葡萄球菌的快速检测方法研究

摘 要

金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 在 1884年首次被发现，Rosenbach 在固体培养基上培养出葡萄球菌，并在同年记录了它能引起食物中毒。1930年，研究人员又明确指出金黄色葡萄球菌引起食物中毒与其产生的肠毒素有关，据估计，进食者摄入约100ng 的肠毒素 A 即可出现中毒症状。典型的金黄色葡萄球菌呈球型，直径为 0.8μm 左右，显微镜下排列成葡萄串状，无芽胞、鞭毛，大多数也无荚膜，属于革兰氏阳性细菌。目前，随着国际食品贸易不断发展，食品中致病微生物检测方法的研究也在不断向前发展，除了传统的培养方法之外，近年来，人们采用免疫学、生物化学和分子生物学等先进技术进行了食品中致病微生物快速检测方法的研究。对于金黄色葡萄球菌也不例外，传统的检测方法主要采用细菌分离培养及生化鉴别，免疫学方法( 如: 酶联免疫、免疫转印、乳胶凝集等方法) 因其快速、操作简便，逐步应用于食品卫生检测。但新的分子生物学技术已显示出其在食品卫生检测方面的独特优势。本文主要针对这四种快速检测方法展开一系列地研究。

关键词：食品；金黄色葡萄球菌；快速检测方法

第1章 绪论

1.1 研究背景

金黄色葡萄球菌是一类广泛存在于自然界的空气、水、土壤以及人类和动物的排泄物中的革兰氏阳性菌，对营养条件的要求不高。在非芽孢菌中，金黄色葡萄球菌对外界环境的抵抗能力最强。金黄色葡萄球菌因为其分泌的毒素和侵袭性酶而引起食物中毒，如杀白细胞素、肠毒素、溶血毒素、血浆凝固酶和脱氧核糖核酸酶都是其分泌的毒素和侵袭性酶。食品在生产销售的过程中，由于其加工前自身带菌，加工过程中被污染，包装密封不严格，生产或销售人员带菌以及在运输过程中都可能受到该菌的污染。人一旦食用了被金黄色葡萄球菌污染的食物后极易引起食物中毒，会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状，严重的会导致死亡。在我国的细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占四分之一，居于第四位。在X，每年也有超过十八万的人由于食用了被金黄色葡萄球菌污染的食物而中毒，其中约百分之一需要住院，造成严重的经济损失。在欧盟国家，1993~1998 年之间由于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性疾病的 4.5%。有关日本的调查结果显示，大约三分之一的食品存在被金黄色葡萄球菌污染的可能。根据X CDC 的调查报

告显示，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的三分之一，仅次于大肠埃希氏菌，位居第二位。而加拿大的金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的 45%。由此可见，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒已呈现出全球的分布状态，已经成为世界公共卫生的一个重要问题。

随着人们生活水平的提高，对食品安全问题的关注也日益增加，国内外很多学者也致力于食品中致病菌的快速检测的研究。目前，金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括传统平板方法的改进，以分子生物学为基础的核酸探针技术、聚合酶链反应技术(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)技术以及以免疫学理论为基础的免疫磁珠技术、酶联免疫技术(ELISA)、乳胶凝集技术、免疫荧光技术(IFA)。

传统检测方法的改进方法虽然成本较低，有较强的敏感性，但是检测时间较长，操作比较繁琐。以分子生物学为基础和以免疫学为基础的检测方法虽然检测时间短，但是检测费用较高，灵敏性也相对较低，同时，某些检测方法对试验条件和实验人员的操作要求较高，不能得到普及。因此，如何建立一种快速、操作简便、灵敏性高且经济的金黄色葡萄球菌检测方法已经成为国内外微生物研

究工作者的重要课题。

随着计算机技术的普及，计算机视觉技术在近几十年内也得到了突飞猛进的发展。计算机视觉技术的应用领域涉及工业生产、气象观察、医疗诊断以及国防等多个方面。也推动了其在生物、农业等领域烦的发展应用，如计算机视觉技术在农业中主要应用于农副产品的分级和品质检验、监测农作物的生长状况、以及农作物病虫害的防治等方面。也有研究学者将其用于检测微生物，如Saurabh Kumar、Gauri S. Mittal把荧光染色技术和计算机图像处理技术相结合，用于检测病原菌。孙钟雷

