著差异。在某些特定的亚家族中，存在一些特殊的基序，这表明这些保守基序在亚家族的特异保守功能中扮演着至关重要的角色。44个厚叶岩白菜bHLH蛋白中的35个具有E-box的结合功能，29个具有结合G-box的结合功能，该结果与生菜[21]的分析结果相似。
不同植物中，同一亚家族的成员可能会具有共同的进化起源，在功能上具有保守性[22]。AtbHLH1（GL3）、AtbHLH2（EGL3）调控拟南芥中根表皮细胞的分化，并且发现GL3和EGL3基因表达和RNA积累优先发生在发育中的根毛细胞中[11]，与其相邻且同聚在Ⅲf亚家族的BcbHLH33在根中表达量较高，推测其可能参与厚叶岩白菜根毛细胞的分化。拟南芥AtbHLH116是抗低温调节子，能够提高植物的抗寒和抗冻能力[12]，在厚叶岩白菜叶中高表达的BcbHLH21与拟南芥的AtbHLH116位于同一分支，推测BcbHLH21可能与植物的抗低温调控有关，可能是厚叶岩白菜叶片耐寒特性的关键调控子。有报道，AtbHLH中的Ⅶ（a+b）亚家族参与到植物光合作用电子传递过程[17]，其中BcbHLH9、BcbHLH18、BcbHLH42均属于此家族，并且这3个基因在叶中高表达，推测以上BcbHLH基因可能参与厚叶岩白菜叶的光合作用等生理活动。AtbHLH112是一种转录激活剂，它通过与GCG或E-box结合来调节基因的表达，从而提高盐、干旱和ABA胁迫耐受性[23]，推测与其同亚家族的BcbHLH22也可能具有相似的作用。已有研究表明在厚叶岩白菜的不同部位中岩白菜素和熊果苷的含量存在显著差异，岩白菜素在根的含量较高，约为叶的61~68倍，而熊果苷在叶片中的含量则相对较高，约为根的2~4倍[24-25]。本研究中，BcbHLH12在厚叶岩白菜根中的表达量较高，推测其可能参与厚叶岩白菜中岩白菜素的合成；而BcbHLH9和BcbHLH18在厚叶岩白菜叶中的表达量较高，推测其可能与厚叶岩白菜中熊果苷的合成相关。
4.2结论
本研究基于厚叶岩白菜根和叶转录组测序数据，共鉴定到44个具有完整bHLH保守结构域的BcbHLH基因。BcbHLH中富含酸性氨基酸，41个BcbHLH为不稳定蛋白，均为亲水性蛋白。BcbHLH的进化树显示其可分为17个亚家族，BcbHLH蛋白与AtbHLH蛋白具有有较高的保守性。大部分BcbHLH的保守基序以Motif 1和Motif 2为主。BcbHLH基因表达在根和叶中存在差异，4个基因在根中表达较高，6个基因在叶中表达较高。
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致谢
写到这里，意味着我与xx的故事接近了尾声，始于2019年初秋，终于2023年盛夏。弥足珍贵的四年本科生活让我收获良多，我很幸运在我人生最美好的时光里，我一直在遇见许多不同的可爱善良的人，她们给了我最好的回忆，给了我最真诚的人生建议。
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家人之爱，永记于心。感谢父母二十多年来的悉心培养，感谢父母一直在背后默默的支持我，正是因为你们的支持和付出，才能让我圆满的完成求学之路。失意时给予我鼓励，任性时给予我宽容，难过时耐心听我吐露心声。由衷的感谢我的家人们，唯愿家人平安顺遂。
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行文至此，己感慨万千，片纸有尽，而感激之情无尽。
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