基于茎环引物介导的逆转录环介导等温扩增一步检测融合基因

摘 要

过去数十年的研究表明，人体罹患癌症的主要原因是体内产生了融合基因。肿瘤或白血病等疾病的产生或促进多是由于部分基因发生了倒位、易位等现象产生的融合基因使序列异常或转录出的蛋白质功能异常。一些学者认为其是肿瘤产生、发展的重要驱动因素，同时也被作为癌症检测和临床诊断的优秀的生物标志物。目前急切需要一种高效、灵敏的方法对BCR-ABL融合基因进行检测。通过设计LAMP引物，以及进行筛选及改进后，择优选择带有一定茎环结构的LAMP引物，利用这种茎环引物进行辅助，通过逆转录环介导等温核酸扩增技术实现对融合基因的精确高效检测。所提出的基于茎环引物介导的逆转录环介导等温扩增检测融合基因的方法称为SLP-LAMP。通过实验已经证明，基于茎环引物介导的逆转录环介导等温扩增是一种可靠的方法，可以检测到10-18级别的融合基因含量，具有高效便捷的特点。这种基因标志物分析诊断和靶向治疗慢性粒细胞白血病中起到至关重要的作用。

关键词：慢性粒细胞白血病，SLP-LAMP技术，BCR-ABL融合基因

引 言

近年来在我国,白血病的发病率和病死率有逐年上升的趋势。白血病作为一种全球发病率和致死率排名靠前的癌症，其本质是血液系统的恶性肿瘤。白血病细胞有极强的增殖及自我更新能力，无法很好地分化、细胞很难凋亡，由这些可见该细胞在不同的发育过程中存在停滞现象。不断在人体骨骼和造血组织中大量产生和积累，不但对人体造血功能造成不同程度的损坏，还会导致其他器官和组织出现病变。白血病的分支标志物通过人体内部的相关融合基因出现白血病特异性表现出来，其与白血病的检测与治疗过程息息相关。在白血病中,复发性基因融合和内部串联复制是最有效的治疗靶点之一。例如:慢性粒细胞白血病(CML)中的BCR-ABL的发现,为实现精确检测该疾病提供了重要的依据，并推动了重要的治疗进展。

大约有2.5万个不同基因存在于人类体内不同的基因组，每个都有自己的特定功能，从而发挥特定的效用。由于融合基因中的大部分都是致癌基因，所以它的出现往往代表着一些疾病的产生。如白血病、肿瘤等类型的病症极易产生于人体内存在融合基因的情况下。融合基因，又被称为嵌合基因或杂合基因，是两个独立的基因相互连接产生的染色体结构变异。通常由于染色体结构重排（例如易位，缺失或倒位）且错误序列达到50bp以上时，导致的两个基因连接产生的嵌合体。转录后产生的蛋白质产物可能导致表达异常、作用位点或是功能的异常状态，最终导致细胞异常增殖从而产生肿瘤。融合基因在人类肿瘤发生和发展中起着至关重要的作用，引起融合基因的染色体结构畸变是肿瘤发生中最常见的机制之一。由于融合基因仅存于肿瘤组织内，不存在于健康人体内，因此融合基因转录本是优秀的肿瘤特异性生物标志物，融合基因检测为肿瘤发病机制和早期癌症诊断提供了新的视角。例如，费城染色体易位（t（q；22）（q34；q11））导致了bcrandablgenes的分子并置，形成了著名的NBCR−ABLfusion基因。融合转录本编码嵌合体BCR−ABLprotein具有组成性升高的酪氨酸磷酸激酶活性，导致慢性粒细胞白血病（CML）。作为药物靶标，融合基因具有令人印象深刻的治疗意义，例如伊马替尼治疗BCR的首次成功−ABLfusion基因引起CML和克唑替尼和/或Ceritinib最近在治疗ALK重排融合基因驱动的非小细胞肺癌（NSCLC）方面的胜利[1][4]由于融合基因在人类癌症中的重要作用，已经建立了一个专门的数据库-Mitelman癌症染色体畸变和基因融合数据库，越来越多的融合基因被用作癌症诊断，治疗和预后的金标准分子生物标志物。因此，鉴定和检测融合基因对于临床和生物学研究都有十分重要的意义。。

到目前为止，融合基因分析方法主要分为两类：（1）转录组范围的筛选方法，如二代测序（NGS），DNA阵列和数字基因定量技术等。上述这些技术对于在转录组范围内检测融合基因有很大帮助，是筛选融合基因转录本的有力工具，融合基因与癌症之间的关联被逐渐揭开。但是，因为实验步骤多且费时费力，这些方法在临床检测中效果并不十分理想，且仪器和试剂成本高，需要大量的RNA样品，数据分析复杂。（2）医学实验室检测融合基因的传统方法包括染色体显带分析（核型分析），荧光原位杂交（FISH）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、流式免疫磁珠法（ＣＢＡ）等。通过短期培养细胞以获得中期染色体的核型分析，以及茎环引物介导的指数扩增（SPEA）策略等，需要在短时间内培养大量新鲜细胞以获得中期染色体的核型分析，这十分耗费人力并且在技术上具有很大的挑战性，在实际操作过程中耗费时间长且不能保证较高的成功率。随着技术的发展，同时由于以上这些原因，核型分析逐渐淡出主流检测方法。具有基因座特异性探针的FISH可用于新鲜/冷冻或FFPE组织中的融合基因分析，具有高特异性和灵敏度。但是，这项工作十分要求高技术并且耗时。其中，定量检测融合基因转录本最常用的方法是RT-PCR。20−23然而，此类方法也有它的局限性，例如对实验条件的要求十分苛刻，对引物的设计也要求十分严格严格。并且此种方法容易产生假阳性，这对基于PCR的融合基因测定的特异性和灵敏度提出了极大的挑战。因此，迫切需要用于特异性鉴定和高灵敏度检测融合基因的一步检验方法。

本项目通过运用LAMP技术，扩增融合基因BCR-ABL中的特异基因序列，通过检测其荧光信号实现对融合基因的一步检测。此方法具有灵敏度高、特异性强的特点。主要研究内容包括设计在融合基因的融合位点处的茎环引物SLP1,SLP2。通过逆转录酶对目标融合基因进行反转录。借助BstDNA延伸和顶替作用，产生双茎环结构的DNA，运用LAMP技术，对上述双茎环结构DNA进行扩增，检测其荧光信号来实现一步检测融合基因。以及探究基于茎环引物介导的逆转录环介导等温扩增一步检测融合基因的新方法。基因标志物分析方法对于生命科学、病理生理学、医学诊断以及精准医学等研究具有重要的意义。