等人将显微图像处理技术应用于啤酒中酵母菌总数的检测。在微生物的自动分类识别中，相对于人工肉眼识别，计算机视觉技术可以减少误差，能够快速、准确的检测食品中的微生物。

2009年10月1日21时30分，乌海市某酒店多位客人在该酒店就餐后陆续出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛症状，在乌海市人民医院接受治疗，怀疑食物中毒。接到报告后，乌海市疾控中心组织专业人员会同市卫生监督所监督人员，立即对此事件进行了调查处理，现将结果报告如下。

根据流行病学调查、临床表现及实验室结果分析，依据GBl4938—1994《食物中毒诊断标准及技术处理总则》，可以判定这是一起食用被金黄色葡萄球菌污染的食物引起的细菌性食物中毒。

乾佳酒店婚宴菜品中鸭胸、夫妻肺片、鸡胗、肘花4种菜品为熟肉制品，属于我国最容易引发葡萄球菌食物中毒的食品之一。金黄色葡萄球菌食物中毒流行病学特点为发病急，潜伏期一般为2-4 h。本次食物中毒13名患者中有4人发病潜伏期为2～4 h，6人发病潜伏期为10—12 h。金黄色葡萄球菌食物中毒的临床表现为恶心、剧烈的反复呕吐、腹痛、腹泻等胃肠道症状。本次食物中毒13名患者的临床表现与之基本相符。从中毒食品中经培养检出金黄色葡萄球菌(且前，乌海市疾控中心没有能力开展菌株的肠毒素检测)。由于参加9月30日晚夜坐而未参加lo月1日中午婚宴的人员共5人，均未发病，因此可以确定中毒餐次为中餐。鸭胸、夫妻肺片、鸡胗、肘花4种菜品检出金黄色葡萄球菌，因此可确定中毒食品。

1.2 研究意义

随着人们生活水平的提高，人们对食品质量安全的要求日益增强，由于传统的检测方法存在诸多的不足，因此，研究一些操作方便、检测效率高、经济成本低、高准确度并且便于基层企业单位应用的微生物快速检测方法就显得尤为必要，这对整个食品行业来说可以实现微生物的及时检测，降低出厂后由于食品中微生物指标不合格带来的风险，减少其经济损失，具有重要的社会意义。作为条件致病菌的金黄色葡萄球菌由于广泛存在于自然界中，因此食品受其污染的可能性很高，一旦食品受其污染后，在适宜的条件下会迅速增殖，并产生多种致病毒素，人一旦食用了这种被污染的食物，极易引起食物中毒。而目前由于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事例也屡见不鲜。通过上述对金黄色葡萄球菌检测方法的分析可知，目前的金黄色葡萄球菌检测方法中没有一种检测方法同时具备检测时间短、检测成本低、检测准确性高且检测限低的条件。因此，研究寻找一种金黄色葡萄球菌的快速检测方法对食品的卫生控制具有重大的实际性意义。

1.3 研究内容

本文共分为四个部分

第一部分为绪论。提出该课题的研究背景、研究意义，对本文的研究内容做了大致地介绍。

第二部分为金黄色葡萄球菌简介，主要包括如下内容，即金黄色葡萄球菌生物学特征、金黄色葡萄球菌的致病性以及金黄色葡萄球菌的流行病学。

第三章为食品中金黄色葡萄球菌常用的检测方法，主要包括以下四种检测方法，分别为传统的检测方法、免疫学检测方法、以分子生物学为基础的快速检测方法、商业化快速检测方法。

