茶树病害拮抗微生物的筛选与鉴定

　摘要：茶树叶片是茶树经济效益的主要来源，由拟盘多毛孢菌Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis引起的茶轮斑病、炭疽菌Colletotrichum camelliae引起的茶云纹叶枯病以及由茎点霉属真菌Didymella segeticola引起的茶叶斑病是茶树叶部常见的几种真菌性病害，严重影响茶叶产量和品质。生物防治是指利用一些特定的生物或生物的代谢物有效防治病虫害的方法，可分为微生物防治、昆虫天敌防治、植物源农药防治等方面，具有不产生污染、副作用少等优势。本实验分离鉴定了两株可用于拮抗微生物筛选的菌株：菌株C19-4、菌株C21-7。通过观察菌株C19-4和C21-7的形态学特征并结合分子系统发育树的分析，将菌株C19-4鉴定为Fusarium avenaceum，将菌株C21-7鉴定为Trichodema harzianum。以拟盘多毛孢菌、炭疽菌和茎点霉属真菌为研究对象，C19-4、C21-7为拮抗菌，通过平板对峙法和抑菌圈法进行拮抗筛选。平板对峙实验中，菌株C19-4对拟盘多毛孢菌的拮抗效果最好，抑菌率分别为76.67%；菌株C21-7对三种病原菌均表现出明显的拮抗作用，其中对炭疽菌的拮抗效果最好，抑制率为80.65%。抑菌圈实验中，菌株C19-4发酵液对茎点霉属真菌的拮抗效果最好，抑制率为30.87%；菌株C21-7发酵液只对拟盘多毛孢菌有拮抗效果最好，抑制率27.83%。实验明确了菌株C21-7（Trichodema harzianum）与菌株C19-4（Fusarium avenaceum）对炭疽菌、拟盘多毛孢菌及茎点霉属真菌三种病原菌的抑制效果，为菌株C21-7（Trichodema harzianum）和菌株C19-4（Fusarium avenaceum）拮抗由炭疽菌引起的茶云纹叶枯病、拟盘多毛孢菌引起的茶轮斑病、茎点霉属真菌引起的茶叶斑病的机理探讨和对相关次生防菌菌剂的合理开发利用，奠定了条件基础和理论支撑。

　关键词：茶树病害；拮抗；抑菌率；鉴定

1文献综述

　　1.1茶树病害

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属多年生灌木或小乔木植物[1]，主要生长于热带或亚热带地区,气候温暖高湿[2]。随着我国茶叶种类的不断丰富，茶园面积的持续增长，茶树病害种类也随之增多，加之我国茶园多分布在温暖多雨的地区[3]，适合各种病菌繁衍和传播，为茶树病害提供了有利的发生条件，对茶叶产量和品质造成损失。据统计，我国茶树病害有140种左右[4]，分布在茶树的叶部、茎部、根部和花上。

茶树叶部病害是指由于病原附着在茶树叶片诱发的茶树叶片病害。主要发生在高海拔、低温、潮湿、日照不足的茶园中。病菌为害茶树新梢和嫩叶，可直接造成茶叶减产；病芽叶加工成的干茶易碎、味苦涩，明显影响茶叶产量和品质[3]。

茶树茎部病害是指由于病原菌感染茶叶枝干部位引起的病害，发生程度较叶部和根部病害为轻，在茶园阴湿、管理粗放、树势衰退的老茶树上发生严重，全国各茶区均有发生，发生后树势衰退，茶叶产量受到影响[3]。引起茶树枝干粗壮脆弱，以及在枝干上生长苔藓等。

茶树根部病害是指由于病原附着在茶树根部而诱发的病害。我国发生的茶树根部病害有10余种,其中常见的有发生在成龄茶园的红根腐病、褐根腐病、紫纹羽病以及发生在幼龄茶树的茶苗白绢病、茶苗根结线虫病[2]。

茶树花部病害是指由于病原附着在茶树茶花上而诱发的病害，茶树花部病原主要有19种[5]，茶树花部病害目前仅见花腐病一种[6]。

1.2茶树叶部病害

叶片作为茶叶的收获部位,茶树叶部病害逐步成为影响茶叶生产和茶农经济收入的重要因素[7]。茶树叶部病原菌主要为真菌,以菌丝体寄生在叶片组织中吸收营养,经过一定阶段的生长进入繁殖阶段[8]。此外,由于大叶种茶树质地柔软,叶片较薄,比小叶种茶树更易感病[9],我国发生的茶树叶部病害有30余种,其中常见的有茶轮班病、茶云纹叶枯病、茶叶斑病、茶炭疽病、茶饼病等[2]。