文献综述

因为超过80%的慢性粒细胞白血病（Chronicmyeloidleukemia,CML）大部分白血病患者体内都能够检测出BCR-ABL融合基因，因此这种融合基因在业界和学术领域被称为CML环境特征性标志。人体内9号染色体上的BCR与22号染色体上的ABL发生易位所产生的费城染色体，产生BCR-ABL融合基因，其可以编码产生BCR-ABL融合蛋白，是慢性粒细胞白血病的产生的主要原因。疾病的诊断与检测可以通过判断是否含有特异性的染色体标志物和相应的分子标记物（mRNABCR-ABL1）来进行。现阶段的科研发展水平下，对患者体内的BCR-ABL融合基因的测量方法多种多样。主要涵盖个体化治疗方案、检测治疗效果、CML临床分型诊断、预防缓解后复发风险等。

虽然目前在学术研究及临床领域检测融合基因的方法有多种多样并都存在一定的优点和适用情况，但它们难免存在一些缺点需要克服和改进。本文综述了目前存在的几种融合基因检测方法及融合基因检测方法的发展历史并对比整合了他们的优缺点。

融合基因检测的分析方法进展第二代测序技术（NGS）

第二代测序技术（Next-generationsequencing，NGSorultra-deepsequencing，UDS）又称高通量测序（High-throughputsequencing）或下一代测序技术，是基于PCR反应和基因芯片发展而来的DNA测序技术，也是利用通量较高的二代测序技术，灵敏度的提高得益于增加通量并多次扫描。最近这些年，二代测序技术发展迅速，正广泛应用于生命科学的各个领域并且适合于应用的领域不断扩大。同时测序成本不断降低，相较以往的方法下降了近50000倍，与此同时测序数据量扩大了1000倍左右，该方法的巨大优势使其在医学领域受到欢迎。由于最新研发的测序技术能够有效突破一次性对数十万甚至几亿个DNA分析进行测定，具有测序深度大、覆盖面广、运行效率高的特点。二代测序技术包括焦磷酸合成法，是一种在同一体系中由四种酶催化的酶级联化学发光反应，一般在平台罗氏/454：基因组测序仪FLX系统实现操作，读长为500bp；边连接边测序法，采用8碱基单链荧光探针混合物作为底物，采用双色球碱基编码技术，通常在平台ABI/SOLiD：5500xlSOLiD系统中实现操作，读长为35-50bp。以及可逆链终止物和合成测序法，通过可逆性末端终止化学反应技术实现，通常使用的平台为Illumina：HiSeq/MiSeq，读长为50-150bp。二代测序技术开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序（SequencingbySynthesis），也可以理解为针对DNA复制阶段利用获取新加入的碱基携带的属性标记进行DNA序列的确定，相较于一代测序的合成终止测序效率高出许多。二代测序技术的技术平台主要包括Roche的454FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。

二代测序技术具备读长短、通量高的优势，由于这一代测序技术主要原理是采用对单个DNA分子扩增后的由相同的DNA组成的基因簇进行同步复制的方法，来使荧光信号增强从而能够读出DNA序列。但碱基测序质量会随着读长增长导致的基因簇复制的协同性降低而同步下降，这一因素使得二代测序的读长被严格限制，一般不超过500bp。故二代测序比较适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区）。基于基因组DNA的二代测序技术已广泛应用于非小细胞肺癌（NSCLC）的基因重排检测。目前二代测序技术发展良好，与此同时也被经常与新出现的三代测序技术一同配合使用以达到最优的检测效果，在极短时间内检测和预防食源性病菌，特别是无法确定的食源性病原体方面展现了巨大的发展空间。

DNA阵列

DNA阵列也被称为DNA芯片或DNA微阵列，大部分人直接称其为基因芯片，通常基因芯片涵盖CDNA微阵列和寡核苷酸微阵列两种。通常分类单位以芯片的配制方法为主：原位合成芯片和DNA微集阵列(DNAmicroarray)。原位合成(intusynthesis)芯片是利用显微光蚀刻等技术，采用原位合成寡核苷酸的方法，在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成。DNA微阵列是指将数千或数万个DNA片段核酸探针按事先设计的排列方式直接利用显微打印手段固化在载体面，产生二维DNA探针阵列。也可以说是一块带有DNA微阵列（micorarray）涂层的特殊玻璃片，在特定环境下和样本中标记准备检测的靶基因进行杂交，针对杂交信号进行分析和检测的测验，能够从中反应大量关键信息和基因序列，从而达到确定靶基因含量和变异等信息。这是一种传统的检测基因和遗传的措施。研究人员将该技术应用在基因芯片上，能够同时针对若干基因进行检测。由于常用硅芯片作为固相扶持物且在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术，所以称为基因芯片技术。芯片上自带固定的DNA之外，同样携带了cDNA、寡核苷酸等基因片段，与此同时，上述的探针固化芯片随机组成基因探针阵列。基于此，业界将DNA芯片称为寡核苷酸阵列、基因芯片等。

DNA芯片是以分子杂交等多种方法为基础，根据碱基配对的原则，利用基因连锁、限制性长度多态性、连锁不平衡或变串联基因重复序列及单核苷酸多态性标记等基因定位方法和手段进行遗传作图，使得不同材料中的多个基因表达模式能够平行的进行比对分析，这种基因分析方法的效率较高。

DNA芯片技术经过了短短几年的发展，逐渐从早期缺乏成熟的技术发展成为生命科学领域极为重要的历史级别检测技术。其在不少领域受到关注，且开始广泛应用，具有极为广阔的应用潜能。存在的困难是该项技术所需的成本较高，以及会出现假阳性现象，对于该项技术的广泛推广运用造成了一定阻碍。但其所具备的自动化、微型化和多样性，对于基因测序、基因表达检测、发现新基因、基因突变及多态性检测、基因诊断及基因药物设计等领域有重大的应用价值。现在的技术发展方向为如何提高探针阵列的密度，使其在一定面积的芯片下能容纳更多的探针，以提高效率和精度。未来，随着技术的不断发展，可以实现将人体内所有的基因集成在1cm2大小的芯片上。因此一个芯片可以存储每个人体内的大量遗传基因信息，借助这张芯片可以实现对疾病诊断的高效、准确和定制化。