第四部分为金黄色葡萄球菌四种检测方法的案例及分析。对金黄色葡萄球菌四种检测方法的案例进行了介绍，并且做出分析。

1.4 研究方法

本文主要采用的研究方法为文献资料法和对比分析法。

文献资料法。本文查阅了大量相关的文献，并且从中提炼出比较有用的观点。

对比分析法。对食品中金黄色葡萄球菌常用的四种检测方法进行了对比分析。

第2章 金黄色葡萄球菌简介

2.1金黄色葡萄球菌生物学特征

金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的一种，属于革兰氏阳性菌。直径为 0.8~1.5μm，金黄色葡萄球菌无鞭毛、芽胞，少部分有荚膜，不能运动。为需氧或兼性厌氧菌。最适宜的生长温度为 37℃，PH 值为 7.4。金黄色葡萄球菌具有高度的耐盐性，在高盐培养基中可以良好的生长。金黄色葡萄球菌还可以分解乳糖、麦芽糖、蔗糖、核糖、松二糖、甘露糖产酸不产气。其可以分解甘露醇，还可以产生溶血物质，因此在血平板上培养会产生溶血环。其产生的血浆凝固酶可以使血浆产生凝固，这也是金黄色葡萄球菌区别于其他葡萄球菌的的主要性质。还可以还原硝酸盐，产生脂酶和卵磷脂酶，因此在 Baird-Parker 培养基上培养的金黄色葡萄球菌可以在菌落周围产生沉淀环和透明圈。金黄色葡萄球菌在一般的营养物质中就可以良好的生长，但是只有当生长条件如营养成分、温度水分活度、pH 等条件适宜的情况下才会产生肠毒素，而肠毒素的产生是导致食物中毒的原因。金黄色葡萄球菌抵抗外届不良环境的能力很强，在 80℃条件下加热达到 30min 才能使其死亡。

2.2金黄色葡萄球菌的致病性

金黄色葡萄球菌可以产生多种毒素，这也是金黄色葡萄球菌导致食物中毒的原因，其分泌的毒素经过血清学鉴定包括 14 种，其中 SEA 和 SED 是细菌性食物中毒中最常见的肠毒素，其次是 SEB、SEC。当人体摄入几微克的肠毒素就可以导致食物中毒。同时金黄色葡萄球菌还能产生α、β、γ、δ四种溶血毒素、这些溶血毒素可以导致血小板和溶酶体损伤，杀白细胞素、血浆凝固酶、表皮剥落毒素、毒性休克综合征毒素-1 等多种致病性毒素。有的毒素可以导致人的白细胞和巨噬细胞的损坏，有的可以导致血液中的纤维蛋白沉积，这些均可以导致人体治病。此外，在人类的化脓感染致病菌中，金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌。金黄色葡萄球菌甚至还可以引起人类的化脓感染，肺炎、心包炎等多种疾病。

2.3金黄色葡萄球菌的流行病学

在自然界的空气、水、土壤以及人类和动物的排泄物中均广泛的存在着金黄色葡萄球菌，在健康人的鼻腔、咽喉，头发上也有发现，因此，食品如果在生产销售环节中由于生产者操作不当均有可能导致金黄色葡萄球菌污染。由于春夏季的气温和湿度都很高，金黄色葡萄球菌在这种环境下可以大量繁殖，容易导致金黄色葡萄球菌的季节性分布。容易受金黄色葡萄球菌污染的食物种类繁多，其中以肉类制品、蛋类制品以及乳类食品为主。含乳的冷冻制品次之。

由于金黄色葡萄球菌产生的食物中毒事件受到全球的关注，经过 ICMSF（国际食品微生物规格委员会）的危害度评估，金黄色葡萄球菌被列为中度直接局部传播性病原菌。日本对金黄色葡萄球菌的危害性评估结果与 ICMSF 的评估结果相同。