　1.2.1茶轮斑病

茶轮斑病是由拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）所引起的一种重要的茶树叶片真菌性病害，又叫茶梢枯死病。是一种高温高湿型病害。主要为害成叶和老叶，也可为害嫩梢等，引起叶片枯萎脱落，甚至整株死亡，对茶叶的产量、品质造成严重影响[10]。茶轮斑病在嫩梢、成叶与老叶上的病斑呈圆形或不规则形，黄褐色至黑褐色，上生浓黑色墨汁状小粒点的子实体，沿轮纹排列。病斑中心、边缘或整个病斑表面均呈灰白色。其典型症状是病斑呈明显同心轮纹，似大树主干横切面上的年轮，由此而得名[11]。

1.2.2茶云纹叶枯病

茶云纹叶枯病是由炭疽菌（Colletotrichum camelliae）所引起的高温高湿型疾病，它的危害主要表现在叶片、新梢、枝条和果实上。患病的茶树常会出现叶片脱落、新梢枯死等现象，导致树势衰弱。成叶和老叶上的病斑多在叶缘或叶尖发生,初呈黄褐色,水渍状半圆形或淡绿色的圆形病斑逐渐呈散射状扩展。病斑多在成叶和老叶的叶缘或叶尖处发生，初时呈黄褐色的半圆形水渍状，之后逐渐扩散成散射状，色泽呈暗褐色或赤褐色,1周后病斑由里向外变灰白色,组织枯死,边缘黄绿色,形成灰色、暗褐色和赤褐色相间的不规则斑块,形似云纹状波纹,故名云纹叶枯病[12]。

1.2.3茶叶斑病

由茎点霉属真菌（Didymella segeticola）引起的茶叶斑病，也叫茶叶斑点病。该病害在自然条件下发病初期多表现为随机分布在嫩叶上周围带有黄色晕圈的水渍状褐色或黑色小点，边缘为黑褐色或紫褐色隆起线，病斑大小约为0.7~1.3mm，至发病后期，相邻的病斑相互融合，形成不规则病斑，病斑中心坏死，使茶叶生长发育缓慢、畸形、易脱落，影响茶叶品质和产量[13]。

　1.3木霉属真菌的研究进展

在土壤和其他基质中广泛存在，具有强大的生存能力和广泛的适应性的木霉菌是一种有益的真菌，能够发挥拮抗作用，阻止多种病原真菌的生长和繁殖。特别是对于土传病原真菌来说，木霉菌的拮抗作用尤其显著。这种真菌还能够分解纤维素，使得这些难以降解的有机物质得到有效利用。因此，木霉菌在生物学、农业、环境保护等领域都具有重要的应用价值。迄今为止，国际市场上的含有木霉成分的微生物菌剂和生物肥料有100多种且对由病原菌所引起的各种植物病害防治有显著效果，病害抑制率在70%左右，受到60多个国家的欢迎。我国也研制出了可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂和种衣剂4种木霉菌剂型[14][15]。研究表明，木霉属真菌（Trichoderma asperelloides）及其发酵液对茶炭疽病都有拮抗作用，其中菌株对茶炭疽病菌的抑菌率为76.96%,发酵液对茶炭疽病菌的抑菌率为70.08%[16]。卢声洁等人在2021年的研究中通过平板对峙法和抑菌圈法发现短密木霉（Trichoderma brevicompactum）及其发酵液对茶轮斑病菌的生长有一定的抑制作用[17]。Abhay K.Pandey等人的实验表明里氏木霉（Trichoderma reesei）可作为诱发因子触发茶树防御反应并延缓灰枯病症状，里氏木霉（Trichoderma reesei）诱导防御机制的能力可能成为降低灰枯病感染的有效方法，并提供对环境有害的合成杀菌剂的替代品[18]。

　1.4镰刀属真菌的研究进展

镰刀属真菌分为致病性与非致病性两种，目前对致病性的镰刀属真菌有大量的研究文献与防治方法，但关于非致病性镰刀属真菌的相关研究报道还很少且在防治茶树病害方面还没有相关的应用。镰刀属致病性真菌是一种世界性分布的土传病原真菌,可以侵染120多种不同的植物物种并引起疾病,可引起植物的萎蔫、穗腐和根腐等多种病症[19]。其中包括番茄、香蕉、棉花、拟南芥和茶树[20]。非致病性镰刀属真菌的作用模式研究对于生物防治有重要意义。Ogawa证明非致病菌可以阻碍F．oxysporum f．sp．batas在甘薯定殖［21］。