数字基因定量技术数字基因定量技术(NanoStringnCounterAnalysis)是探针与核酸分子发生杂交自耦合，直接探测探针区域的颜色分子条形码，从而达到对多重基因进行定量检测的技术。该技术能够在相同系统内对数百个特异性序列和颜色条形码探针进行检测，被条形码探针标记的单个mRNA转录子可以进行直接检测。用数字计数进行定量，并最终通过输出数字化的形式读取结果。此技术需要的材料极少，仅需100ng的RNA即可对逾八百个特异的mRNA转录子进行准确的定量，并且不需要进行酶促和扩增过程，最大限度规避出现偏差的风险，检测过程中的准确程度和敏感程度和实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术相当。

数字基因定量技术的重点核心技术原理通常涵盖单分支成像技术和分支条形码技术两个方面。单分子成像技术是通过对单个或几个荧光分子在极短时间内进行激发从而获取发射光信号，获取上千次结果后对图像进行重塑，最终获得突破百纳米极限的超高分辨率图像。独特的光敏蛋白被用作荧光染料来进行单分子成像，最终要想分辨极限上重叠的荧光团位置，需要通过独特的算法获得。

近些年，生物医学及生物技术等前沿领域越来越对数字基因定量技术产生好感，其特点及优势被发掘出来并且广泛应用于包括高通量基因表达结果验证、基因调控网络研究、基因表达谱研究、临床疾病分子分型及诊断预后等领域。

随着生物学的不断发展和完善，其在特定生物学和疾病诊断中发挥出重要的价值和作用，尤其体现在针对生物学和疾病状态下转录水平RNA表达的高通量分析和研究，并且其也成为人们对信号转导机制、转录调控等进行深入了解的重要工具和手段。相较被应用于高通量基因表达谱研究的基因芯片、RNA测序等技术，数字基因定量技术无须重复验证和选择结果信息，相对于早期的实时荧光定量技术，通量更大，且实验步骤较简单。可见数字化基因检测技术在基因表达谱的验证、研究和临床应用中扮演了越来越重要的角色。

基于荧光共振转移原理（FRET）设计的纳米传感器

荧光共振能量转移指的是对供体进行激发过程中发射出光谱和受体之间产生重叠，当受体中两个基团处理在10nm时，出现非放射性能量转移的情况。在此过程中，光源由于受到供体激发而得到一定能量通过无辐射的方式转移至受体，这就是所谓的荧光共振能量转移。通常情况下，供体的能量转移到受体，从而激发受体，一旦受体属于荧光物质，将会反应为受体荧光，同时出现不同程度的荧光光谱红移现象；而如果受体属于淬火分子，通常该方法会直接造成能量被淬灭。荧光共振能量转移是能量供受体之间通过偶极-偶极相互作用而进行的一种非辐射的能量转移过程。此项技术对供受体之间的距离以及偶极取向在纳米尺度范围内的变化十分敏感，所以被称为“光学分子尺”。近些年来，FRET技术在光学传感和生物医学检测等方面都有广泛的应用。合适的能量供受体对对于提高荧光共振能量转移的效率，获得更好的分析检测结果至关重要。.

针对核酸、蛋白质等生物分子进行检测的传感器和彼此之间产生相互作用展开分析和研究中反应出理想的灵敏度、精确度，且能够对局部区域进行实时分析的优势。此外，该传感器能够作为能量供受体的材料通常涵盖生物材料、有机突光燃料等，不过上述材料在实际应用中的缺陷较为明显，对传感器的实际应用效果造成影响。基于此，研制开发新型光学材料的传感器是这一领域备受关注的热门课题。纳米材料通常指的是在三维空间中，至少存在一维空间的材料单位属于纳米单位，比如超晶体和纳米膜等。纳米材料通常具备高浓度和特殊结构的特征，其能够展现出有别于传统材料的特征，如量子尺寸效应、表面效应等，正因这种特殊的材质，让纳米材料在电学、光学、磁学等领域发挥重要作用和价值。石墨烯具有极为高效的吸附生物分子能力和淬灭荧光能力。这部分纳米材料的特殊性决定了由它们构建的体系本身具备绝佳的供受体。随着纳米材料在多个领域广泛应用，以纳米材料为基础的传感器的优势不断显现，其在生物学领域具有极为广阔的发展空间。

受到能量转移效率等各类因素的综合影响，大量研究人员开始通过上述因素建立多种和生命学科息息相关的检测设备，这些设备在生物成像、DNA识别、环境检测等领域获得理想的成效。SHAMSIPUR等第一次开发了专门用于对CML阳性患者BCR-ABL融合基因展开精准高效检测的纳米传感器。该传感器主要利用自动的程序对靶向融合基因进行检测，在此过程中，无须过于复杂的操作流程，通常情况下，FRET信号和cDNA浓度之间存在较为理想的线性关联性。可将其视为无标记系统平台，能够合理降低对CML阳性患者BCR-ABL在检测过程中的紧急性。相对于传统的电化学生物传感器，此项技术展现出极强的DNA定量优势，并呈现出广阔的发展空间。

这项理论诞生以来，受到医药、农业、司法鉴定等领域的广泛关注应用，随着近些年的发展和完善，该技术在敏感性和分辨率上得到显著提升，基于FRET研制开发的纳米传感器得到生物学领域的高度认可和广泛应用，特别在大分子结象变化、生物大分子作用方面的检测发挥重要作用。研究人员在研究中发现关于能量供受体光学性质和传感器的组合方式能够从不同维度对传感器的检测精确度产生深远影响，而沿用多年的能量供受体往往存在对外部环境敏感、光稳定效果差、荧光强度低等缺陷对传感器的发展造成阻碍作用。纳米材料是指二维空间中至少冇一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构成的材料，特殊的结构使其在光学、屯学、磁学等方面表现山异于筲通材料的性质。纳米材料的出现与不断发展也为传感器的发展带来新的契机。以纳米材料为基础设计的传感器有优越的检测性能，闪而不断被发展并用于生物学的各研究领域。