2.4金黄色葡萄球菌的耐药性分析

近年来，随着抗菌药物的广泛使用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检出率有增高的趋势。上海地区1985~1986年，MR-SA分离率为24%，1993~1994年分离率为60%，2001~2005年平均分离率为89%。广州地区2000年分离率为50.8%，2003年分离率达70.8%。任南等监测全国城市79家医院显示，MRSA分离率为79.93%。江华等收集并分析了本院2009~2010年101株金黄色葡萄球菌的耐药情况，为临床合理使用抗菌药物提供参考。此次本院分离出的101株金黄色葡萄球菌中MRSA占20.79%，提示本院细菌耐药情况控制得相对较好。101株金黄色葡萄球菌中，青霉素和氨苄西林的耐药率分别为80.2%和77.23%，表现出高耐性。对利奈唑胺100%敏感。MRSA与MSSA对氯霉素、氯洁霉素、头孢唑林、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、苯唑西林、青霉素、利福平、甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑、四环素、氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸的耐药率进行统计分析，结果差异具有统计学意义(P<0.05)。金黄色葡萄球菌除对青霉素和氨苄西林表现出高耐药性外，体外抗菌活性均较好，尤其是利奈唑胺耐药率为0，可作为临床用药参考依据。

第3章 食品中金黄色葡萄球菌常用的检测方法

3.1传统的检测方法

食品中金黄色葡萄球菌的国标检测方法多采用平板计数法，我国食品中金黄色葡萄球菌的检测是以 GB4789.10-2010 为依据。该标准分为两个部分，一是定性检测，二是定量检测。定性检测是将待检样品于无菌环境中接种到 7.5%氯化钠肉汤或者 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤，在适宜温度下培养一定时间后再将混合培养物划线接种到血平板或者和 Baird-Parker 平板上，培养后观察其特征，最后通过镜检和血浆凝固酶试验进行鉴定。而定量检测采用的是将样品直接做10 倍系列稀释液，然后选择适宜稀释度的样品接种到 Baird-Parker 平板上，在适宜的环境中培养一定时间，然后进行典型菌落的计数。另外一种定量检测方法是将稀释好的三个梯度的稀释液分别接种于 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤中，每个梯度平行做 3 管，培养一定时间后在转接到 Baird-Parker 平板上进行再培养，然后对典型菌落进行确认，通过查 MPN 表进行金黄色葡萄球菌的定量检测。金黄色葡萄球菌的肠毒素可以通过 ELISA 检测试剂盒对 A、B、C、D、E型肠毒素进行检测。

国标法检测金黄色葡萄球菌准确，操作人员无需进行特殊的培训，但是也因为该法的检测时间长，整个过程需要 4-5 天，这就限制了其在食品工业生产实时检测中的应用。因此，寻找一种快速、简单、经济、准确性高的金黄色葡萄球菌检测方法就成了时下研究的热点问题，国内外众多学者在致病微生物的快速检测上取得了可喜的成果。

3.2免疫学检测方法

尽管免疫学方法目前运用的较为广泛，但对于一些新近出现的肠毒素，如：SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN 和 SEO 等，目前还没有商业化的检测系统。这样一来，以分子生物学为基础的方法就发挥着独特的优势。

3.3以分子生物学为基础的快速检测方法

随着分子生物学的不断发展，在病原微生物检测和研究方面，PCR 技术成了除上述方法之外的很好选择。PCR 技术具有快速，特异性强、灵敏度高、检测限低以及可以成为自动化的趋势等优点，与传统方法相比，PCR 的这些优点不断地鼓舞着人们去使用和研究。PCR 在食品微生物诊断和食源性疾病鉴定应用上有许多文献报道。基于 PCR 的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对 PCR 技术进行研究和改进，使 PCR 技术得到了进一步完善。例如，在一个反应管中使用多套引物，针对多个 DNA 模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程称之为多重PCR，可以满足同时分析不同 DNA 序列的需要，尤其是在致病菌的检测和科学研究时，在一个反应管中能够同时检测多种目标 DNA，不仅能够节省实验样品，而且能使以往繁琐的操作变得省时省力。PCR技术的另一个飞跃是荧光 PCR，这项技术由XApplied Biosystems 公司于 1995 年推出，不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR 相比，特异性更强、自动化程度更高，并能有效解决 PCR 污染问题，目前已得到较为广泛的应用。荧光 PCR 技术是指在普通 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累检测整个 PCR 反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的一种方法。荧光 PCR技术在常规 PCR 基础上，添加了一条标记有两个荧光基团的探针。一个标记在探针的 5’端，称为荧光报告基团（ R） ；另一个标记在探针的 3’端，称为荧光抑制基团（ Q） 。两者可构成能量传递结构，即 5’端荧光基团所发出的荧光可被 3’端的荧光抑制基团吸收或抑制。当二者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，这就是荧光共振能量迁移（ FRET，Fluorescent Resonance Energy Transfer） 原理。