Fravel和Larkin通过浸根法接种CS－20罗勒幼苗，并将其移入可循环的营养液中接种前已经有2％的幼苗被F．oxysporumf．sp．basilici自然侵染49d后用CS－20处理的罗勒茎枯死率明显低于对照［22］。Fravel和Larkin还利用CS－20防治番茄、香瓜、西瓜枯萎病。何晨阳等用劈根法研究尖孢镰刀菌的非致病菌株诱导植物系统抗性和防御反应他们在芦笋的一半根上接种CW318，然后在另一半根上接种F.oxysporum f．sp．asparagi（Foa），可以诱导根部产生过敏反应，用npfo处理植物产生的系统诱导抗性可明显减少坏死病斑和病害严重度；用菌丝夹层法接种芦笋试验表明，POX、PAL活性和木质素含量均高于未处理对照，并且芦笋根部溢泌物具有杀菌活性［23］。Cachinero用F．oxysporum f．sp．ciceris（Foc）的非亲和0号小种接种鹰嘴豆，3d后用浸根法接种强致病菌Foc5号小种，预接种非致病菌延迟了症状发生，并明显降低5号小种引起的镰刀菌枯萎病的最终发病数量，在苗期接种非致病菌可提高高丽槐素和美迪紫檀素（植物抗毒素）的合成，也能引起植物根部几丁质酶、β－1，3－葡聚糖酶和POX活性的积累［24］。Elmer筛选出5个尖孢镰刀菌的非致病菌株，然后用其孢子悬浮液接种芦笋根部7d后接种致病菌，84d后与对照相比发现非致病性尖孢镰刀菌菌株CS－20可提高根部鲜重所有菌株均可减少根部病斑CS－20在根部的定殖率比其他菌株高［25］。Nelson用F．oxysporum f．sp．radici-s lycopersici（FORL）接种大麦幼苗，在一叶期可明显减少Blumeria graminis f．sp hordei（BGH）的初次侵染发生率，预接种FORL也可减少BGH次生菌丝长度和孢子量，在诱导处理48h后即可降低侵染频率［26］。

　2引言

茶树生长过程中因生长条件等因素常遭受到各种病害威胁，其中又以叶部病害对茶树经济效益的影响最大。拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）、炭疽菌（Colletotrichum camelliae）和茎点霉属真菌（Didymella segeticola）是引起茶树叶部病害（茶轮斑病、茶云纹叶枯病、茶叶斑病）的几种常见病原菌。当前，针对茶树病害的防治方法主要是采用化学药剂，然而，如果药剂使用过量，就会使茶叶中产生农药残留，而且还会导致病原体产生抗药性等问题。作为一种广泛消费的直饮品，茶叶的安全性和品质对我们的健康至关重要。为保护环境和确保食品安全，急需发展更加科学、安全、可持续的茶树病害防治方法。因此，我们需要采用更为先进的技术手段，如生物防治、绿色防治等方法，来替代传统的化学防治方法，从而实现茶叶生产的可持续发展和人民身体健康的保障。为了更绿色且高效地防治茶树叶部病害，本研究从实验室以普洱茶为载体分析其微生物构成，前期分离出多株真菌，通过查阅文献，初步筛选出两株具有生防潜力的拮抗菌株C19-4和C21-7。以拟盘多毛孢菌、炭疽菌和茎点霉属真菌为研究对象，C21-7、C19-4为拮抗菌，通过平板对峙法和抑菌圈法进行拮抗筛选，确定其拮抗效果；再进一步对其进行形态鉴定和分子鉴定，确定其生物学名称。为茶树叶部病害的生物防治提供了理论基础，对防治由拟盘多毛孢菌引起的茶轮斑病、炭疽菌引起的茶云纹叶枯病和茎点霉属真菌引起的茶叶斑病三种茶叶真菌性病害提供了重要参考。

3材料与方法

　　3.1实验材料

　　3.1.1供试病原菌

(1)拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）

(2)炭疽菌（Colletotrichum camelliae）

(3)茎点霉属真菌（Didymella segeticola）

3.1.2供试培养基

(1)PDA培养基

(2)PDB培养基

　3.1.3供试试剂及主要仪器

(1)实验试剂

实验所用的主要试剂（表1）

表1实验试剂

Table 1 Experimental reagents

(2)实验设备

实验所用主要设备（表2）

表2实验设备

3.2实验方法

3.2.1PDA培养基制备

用量筒量取1000ml水倒入锅中，加热，再放入200g切成小块的去皮马铃薯，用中火煮约15分钟，直到马铃薯变软烂。将煮好的马铃薯过滤，去掉残留的固体物质。在过滤的溶液中加入15~20g琼脂粉和20g葡萄糖，搅拌均匀直至完全融化。加入纯净水补至1000ml，趁热分装于锥形瓶中，用密封报子封口包扎，高温高压蒸汽（蒸气压103.4kPa，温度121℃）灭菌20min，取出贮存备用。