电化学DNA传感器

电化学DNA传感器基于传统传感器的缺陷，合理规避上述缺点，将电化学技术与分子生物技术进行有机融合，开创了新型检测技术，该传感器具有灵敏度高、检测速度快的特点，且在检测成本上更具优势，如今在BCR-ABL融合基因检测领域受到多方认可。如相较于DNA茎环探针检测方法和黑T膜检测等检测方法，上述方法普遍以缩小信号的方法进行检测，无形中造成灵敏度不足，容易造成检测结果缺乏准确度。与之相比，滚环扩增检测法、PCR检测法等则将信号放大，虽然电化学DNA传感器能够有效控制并降低假阳性的检测结果概率，但检测成本居高不下确实不争的事实，且检测过程中极易受到检测环境的影响，无法在实际应用场景中广泛应用。新型电化学DNA传感器不但规避上述传感器对酶过于依赖的缺陷，极大提升检测的准确性和灵敏度，同时能够使DNA回路核酸序列设计难度下降，无需对靶核酸序列做严格限制。此类传感器通常用金纳米粒子、石墨烯等材料制作而成，具备绝佳的导电效果，同时能够附着更多捕获探针，在实际检测中并不需要依赖蛋白酶信号就能进行检测的优势，有效放大检测过程中的双重信号，极大提升靶核酸的灵敏度。在实际使用过程中，展现出绝佳的性能；针对靶核酸链的检测稳定性和可重复性符合研究人员的预期目标，其最小检测限为1.05ｐＭ，不仅如此，该设备在实际检测过程中能够有效控制和降低假阳性结果的概率。

电化学DNA传感器融合了电化学传感技术和免疫技术的基础上，构建一种具有创新性的生物检测技术，其主要通过电化学作为能量转化，其分子识别元件以抗体为主。通过电学传感元件的共同作用，针对免疫反应之前和免疫反应之后的物质浓度变化进行相应的转变，使其成为便于检测的电信号模式，并通过计算机针对相关信号进行处理。

电化学免疫传感器的分类标准主要根据检测信号不同进行划分：

1、电位型免疫传感器

上世纪70年代初期，电位型免疫传感器充分融合了酶免疫检测高灵敏度的优势，该传感器针对不同抗体检测时具有高效准确的优势，作为一种无标记检测技术受到相关领域的高度认可。该传感器是基于检测抗体、检测抗原免疫产生反应的不同时期进行综合对比，主要针对其指示剂和参比电极进行检测。该传感器操作难度较低，适用于多种检测场景。在免疫分析检测等领域得到广泛应用。不仅如此，随着传感器技术的不断发展和完善，其已经实现对伴刀豆球蛋白进行检测的效果，不过此类传感器目前依然无法彻底解决非特异性吸附的难题，对其使用场景拓展造成阻碍影响。

2、电导型免疫传感器

电导型免疫传感器的检测原理主要针对免疫反应前期和后期附着于溶液中的离子种类出现变化，从而造成溶入出现不同程度的电导变化，便于对目标检测物对其展开的测试和分析。这种类型的传感器通常将酶作为主要标记物，其作用在于通过催化从而实现信号的放大。

不过，此类传感器在实际检测时，存在于生物样品中的物质会对表面产生一定程度的干扰，具体表现为产生非特异性吸附作用，对稳定性和可靠性造成影响。这也成为影响电导型免疫传感器实际应用的主要缺陷。

3、电流型（安培型）免疫传感器

电流型免疫传感器作为电化学免疫传感器中应用程度最广的设备，其具备广阔的发展前景，它是目前技术较为成熟和完善的电流型免疫传感器，操作难度低、性价比高、灵敏度强，受到大量研究人员的关注与青睐。其主要在电压恒定的状态下，通过电流检测为切入点，以电活性的方式对电极中的氧化程度和电流强弱进行对比与分析。该种传感器已经成功应用于绒毛促性腺素和霍乱抗毒素免疫球蛋白的检测等。

4、电容型免疫传感器

如果抗原体在电极表面产生特异性免疫反应时，自然对复合物造成不同程度的改变，并使溶液或电极界面的介电性质出现改变，加厚双电层的厚度，进而导致双电层电容下降，达到检测的目的。电容型免疫传感技术在实际应用过程中无须加入试剂，更无须提前分离，不过由于其灵敏度的原因导致无法全面推广和普及，目前依然停留在研发阶段。

电化学免疫传感器的作用主要将抗原提内部的特异性免疫化学反应和换能器进行有机结合，目前主要应用在抗原体的反应动力学领域，进而极大提升检测过程中的灵敏度和精确度。不过，目前依然存在诸多缺陷和不足，其中包括样品背景中存在大量非特异性吸附作用。在纳米技术不断发展完善的时代背景下，电化学免疫传感器的检测和分析能力持续提升，其在未来可能朝着智能化、阵列化的方向发展。在电化学免疫传感器研究深度和广度不断加强的环境下，未来的发展必定与电子器件微型化的发展方向迈进。针对电极微阵列的研发，对于各类肿瘤标志物的检测将会发挥重要的作用和价值，在提高诊断效率的同时，检测成本也会大幅下降。

总而言之，可以预见的是，电化学免疫传感技术将会在环境分析、生物检测、临床诊断等领域发挥重大作用和价值，并展现广阔的发展空间。

染色体显带分析（核型分析）

染色体在受到特定处理或特异染色之后，将会呈现出多种持续不断的明暗条纹，该现象可称为显带染色体。显带染色体是独特存在的，其是每个染色体的主要识别内容，针对染色体外形的研究和分析通常集中在分裂中期染色体为主，从染色体的长短臂比例、随体特征、长度等进行识别，同时引入显带技术配合。对其进行对比、分析、排序。通常情况下，针对染色体核型的分析可作为物种血缘、染色体数量、细胞遗传领域的关键分析和判断依据。

染色体核型分析实验是选择增殖旺盛期的细胞进行秋水仙素处理，使细胞分裂停止在中期，以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色，在显微镜下观察。制备的染色体标本，未经特殊处理，直接染色后镜下观察进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。染色体显带核型分析则是染色体标本经显带技术处理，使染色体沿纵轴上显示出一定数量的、着色程度不同的、宽窄不等的明暗相间的带纹。每条染色体都有独特而恒定的带纹，主要取决于DNA、蛋白质及染料三者的相互作用。显带技术不同，染色体上显示出的带纹也不同。染色体显带技术包括G显带、Q显带、R显带和C显带等。G显带技术是将染色体标本经胰蛋白酶消化后，再以吉姆萨（Giemsa）染色而显带。其所显示的染色体带纹清晰，普通显微镜下可以分辨，标本可长期保存，因此被广泛应用。

作为遗传学和辅助临床诊断中极为关键的构成部分，染色体核型分析主要针对染色体缺失、易位等情况展开研究和分析，同样也是诊断各类遗传病变不可忽视的重要指标，不仅如此，染色体核型分析与物种血缘关系、细胞遗传分类、染色体数目等方面的研究存在紧密关联性。染色体数目或结构异常会引起染色体疾病，可导致智力低下或发育畸形、不良孕产史等，因此，染色体检查对优生优育非常重要。高龄孕产或有不良产检指征的孕妇会根据医生建议安排胎儿羊水染色体检查，而国内多数生殖医学中心也已将染色体检查纳入试管婴儿治疗前的常规项目。除此之外，其在临床血液病检验项目中也占有非常重要的地位。核型分析从科研角度来看，其是分析物种关系、细胞遗传分类等内容的关键参考依据。