　3.2.2PDB培养基制备

用量筒量取1000ml水倒入锅中，加热，再放入200g切成小块的去皮马铃薯，用中火煮约15分钟，直到马铃薯变软烂。将煮好的马铃薯过滤，去掉残留的固体物质。在过滤的溶液中加入20g葡萄糖，搅拌均匀直至完全融化。加入纯净水补至1000ml，趁热分装于锥形瓶中，用密封报子封口包扎，高温高压蒸汽（蒸气压103.4kPa，温度121℃）灭菌20min，取出贮存备用。

　3.2.3无菌水制备

用量筒量取1000ml超纯水装瓶，高温高压蒸汽（蒸气压103.4kPa，温度121℃）灭菌20min，取出贮存备用。

　3.2.4平板活化

采用常规纯化方法，超净台灭菌20min。用打孔器取直径5mm的菌株C21-7、菌株C19-4、拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）、炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、茎点霉属真菌（Didymella segeticola），分别接种在PDA培养基上（以上操作在超净工作台上进行），以26℃为恒温条件进行培养，持续5d。在此期间，观察培养基上的茁壮菌落，筛选出部分良好生长的微生物菌落。随后，将这些菌落接种到新的培养基中进行继代培养。每组3个重复，培养5d，每天测量菌种生长直径。

3.2.5平板对峙法初筛

超净台灭菌20min。

(1)用直径5mm打孔器分别取菌株C19-4和拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis），将两菌接于同一PDA平板上，相距5cm；用直径5mm打孔器分别取菌株C19-4和炭疽菌（Colletotrichum camelliae），将两菌接于同一PDA平板上，相距5cm；用直径5mm打孔器分别取菌株C19-4和茎点霉属真菌（Didymella segeticola），将两菌接于同一PDA平板上，相距5cm。每组3个重复，以只接病原菌为对照（以上操作在超净工作台中无菌条件下进行），28℃为恒温条件进行培养，持续7d。，每天观察菌株C19-4对病原菌的覆盖情况并测量病原菌生长半径，计算抑菌率。

抑制率（%）=（对照组半径－处理组半径）/对照组半径×100。

(2)用直径5mm打孔器分别取菌株C21-7和拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis），将两菌接于同一PDA平板上，相距5cm；用直径5mm打孔器分别取菌株C21-7和炭疽菌（Colletotrichum camelliae），将两菌接于同一PDA平板上，相距5cm；用直径5mm打孔器分别取菌株C21-7和茎点霉属真菌（Didymella segeticola），将两菌接于同一PDA平板上，相距5cm。每组3个重复，以只接病原菌作为对照（以上操作在超净工作台中无菌条件下进行），28℃为恒温条件进行培养，持续7d。，每天观察菌株C21-7对病原菌的覆盖情况并测量病原菌生长半径，计算抑菌率。

抑制率（%）=（对照组半径－处理组半径）/对照组半径×100。

　3.2.6抑菌圈法复筛

超净台灭菌20min。

(1)无菌条件下，在150mlPDB培养基中接入直径为5mm的6个菌株C19-4菌饼，恒定的条件下（28℃、200 r·min-1），培养4d。接着，将培养基静置1d，然后常温条件下，以8000r·min-1的速度离心10min，将上清液通过0.22μm的滤膜过滤。将菌株C19-4发酵液与PDA培养基按1∶9的比例混合摇匀倒入平板中。取直径5mm的拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）、炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、茎点霉属真菌（Didymella segeticola）菌饼分别接种于平板中央。每组3个重复，将无菌水与PDA培养基按1∶9的比例混合摇匀倒入平板中作为对照（以上操作在超净工作台上进行），恒温（26℃）条件下培养5d，采用十字交叉法测量拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）、炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、茎点霉属真菌（Didymella segeticola）病菌菌落半径，计算其抑菌效果。抑制率公式计算同3.2.5。

(2)无菌条件下，在150mlPDB培养基中接入直径为5mm的6个菌株C21-7菌饼，恒定的条件下（28℃、200 r·min-1），培养4d。接着，将培养基静置1d，然后常温条件下，以8000r·min-1的速度离心10min，将上清液通过0.22μm的滤膜过滤。将菌株C21-7发酵液与PDA培养基按1∶9的比例混合摇匀倒入平板中。取直径5mm的拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）、炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、茎点霉属真菌（Didymella segeticola）菌饼分别接种于平板中央。每组3个重复，将无菌水与PDA培养基按1∶9的比例混合摇匀倒入平板中作为对照（以上操作在超净工作台上进行），恒温（26℃）条件下培养5d，采用十字交叉法测量拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）、炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、茎点霉属真菌（Didymella segeticola）病菌菌落半径，计算其抑菌效果。抑制率公式计算同3.2.5。

　3.2.7数据分析

数据处理和分析采用Excel 2019和SPSS 29.0软件进行。首先，使用Excel 2019对数据进行记录和整理，以确保数据的准确性和完整性。然后，使用SPSS 29.0软件进行方差分析，以判断不同处理方法之间是否存在显著性差异。在方差分析过程中，使用LSD法比较各处理间的差异显著性（P<0.05），以确保结果的可靠性和准确性。最后，汇总和分析数据，撰写报告并得出结论。

3.3菌株C19-4、C21-7的鉴定

　　3.3.1形态鉴定：菌落形态观察及分生孢子形态观察

分别在PDA平板上接种已经过分离纯化的菌株C19-4、菌株C21-7（此过程在超净工作台中无菌条件下进行），在恒温（26℃）条件下进行培养，培养期为5d。培养过程中，观察两菌株的生长特性、颜色形态，测定菌落的生长直径，并进行描述和拍照。对分生孢子、菌落菌丝等采用常规镜检法观察。将PDA培养基上的微量菌丝用经杀菌处理过的接种针蘸取，置于滴入ddH2O载玻片处，盖上盖玻片，利用显微镜对其进行观察与拍照。结果参考《真菌鉴定手册》［27］和《真菌分类学》［28］以及其他文献进行具体描述及分类地位的确定［29］。

　3.3.2分子鉴定：基因组DNA提取、序列测定及系统发育树的构建

（1）DNA提取

溶液配制：

a.10%SDS：用一个100ml烧杯加入16ml ddH2O，称取2g SDS试剂加到烧杯中，调节PH至7.2，转移到容量瓶中，定容到20ml，保存备用。

b.70%乙醇：dd H2O30mL和无水乙醇70mL，充分混匀，保存待用

c.CTAB提取液：

50mmol/LEDTA溶液：将186.1gNa2EDTA·2H2O试剂，溶解在750mL的dd H2O中，搅拌，调节pH值到8.0，缓慢加入ddH2O定容至1000ml，高温蒸汽（蒸气压103.4kPa，温度121℃）灭菌冷却后室温保存备用。

150mmol/L NaCl溶液：将5mol/L NaCl溶液稀释33倍使用；

100mmol/LTris-HCl溶液，pH=8.0：将121.1g Tris碱溶解在750mL的dd H2O中，加42mL浓盐酸，调节pH为8.0，转移至1000ml容量瓶中，用dd H2O定容至1000mL，高温蒸汽（蒸气压103.4kPa，温度121℃）灭菌后室温保存；

将以上三种溶液依次配成EDTA溶液：NaCl溶液：Tris-HCl溶液=20:3:10的比例，混合成CTAB提取液。

d.异丙醇：4℃保存备用。

e.酚:仿:异戊醇:将100mL苯酚，96mL氯仿，4 mL的异戊醇混合均匀，体积比苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1，4℃保存静置过夜。

CTAB法提取：

1）将CTAB提取液和10%SDS置于65℃水浴锅中预热；

2）用高温灭菌后的钥匙刮下PDA培养基上的所有菌丝，放到研钵中，加入适量的细小石英石颗粒，注入足量的液氮充分研磨成粉末状；

3）将研磨好的粉末装入灭菌的2ml离心管中，并使用移液枪准确量取1ml CTAB提取液和100μl 10%SDS加入其中，上下摇动以混合均匀。然后把离心管放在65℃恒温水浴锅中水浴30-60min，期间摇动数次。取出后12000转离心10min；

4）将所得上清液用移液枪转入到一个新的2ml离心管中，并做好标记，量取等体积酚仿异戊醇加入混匀，12000转离心10min；

5）重复4)操作一次。

6）取上清液，加入1/10体积的醋酸钠（NaAc）和等体积的异丙醇，混匀后放入-20℃下沉淀2h以上；

7）12000转离心5-10min，把上清液缓慢倒掉，用70%乙醇漂洗离心5分钟，重复1次，晾干；

8）加入ddH2O（30-50μl）抽打溶解，放入-20℃的盒子中保存。

（2）基因序列扩增

PCR

DNA的琼脂糖电泳检测

a.1×TAE电泳液：50×TAE稀释50倍。

c.制备凝胶，1/100的浓度：琼脂糖粉0.25g，1×TAE的凝胶缓冲液25mL，加入到锥形瓶中，用保鲜膜和报纸封口并打孔，用微波炉对锥形瓶进行加热。加热过程中，溶液沸腾时停止加热，小心摇晃锥形瓶后继续加热，直到琼脂糖全部溶解。取出锥形瓶，室温冷却至50℃-60℃，加入DNA green染料0.25μL，用玻璃棒搅拌均匀。将溶液转移到准备好的制胶模中，控制凝胶的厚度在3-5mm，插上梳子，室温条件等待胶体凝结，约40-60分钟。