细胞中的遗传物质平时是以染色质的形式存在，只有在细胞分裂时染色质才会浓缩成染色体的形态。细胞有丝分裂又分为了间、前、中、后、末几个阶段：间期是遗传物质的准备及复制；前期核仁消失染色质浓缩成染色体，纺锤体出现；中期纺锤体移至细胞两极，染色体在赤道面上排列；后期姐妹染色单体在纺锤丝的牵引下分开并移向两极；末期子细胞形成。因此，分裂中期的染色体是最便于观察的。染色体之所以叫“染色”体，跟它便于被碱性染料染色有关，而不同的染料产生的染色效果也有明显差异。通过是否经过显带技术处理，可将染色分为非显带染色和显带染色，未经特殊处理，直接染色后镜下观察进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析；而标本经显带技术处理后，会使染色体沿纵轴上显示出一定数量的、着色程度不同、宽窄不等的明暗相间的带纹。每条染色体都有独特而恒定的带纹，通过与标准带形图对比就可达到识别分析染色体形态、结构的目的。

染色体的核型分析始于1968年的显带技术，至今已有50余年的历史，在这期间随着科技的进步，也不断有新的检测技术涌现，如在20世纪80年代末发展出的荧光原位杂交（FISH），21世纪的SKY光谱染色体自动核型分析，近年来也有将高通量测序方法应用于染色体异常的检测。但FISH会受探针来源的限制，SKY及二代测序难以检测染色体的易位倒位等，而G显带技术则受到分辨率的限制，难以发现染色体的细微变异。对于染色体的核型分析，现有检测方法均有其技术上的局限性，但G显带这一经典方法在临床及工业科研等领域至今仍有着不可替代的地位。

荧光原位杂交技术（FISH）

荧光原位杂交技术主要以荧光标记作为标记，形成单链DNA与互补DNA之间形成杂交，可以对标本中的特异性基因进行检查，具体检测方法为利用荧光信号对标本中的信号和位置进行分析和判断。传统细胞遗传领域中，主要分析的方法往往受限于细胞分裂中期，无法在临床检验上发挥效用最大化，且检测过程中缺乏足够灵活性。这种检测方法的创新之处在于将荧光屏作为同位素的替代，主要起到标记作用，这种创新检测方法的出现，也催生了原位杂交技术的问世。观察和对比荧光信号的分布情况，可直接判断基因的具体情况，与传统放射性原位杂交相比，该技术在实操性和灵敏度上获得了质的飞跃。该技术在恶性血液病白血病的临床诊断中发挥重要作用，主要应用于检测、治疗、判断等。该检测方法主要的流程为：制作检测样本–制作检测探针–标记探针–形成杂交–检测–分析结果。在此过程中，需要运用ＢＣＲ－ＡＢＬ基因探针展开检测，并与三色滤镜有机结合，发挥观察杂交信号的作用。通常情况下，不同的英文缩写代表不同的颜色，ABL、BCR、ＢＣＲ－ＡＢＬ分别代表绿色、红色、红绿融合。在具体观察过程中，ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因的细胞呈现红绿分离杂交的信号，而如果ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因阳性的基因通常以1红1绿以及2红绿融合为信号。结合荧光图像处理系统对相应的检测图像展开的预判和分析，同时对杂交过程中的各类信号做好记录，就能够根据数据的分析和对比判断患者是否为阳性。FISH技术的能够实现对染色体中的探针进行标记，关键其观察的时期往往不易受到细胞分裂中期的影响，在条件允许的情况下，可对不同时期的多个细胞进行分析，对于存在微小染色体畸变的核型分析发挥重要作用。采用荧光对样本进行标记，可根据实际情况让基因在DNA直接显示出来，从而达到精准定位的目的，方便观察人员对空间位置展开对比和分析。不过FISH检测整体操作复杂程度高，极易出现由于标本处理不正确而影响检验成效，造成假阳性现象。同时，此类检测技术成本较高，对实验器械的要求也高于其他检测方法，导致此类检测技术无法在临床检验中广泛普及和应用。

逆转录聚合酶链反应逆转录-聚合酶链反应主要是对细胞中的总RNA进行提取，在此过程中，主要模板以mRNA为主，首先利用Oligo(dT)或其他类型的引物反转录成cRNA，在此基础上将其作为主要模板进行扩增，进而达到检测基因的目的。该技术能够有效提升检测灵敏度，让原本仅含有微量RNA样品同样能够被分析和检测。这项技术通常应用于对基因转录产物、获取基因、构建转录系统等方面发挥作用。

PCR技术的可以视为荧光定量聚合酶链式反应和逆转录聚合酶链式反应，近年来还研制开发将两种反应进行有机融合的技术，以下对上述三种反应方法做简要概述。

1、RT-PCR

通常此类方法选择mRNA作为模板，利用逆转录酶的作用反转录出和模板之间进行配对，在此基础上选取cDNA作为主要模板展开扩增，这项技术的特色在于在RNA的状态下检测和分析融合基因。值得注意的是，这种检测方法归属到定性实验的范畴，检验时无法对患者体内的目标基因展开定量分析，且由于其检测过程中存在RNA降解，极易导致假阴性的现象出现。

2、q-PCR

这种方法的原型为反转录技术，其主要通过荧光共振能量转移原理为原理，在PCR扩张反应过程中，将其与引物产生融合从而达到一定特异性，可在实验中对荧光强度进行观察，从而达到观察病患体内ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因的效果。这类方法具有极高的灵敏度，在临床诊断上具有一定优势。特别是患者服用络氨酸激酶等药物之后，其能够准确检测病患体内的融合基因数量，为后续的判断和治疗提供科学可靠的依据。

3、重荧光反转录实时定量聚合酶链式反应

诞生一种能够让病患微量骨髓在同一个管中检测多种ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因的方法，这种方法能准确高效检测ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因，且具备可观的灵敏度和特异性，能够应用在临床检测ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因，对于诊断白血病和靶向治疗起到促进作用。

研究发现，采用q–PCR检测残留白血病细胞总量可定义完全细胞学，不过由于该技术的灵敏度较高、且存在一定污染等因素，极易导致假阳性现象。相关研究发现，利用PCR技术进行检测过程中，ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因在一些正常人体内同样会被检测出阳性。基于此，使用PCR检测过程中，为了最大限度确保检测结果的可靠性和真实性，设立对照组在其中起到决定性作用，不过这个过程往往由于过于复杂而难以应用到临床诊断上，且针对基因的检测耗时较长，对于诊断和治疗白血病起到消极作用。

流式免疫磁珠法（CBA）

流式细胞技术在不断应用和探索中持续完善和成熟，并逐渐发展成为近些年对细胞分析技术占据主导地位的重要检测技术。CRA正是此类检测技术而诞生的新型技术。其原理为，将已经被确定大小和性质的磁珠和蛋白分析物产生融合，并选择血液作为检测样本，对ＢＣＲ－ＡＢＬ融合蛋白进行检测。这种方法主要采用可以和藻红蛋白发生融合作用的单克隆抗体，可以特异融合人体中的ABL成分。在ＢＣＲ－ＡＢＬ融合蛋白与免疫磁珠融合过程中就可以出现三明治疗复合物，在此过程中，蛋白BCR部分和抗体融合为微球结构，此时ABL部分可以视为藻红蛋白的抗体。而流式细胞能够根据抗体的物理差异性，达到对ＢＣＲ－ＡＢＬ融入蛋白检测的效果，利用该方法可对接受络氨酸激酶药物的病患体内ＢＣＲ－ＡＢＬ融合蛋白进行检测和监控，纪录病患的动态报告，符合临床诊断和治疗的预期目标。CBA检测作为ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因转录的蛋白水平，和其他检测方法相比，能够直观准确操作和理解，且检测灵敏度和准确性均符合临床诊断的预期效果，上述特征也让此类检测方法在白血病的临床诊断中发挥关键作用。

免疫磁珠法诞生于上世纪80年代初，1983年，Ugelstad在研究中首次提出免疫磁珠与细胞分选技术的结合，随后由Mihenyi在研究中构建了MACS。该方法的关键基础在于通过磁珠表面存在免疫反应性的抗体展开多种类型的抗体反应，此时将会在细胞表面呈现玫瑰花结形状，其与磁珠细胞的结合如果放置在磁场中，将会和没有被结合的细胞形成分群效应，受到磁场的影响导致磁场原理磁场后失去磁性，由此能够对已经被标记的细胞进行区分和筛选，进而实现判断阳性的效果。该技术目前在生物学细胞分子领域得到广泛应用，主要应用于靶细胞、分离基因等方面。通过分离之后可采用免疫荧光、PCR、FISH等检测方法确认效果。该方法能够实现分选细胞的有效分离，也让其在神经干细胞中得到充分应用。该技术作为上世纪80年代研发的传统技术，其以免疫学作为创立理论，随着不断发展和完善，如今在微生物、病理、生理、生物化学等领域得到广泛应用。免疫磁珠的结构可大致分为核心金属颗粒、核心外层包裹的高分子材料、最外层的功能配基三个部分。

磁珠技术作为一种交叉学科汇聚研发而成的产品，其在生物学及医学实验检测中作用巨大。借助于二代测序的飞速发展，二代测序多涉及的耗材也迎来了它的春天。无论应用于细胞分选还是提取核酸磁珠，免疫检测都涉及免疫磁珠，该技术在分子生物学领域可归属到细分领域，这项技术依然在持续优化和完善，不少医药和生物企业的参与，也让其价格逐渐平民化。

蛋白质印迹法（Western blotting）蛋白质作为细胞的最终产物，对蛋白质特异性检测是研究基因的基础方法。蛋白质印迹法在生物检测领域得到普遍认可。上世纪90年代初，X开始利用该方法对ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因进行检测，其主要表达产物为p210蛋白，此举也成为诊断CML病患的新型选择。这种方法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳，目的在于对蛋白质的检测，在此过程中将抗体视为主要的探针作用，通过同位素标记和已经确定的被酶进行显色。通过分离之后的蛋白质被转移至薄膜中，该薄膜拥有硝酸纤维。当蛋白质和固相支持物产生融合后被吸附，同时不会对蛋白质的多肽类型造成影响。在此之后，和固相支持物完成吸附之后的蛋白质与预先设定的抗体产生融合反应。在此基础上和第二抗体继续发生反应，最后利用底物显色的方式对蛋白质成分进行分析和检测，达到临床诊断和治疗的检测目的。

的阳性检出率。不过这种检测方法操作难度较高，对于酸碱值、温度、样本细胞数量的要求比较严，也在一定程度上对临床检验和诊断的推广造成阻碍作用。

蛋白质印迹法融合了免疫探测技术，能够对蛋白质表达进行高效精准的分析。其主要原理为，将混合样品通过电泳的方式分离出来，再利用凝胶中的蛋白质印迹法转移至高分子转移膜，该转移膜具备一定的化学惰性，在此基础上将蛋白质中的一级抗体和放置于转移膜的蛋白质产生免疫反应，并将二级抗体和一级抗体有机结合，再检测二级抗体中的标记物，从而达到检测效果。通常该方法由免疫学检测、凝胶电泳、样品印迹三个部分构成。从上世纪70年代末以来，该方法已经发展为针对的复杂程度较高的蛋白质表达进行检测的重要技术。该方法的生物化学分析能够高效准确检测复杂样品的蛋白质表达量，一般该方法和总量较大的蛋白质筛选任务绑定使用，用来诊断多种疾病模型中各类蛋白的表达。即便试剂和成像技术持续发展和完善，其在检测范围、多目标检测、灵敏度等方面具有明显进步，不过核心技术依然稳定不变。传统检测中，蛋白质印迹法通常应用于复杂程度较高的混合物靶蛋白的检测，随着大量研究人员的研究和试验，各类新型方法不断涌现，也让蛋白质印迹法得到完善和优化。

蛋白质印迹法作为分子生物学领域中最常见的分离和辨识蛋白特异性的方法，其主要流程通常分为三步。（1）依托于分子重量，结合电泳蛋白进行分离。（2）转移蛋白，将其转移到固相支持物。（3）通过特异性的一抗和二抗导致蛋白显色，在此之后对具体着色的深度和位置分析表达情况。

各类方法的优缺点

现有的分析方法都各自存在优缺点，下面将一一列举：

优点

1、二代测序技术：高通量、高效率、高准确性、低成本、精度范围大；可进行从头测序；10min内可分析96个样品的SNP；更适用于宏基因组种群丰度测序[34-35]；在二代测序中读长最长自动化可操作性高、灵敏度高；所需成本较低，样品量少；适用于包含许多菌株的测序项目以及重测序；可检测新融合伴侣。