d.凝胶凝结后拔出梳子，放入装有适量1×TAE电泳缓冲液电泳槽中，用移液枪准确移取5μL PCR产物，加入到凝胶孔中，样品全部加完后，再移取3μl Maker加入到第一个凝胶孔中。

e.接通电极，调节电压至120V，并设置时间为20min，开始跑胶，DNA和Maker向阳极移动，等待凝胶移动到距凝胶前沿2~3cm后，关闭电源。

g.取下凝胶，取下胶板，在凝胶成像系统上观察。观察DNA条带是否明亮，并根据Maker计算DNA条带大小。

（3）目的片段的回收、连接、转化和测序

DNA凝胶回收

采用北京天根生化科技有限公司的DNA回收试剂盒回收，具体步骤按其说明操作。

DNA连接

连接载体pGWT购于日本TAKARA公司，含有AMP标记基因，如表5连接体系：

置于16℃恒温水浴锅水浴一个晚上

DNA转化

配制LB培养基如表6-1、表6-2所示：

按上表格称取各试剂混合在50ml烧杯中，加入45ml去离子水，搅拌至完全融化，接下来用去离子水定容至50ml，分装到备用的锥形瓶中，高温高压蒸汽灭菌20分钟，取出冷却后贮存待用。

a.取5μL连接产物加到1.5mL离心管中，取50µl DH5α感受态细胞迅速加入到5μL连接产物中，快速冰上静置30 min；

b.42℃热激90s，迅速转移到冰上冷却5 min；

c.加入200μL LB液体培养基，摇床培养1h，温度控制在37℃；

d.从摇床上拿下来后，4000rpm离心1min，弃上清液100μL。

e.取出操作d混匀后的菌液，将其均匀涂在含有50mg/mL Amp的LB固体培养基上，晾干后，在37℃恒温培养箱内倒置培养12－16h。

测序

挑取单个菌落，接种于含50 mg/L Amp的2mL LB液体培养基中，37℃条件下220 rpm震荡培养5h-16h。本实验采用菌液直接进行PCR检测进行检测，然后将检测到的阳性克隆的菌液送往上海生工生物(Sangon Biotech)工程技术服务有限公司进行测序。

　4结果与分析

　　4.1拮抗微生物的筛选

平板对峙试验结果显示，菌株C19-4对拟盘多毛孢菌和炭疽菌有抑制作用（图1），其抑制率为76.67%和68.55%（表7-1）；对茎点霉属真菌无明显抑制作用（图1），其抑制率仅为19.64%（表7-1）。对峙培养过程中，菌株C19-4对三种病原菌的抑制率总体呈上升趋势，至第二或第六天开始产生抑制作用；在菌株C19-4与炭疽菌的对峙培养中，第二天后才产生抑制作用；在菌株C19-4与拟盘多毛孢菌的对峙培养中，第二天之前菌株C19-4对拟盘多毛孢菌的生长有促进作用，第二天产生抑制作用；在菌株C19-4与茎点霉属真菌的对峙培养中，第六天之前菌株C19-4对茎点霉属真菌的生长有促进作用，第六天后产生抑制作用；各自的抑制率随时间的增加而增大（图2-1）。

菌株C21-7对三种病原菌都有一定的抑制作用（图1），其中对炭疽菌的抑制作用最强，达80.65%（表7-2）；对茎点霉属的抑制作用最弱，为57.14%（表7-2）。对峙培养过程中，菌株C21-7对三种病原菌的抑制率总体呈上升趋势；在菌株C21-7与炭疽菌的对峙培养中，第二天就已经产生抑制作用；在菌株C21-7与拟盘多毛孢菌的对峙培养中，第一天就发生抑制作用；在菌株C21-7与茎点霉属真菌的对峙培养中，第四天之前菌株C21-7对茎点霉属真菌的生长有促进作用，第四天产生抑制作用；各自的抑制率随时间的增加而增大（图2-2）。

　　Figure 1 Opposite culture of antagonistic bacteria and pathogenic bacteria（Day 7）

表7-1 C19-4对病原菌的抑制作用

Table 7-1 Inhibition of C 19-4 on pathogens

注：表中生长半径数据为平均值±标准差，在同一列数据后面的不同小写字母代表差异显著（P<0.05），（下表同理）。

Note:The growth radius data in the table is the mean±SD,and the different lower case letters following the data in the same column represent significant differences(P<0.05),(as in the same table below).