2、DNA阵列：具备高效精准的生物分析检验特性。①基因诊断速度明显提升，通常可在半小时内完成检测和诊断。如果采用电控的方法，可缩短杂交时间到一分钟。②检测效率高，能够实现同一时间对上千个基因序列进行检测。

3、诊断成本下降，检测芯片的自动化性能得到明显提升，利用显微加工技术，对核酸样品进行分离、扩大、标记、检测等过程，上述流程均可在同一块芯片中完成。由于检测过程属于全封闭状态，完全杜绝了交叉感染的可能性，同时在检测过程中可有效控制其严谨度，最大限度降低诊断出现假阴性和假阳性的概率。

4、数字基因定量技术：反应过程中并不需要扩增和逆转录，最大限度规避出现误差的风险，同时检测准确性和灵敏性符合临床诊断的预期目标；可重复性好、准确性和敏感性高；适用于多种核酸的检测；标本量要求少，通量较高、操作简单。

5、染色体条带分析：能显现染色体本身更细微的结构。便于高效准确对其中各条染色体和其中的结构进行检测和识别，且对于不同类型的细胞染色体标本具有较高的兼容性，同时也为基因定位的研究提供基础。

6、荧光原位杂交技术：结果直观、特异性较强。

7、逆转录聚合酶链反应：特异性强、灵敏度高,检测范围更广泛,同时可以对扩增模板进行相对定量或绝对定量计算。

综合来看，现有研究在些方面已经取得了诸多成果，但仍存在以下不足

缺点1、二代测序技术：测序能够测出的碱基序列长度短，错误率高。针对若干个单碱重复序列检测的精确度较低；检测仪器成本较高，检测流程复杂，检测耗时长，读取长度极易受到反应的影响，数据分析难度较大；

2、DNA阵列：不能对待检测基因在多细胞类型组织中的精确定位进行判断。①灵敏度低。这也成为当前DNA芯片检测中的共同问题，尤其针对的低拷贝的基因进行检测时更加明显，通常可针对样品进行PCR扩增的方式来提升检测的精密度；②杂交过程中的芯片探针自动生成二级或三级结构，造成检测时无法被探测。

3、染色体条带分析：难以较早确切辨认的问题。

4、荧光原位杂交技术：操作要求较高，成本较高，灵敏度不高，满足不了白血病和MRD检测水平的临床要求，限制了其临床应用价值。

本章小结

生物技术的指的是人类基于生命科学理论为基础，融合多门基础学科的原理，为满足人类特定需求或目的而开展的工程技术。从现代生物技术的发展进程来看，大量生物技术不断涌现，并在实际应用中发挥各自的价值和作用。创新技术的诞生并非一味取代传统技术，而是形成有机结合，全面加强实际应用的成效。针对特定疾病的临床诊断过程中，不应局限于单一的检验或治疗手段，更应根据实际情况将多种方法形成有机融合，从而有效降低检测误差，为病患提供高效准确的诊断意见。技术的发展永不停止，可以预见的是生物科技的发展将会呈现多元化、智能化的方向不断迈进，希望CML的诊断技术实现更大的突破。

实验部分实验材料

e13a2mRNA片段、1μL总RNA提取物、15UWarmStartRTx逆转录酶、4UBstDNA聚合酶大片段、1μL ThermoPol反应缓冲液、dNTPs、FIP、BIP、SYBRGreenI、甜菜碱、SLP1、SLP2、BP引物

表3-1研究所涉及的RNA和DNA探针序列

字母“r”表示核糖核苷酸。符号“*”表示熔合点;字母“P”表示磷酸盐基团

实验步骤

将1μL合成e13a2mRNA片段或1μL总RNA提取物添加到9μL混合物中，其中含有15U热启动RTx逆转录酶、4UBstDNA聚合酶大片段、1´ThermoPol反应缓冲液（20mMTris-HCl、10mMKCl、10mM（NH4）2SO4、2mMMgSO4和0.1%TritonX-100，pH8.8@25°C），250μM dNTPs、8μM FIP、8μM BIP、4ng SYBRGreenI、1M甜菜碱、2nMSLP1、2nMSLP2、2nMBP引物。立即将混合物放入StepOne实时PCR系统以完成反应，并在65°C下每隔1分钟实时监测荧光强度。实验分为八个浓度，分别为空白组,100aM,1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM

结果与讨论用于融合基因测定的LAMP技术原理概述

图4-1基于RT-LAMP技术一步检测融合基因原理图

具有多个融合位点的BCR和ABL基因。(B)BCR-ABL融合产生的转录本。(C)SLP-RTLAMP方法的设计思路。

上图示意性的说明了用于融合基因检测的SLP-RTLAMP方法的概述。BCR−ABL融合基因是一种著名的嵌合基因，它通过编码融合基因BCR−ABL，来增加慢性粒细胞白血病中的酪氨酸活性。BCR基因有几个断点（A），这可能导致多个融合转录本（B）。其中BCR−ABL融合转录本e13a2被选择作为检测目标。

首先，巧妙地设计了两个茎环探针（SLP1和SLP2）。每个探针分别含有茎环结构和目标特异性识别序列。SLP1与目标BCR-ACL融合基因融合位点杂交，在反转录酶的作用下进行逆转录反应，同时反转录酶具有RNaseH活性能够将目标RNA链切断。由此得到SLP1的延伸产物。

加入SLP2茎环引物、BP引物、BstDNA聚合酶。SLP2链在延伸的同时BP引物能够在聚合酶的顶替作用下，将延伸的SLP2顶替下来，延伸的SLP2能够形成双茎环结构的DNA链。加入FIP和BIP引物在65℃条件下进行LAMP反应扩增，后借助SYBRGreenI荧光染料进行实时荧光检测，从而实现融合基因的定量检测。

茎环引物用量优化

图4-2对不同用量的三种茎环引物进行优化

本实验用三对茎环引物进行了实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction， Real-time qPCR)验证，每对分别设计了3个引物浓度，分别为100aM,1fM,10fM。结果如图所示，A、B、C引物均在10fM引物浓度下最早起峰，可知10fM引物浓度时最佳浓度。并且由图可知，第二种茎环引物的扩增曲线较为平行，可知此引物比较稳定为茎环引物的最优选择。