　　图2-1对峙培养时间对病原菌的生长抑制变化（C19-4）

Figure 2-1 Growth inhibitory disease of pathogens by confrontation culture time（C19-4）

图2-2对峙培养时间对病原菌的生长抑制变化（C21-7）

　　Figure 2-2 Growth inhibitory disease of pathogens by confrontation culture time（C21-7）

抑菌圈法复筛结果显示，炭疽菌、拟盘多毛孢菌和茎点霉属真菌都能在含C19-4发酵液的PDA平板上形成抑菌圈（图3），抑菌率分别为30.67%、26.64%、13.59%（表8-1）；在培养过程中，C19-4发酵液对三种病原菌的抑制率总体呈上升趋势，至第二或第二天开始产生抑制作用；在炭疽菌的C19-4发酵液培养中，第二天产生抑制作用；在拟盘多毛孢菌和茎点霉属真菌的C19-4发酵液培养中，第一天就产生抑制作用（图4-1）。

炭疽菌和茎点霉属真菌在含C21-7发酵液的PDA平板上不能形成明显的抑菌圈（图3），拟盘多毛孢菌在含C21-7发酵液的PDA平板上能形成抑菌圈（图3），其抑菌率为23.14%（表8-2）；在培养过程中，C21-7发酵液对拟盘多毛孢菌的抑制作用随培养时间的增长而增大（图4-2）。

图3拮抗菌与病原菌抑菌圈培养（第5天）

　　Figure 2 Culture of antagonistic and pathogenic bacteria（Day 5）

图4-1抑菌圈培养时间对病原菌的生长抑制变化

　　Figure 4-1 Changes in growth inhibition of the antimicrobial bacteria

图4-2抑菌圈培养时间对病原菌的生长抑制变化

　　Figure 4-2 Changes in growth inhibition of the antimicrobial bacteria

经初筛和复筛后，菌株C19-4对拟盘多毛孢菌的拮抗效果最好（图3、图4），对茎点霉属真菌的拮抗效果最差（图3、图4）；菌株C21-7对炭疽菌、拟盘多毛孢菌和茎点霉属真菌都有一定的拮抗效果，其中对炭疽菌、拟盘多毛孢菌的拮抗效果最好（图3），对茎点霉属真菌的拮抗效果最差（图3）。两菌株综合比较，菌株C21-7的拮抗效果较好。

图5拮抗菌与病原菌对峙培养抑制效果对比（第四天）

　　Figure 5 Comparison of the inhibition effect of antagonistic bacteria and pathogen bacteria in confrontation culture（Day 4）

图6拮抗菌与病原菌抑菌圈培养抑制效果对比（第四天）

　　Figure 6 Comparison of the inhibitory effects of antagonistic and pathogenic bacteria（Day 4）

　4.2菌株C21-7、C19-4的种类鉴定

　　4.2.1形态鉴定

（1）C19-4

菌落在PDA平板培养基上（26℃）生长较为迅速，6d长满整个培养皿（图5），产生大量绒状菌丝，蓬松致密，有同心轮纹（图6）。平板正面幼龄菌丝呈现白色，基内呈紫红色，平板背面呈紫红色（图6），无特殊气味产生。根据显微镜观察的结果，可以看出大多数分生孢子是具有相同长度的长椭圆形，这些孢子呈现出一种镰刀形状，其两端缓慢地变尖并且向内弯曲（图6）。根据上述菌株的培养特性和形态特征，参照魏景超[27]的《真菌鉴定手册》和布斯[33]的《镰刀菌属》手册，初步确定其分类地位为Fusarium。

图7菌株C19-4生长速率

　　Figure 7 Growth rates of strain C19-4

（2）C21-7

菌落在PDA平板培养基上（26℃）生长迅速,2d长满整个培养皿（图7），菌丝体呈柔毛状,有同心轮纹（图8）。在平板正面，菌落初期呈现为白色，而在基内则呈现为淡黄色。在菌落的中央和边缘区域可以观察到有明显的产孢区，这些区域的颜色由黄绿色逐渐转变为绿色。在平板的背面，菌落呈现为黄绿色。（图8），无特殊气味产生。随培养时间增长，孢子绿色变深，孢子梗丛束稀疏,环状排列（图8）。通过显微镜观察发现，分生孢子呈球形,有的呈簇状（图8）。根据上述菌株的培养特性和形态特征，参照魏景超[27]的《真菌鉴定手册》，初步确定其分类地位为Trichodema。

图9菌株C21-7生长速率

　4.2.2基因鉴定

在上海生工生物（Sangon Biotech）工程技术服务有限公司对3.3.2中筛选出来的阳性克隆进行测序。得出以下结果：

>C19-4,ITS

TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGGGTTTAACGGCTTGGCCGCGCCGCGTACCAGTTGCGAGGGTTTTACTACTACGCAATGGAAGCTGCAGCGAGACCGCCACTAGATTTCGGGGCCGGCTTGCCGCAAGGGCTCGCCGATCCCCAACACCAAACCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAATTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCC

>C21-7,ITS

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

　　4.2.3以ITS为基础的系统进化分析

（1）对菌株C19-4测序获得的ITS基因序列在NCBI进行Blast比对，发现该菌株与镰刀菌属真菌的ITS序列同源性高于99%，从亲缘关系上判定菌株C21-7为镰刀菌属真菌。在NCBI上下载菌株C19-4的同源序列，借助MEGA7.0软件进行遗传进化分析，构建系统发育树（图11-1）。结果显示，菌株C19-4与其中1株Fusarium avenaceum形成一个进化簇，并与其他种属的镰刀菌区别明显。因此，结合形态学特征和分子生物学特征，将菌株C19-4确定为Fusarium avenaceum。

图11-1基于ITS序列分析构建NJ-系统发育进化树（C19-4）

　　Figure 11-1 Construction of the NJ-Phylogenetic Evolution Tree based on ITS sequence analysis(C19-4)

（2）对菌株C21-7测序获得的ITS基因序列在NCBI进行Blast比对，发现该菌株与Trichodema harzianum的ITS序列同源性高于99%，从亲缘关系上判定菌株C21-7为木霉属Trichodema harzianum。在NCBI上下载菌株C21-7的同源序列，借助MEGA7.0软件进行遗传进化分析，构建系统发育树（图11-2）。结果显示，菌株C21-7与其中3株Trichodema harzianum形成一个进化簇，并与其他种属的木霉菌区别明显。因此，结合形态学特征和分子生物学特征，将菌株C21-7确定为Trichodema harzianum。

　　图11-2基于ITS序列分析构建NJ-系统发育进化树（C21-7）

Figure 11-2 Construction of the NJ-Phylogenetic Evolution Tree based on ITS sequence analysis(C21-7)

　　4.2.4菌株分类地位确定

结合菌株C19-4、C21-7的培养特性和形态特征，ITS为基础的系统进化分析，最终将菌株C19-4鉴定为Fusarium avenaceum；将菌株C21-7鉴定为Trichodema harzianum。

5讨论与结论

茶树叶部病害的发生与流行对茶叶生产有极大的影响，有效防治茶树叶部病害是提高茶树经济效益的重要途径。随着社会对环境保护和食品安全问题的日益重视，传统的化学防治方法变得越来越不可靠。因此，我们需要寻求新的解决方案来确保茶叶的安全性和质量。为保障茶叶安全，要尽量发挥农业防治、物理防治、生物防治等技术在茶树病害的防治上的作用，尤其是生物防治，以贯彻绿色和协调的原则[34]。目前使用的生防菌主要是芽孢杆菌属、假单胞菌属、木霉菌属、放线菌属以及非致病镰刀属的真菌[35]，通过刺激宿主植物生长、诱导宿主防御、抵抗病原菌、抢占生态位、竞争营养、产生次级代谢物等方式使植物达到高产[36]。

本实验结果表明，菌株C21-7（Trichodema harzianum）主要是因为生长速度较快，能较先抢占生态位空间和营养，从而有效抑制了炭疽菌、拟盘多毛孢菌及茎点霉属真菌三种病原菌的扩展，有显著的拮抗效果；菌株C19-4（Fusarium avenaceum）也能通过抢占生态位空间和营养抑制病原菌的扩展，但因其生长速度较慢，拮抗效果不如菌株C21-7（Trichodema harzianum）显著。菌株C19-4（Fusarium avenaceum）发酵液中产生的次级代谢物对炭疽菌、拟盘多毛孢菌及茎点霉属真菌三种病原菌的拮抗效果要比菌株C21-7（Trichodema harzianum）发酵液中产生的次级代谢物明显。

此结果明确了菌株C21-7（Trichodema harzianum）与菌株C19-4（Fusarium avenaceum）对炭疽菌、拟盘多毛孢菌及茎点霉属真菌三种病原菌的抑制效果，为菌株C21-7（Trichodema harzianum）和菌株C19-4（Fusarium avenaceum）拮抗由炭疽菌引起的茶云纹叶枯病、拟盘多毛孢菌引起的茶轮斑病、茎点霉属真菌引起的茶叶斑病的机理探讨和对相关次生防菌菌剂的合理开发利用，奠定了条件基础和理论支撑。

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茶树病害拮抗微生物的筛选与鉴定

价格 ¥9.90 发布时间 2024年3月24日

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