实验方法分析性能

图4-3实验方法性能证明

图（A）利用两个茎环探针（SLP1和SLP2）实时检测不同浓度e13a2mRNA的实时荧光曲线。从左至右，e13a2mRNA浓度依次为100pM,10pM，1pM，100fM，10fM，1fM，100aM和空白。用相同的程序检测空白，但没有e13a2mRNA。（B）相应扩增曲线的POI值与融合基因e13a2mRNA浓度的对数之间的线性关系。误差线表示三次重复测试的标准偏差

利用两个茎环探针（SLP1和SLP2）对一系列浓度的e13a2mRNA进行检测，结果如图A和B，结果表明浓度在100aM到100pM范围内的e13a2mRNA都能够被准确、灵敏的定量检测。且POI值与-lgCmetDNA(M)在100aM到100pM范围内呈良好的线性关系，其线性方程为：POI=？这个数据不清楚，线性相关系数R2=？。我们证实LAMP技术检测e13a2mRNA性能和检测非甲基化DNA性能相似，这些结果表明，DNA中的甲基化并不影响DNA与茎环结构探针之间的杂交以及后续的连接反应。

方法的特异性

图4-4方法特异性检测

慢性髓性白血病（CML）的分子生物学特征为BCR-ABL融合基因阳性。研究发现，BCR-ABL融合基因根据BCR的断裂位点不同，主要分为三种类型：①M型（major），包括b2a2（e13a2）和b3a2（e14a2），编码相对分子质量210×103的BCR-ABL融合蛋白；②m型（minor）ela2，编码相对分子质量190×103的BCR-ABL融合蛋白；③u型e19a2，编码相对分子质量230×103的BCR-ABL融合蛋白。如图本实验设置了空白组及四种不同基因型的BCR-ABL融合基因，分别为e1a2、e14a2、e19a2、e13a2。分别进行基于PCR的融合基因测定。

如图所示，在进行50分钟反应后，仅有e13a2反应管开始进行扩增，所有其他转录管并未进行扩增反应，即与空白的图像相同（没有任何转录本）。这很好的证明了LAMP测定完全适用于检测e13a2型BCR-ABL融合基因。这些结果强烈表明，即使其他融合转录物共存，测定也显示出对靶融合转录物检测的高特异性。

细胞样品检测

图4-5细胞样品检测

准备了K562、HeLa、MRC-5、MCF-7四种不同的细胞样品，由图可知在1ng和10ng浓度下融合基因e13a2均仅在K562细胞中表达，其他样品中没有检测出转录本。如图所示在不同细胞中检测的目标融合基因e13a2的表达情况不同，且与浓度无关。结果表明BCR−ABLfusion转录本e13a2可用作CML的分子生物标志物。

结 论

通过实验的验证，所提出的基于茎环引物介导的逆转录环介导等温扩增方法可以高效准确的检测出BCR-ABL融合基因。且步骤简单，所用实验仪器操作简便。此外，所提出的测定还表现出超过6个数量级的大动态范围和高特异性，以有效避免来自其他同源融合转录物的干扰。这些特征突出了基于茎环引物介导的逆转录环介导等温扩增方法的能力。本实验针对融合基因的融合位点设计茎环结构DNA引物，在反转录酶和聚合酶的作用下，能够产生双茎环结构DNA产物。该产物能够启动环介导等温核酸扩增反应，由此实现融合基因的灵敏检测，为分子诊断中的各种核酸生物标志物的检测提供了高效，稳健的检测方法。

参考文献

致 谢

写到这里，论文也要接近尾声了，就让我用这篇致谢来为四年的大学生活划上一个句号。与北京科技大学相识于2018年金秋，终于2023年盛夏。时光匆匆，转眼就到了离别的时刻，除了对本科生涯的不舍，更多的是对迈入人生下一个阶段的憧憬和期盼以及对许许多多帮助和陪伴过我的同学、朋友、老师以及我最亲爱的家人的感激之情。

回想初次报到的场景，恍若隔世，一转眼已是离别道别之时。那些美好的点点滴滴，历历在目。早八的逸夫楼电梯总是塞得满满当当，每逢期末就人满为患的图书馆还有再熟悉不过的实验楼……校园里的每个角落都装满了回忆。当年不以为然，总觉得来日方长，我们曾困于这片校园，又无限怀念这段时光。母校带给我了许多机会，让我能够有幸加入国庆700周年阅兵的志愿者行列，亲眼见证了祖国的繁荣昌盛让我由衷的感到自豪和激动。感谢母校四年培育，“求实鼎新”也将铭记于心。

这四年间我也遇到了许多对我帮助很多的老师。首先想要感谢我的毕业设计导师，王洪红老师，在完成毕设的过程中老师一直给予了我很多指导和帮助，。这篇论文从选题，撰写到修改，以至于不久之后的答辩都得到了她的有力指导。除此之外还要感谢本科生导师王康老师，经常关心我的学业和生活情况。感谢赵华老师和李芳墨老师，两位导员老师都十分负责认真，帮助了我很多。

最想感谢的是父母的养育之恩。感谢爸爸妈妈在我学习和生活中的所有鼓励和帮助，教会我独立，教会我成为更好的自己，也容忍了我的无数次任性和冲动。感谢你们能一直尊重我的选择和决定，让我自己选择想走的路。很幸福能够成为你们的女儿，希望爸爸妈妈可以一直平安健康。

还有一直陪在我身边，给我鼓励和安慰的朋友们。感谢我的四位挚友，这是我们认识的第十年。虽然因为距离和疫情不能经常见面，感谢你们听我的碎碎念和抱怨，还不厌其烦的开导安慰我。希望我们可以做一辈子的好朋友。还要感谢在大学期间认识的两位好朋友，也是我的室友。我们一起相处了四年的时光，从陌生逐渐变得熟悉起来，感谢你们能包容我，一起度过了许多开心的瞬间。即使我们马上要分离，由衷的祝愿你们前程似锦，一帆风顺！

最后，感谢无数个奋笔疾书的昼夜，无数个默默坚持的瞬间，都在不经意间汇成生命的宽度。感谢自己在艰难的时刻没有放弃，在踌躇的时刻勇敢做出尝试。对未来依然抱有憧憬和期待，对生活充满热爱，对学习充满热情，在奔赴下一段人生旅途中更加努力，不辜负学校的培养和老师的期待。

论文完成于被疫情笼罩的第三个夏天，希望明年此时世界能够恢复原油的模样，愿山河无恙，我爱的人都能平安顺遂，愿青春不散，初心不改。

不留遗憾，不怕后悔。