荧光信号与 PCR 产物同比增长，随 PCR 产物的增加而增强，荧光 PCR 方法就是利用此原理，在 PCR 反应过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。荧光 PCR 检测体系常用的荧光探针基本分为三种类型：TaqMan 探针、分子信标（ molecular beacon）和荧光杂交探针。荧光 PCR 集扩增和检测于一体，直接闭管测定，无须分离和冲洗，操作简便快速，容易自动化，杜绝了产物污染源，并采用实时检测，大大提高了定量的准确性。

PCR 技术检测金黄色葡萄球菌所选用的靶基因主要有：肠毒素基因（ sea，seb，sec，sed，see，seg，seh，sei，sej） ；耐热核酸酶基因（ nuc） ；凝固酶基因（ coa）；抗性 基 因 （ mecA，femA，ermA，ermB，ermC，ereA，ereB，aacA－aphD，tetK，tetM，vatA，vatB，vatC 等） ；16SrRNA 基因；影响生物被膜形成基因，如 icaADBC等。用于食品中检测金黄色葡萄球菌的靶基因主要是肠毒素基因和耐热核酸酶基因（ nuc） ，耐热核酸酶基因具有特异性好的特点，自从 PCR 技术诞生，人们就一直应用 nuc 基因来检测金黄色葡萄球菌。文献报道 1991 年 PCR 技术开始用于金黄色葡萄球菌检测，当时 Wilson 首次根据 entB、entC1 和 nuc 基因序列检测金黄色葡萄球菌。1992 年，Brakstad 根据 nuc 基 因 检 测 金黄 色 葡 萄 球 菌。1993 年，Chesneau 报道了利用耐热核酸酶基因特异性检测金黄色葡萄球菌。1996 年，Piotr 等人根据 nuc 基因和 mecA 基因，应用多重 PCR 快速检测抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌。1997 年，Saruta 等应用巢式PCR 对金黄色葡萄球菌进行快速检测和分型。

2000 年以后，多重 PCR 检测技术和实时定量 PCR 技术在金黄色葡萄球菌检测中发挥着重要的作用，如:Tamarapu 发展了多重 PCR 检测乳制品中的金黄色葡萄球菌；Chen 等应用实时荧光 PCR 检测奶中的金黄色葡萄球菌；Fischer 等应用定量实时 PCR 和免疫方法相结合检测金黄色葡萄球菌肠毒素。由此可见，利用多重 PCR 和实时荧光 PCR 技术是检测金黄色葡萄球菌的发展趋势。

3.4商业化快速检测方法

随着研究的深入，许多快速检测方法已经商品化，这些新的快速检测系统缩短了传统检测方法的时间，而且能够较快得到检测结果，操作相对简单。利用生理生化的特性制造的试剂盒，如法国梅里埃公司生产的 RPF 试剂盒和 API 检测系统等。利用免疫分析法和免疫荧光法制造的检测试剂盒，如Staphylococcus VIA( TECRA) 、Staphylococcus ET VIA( TECRA ) 、Staphylase ( Oxoid ) 、VIDAS － ST ET( bioMerieux Vitek) 和 Transia Tube SET test( GENE－TRAK) 等。利用免疫胶乳微粒凝集实验发展起来的快速检测试剂盒，如 SET－RPLA( Unipath Ltd.) 、Staph－Rapid Test( Roche，Basel) 、Staphylex( Unipath Ltd.) 、Slidex Staph kit ( bioMerieux Vitek ) 、StaphylococcusLatex ( HardyDiagnostics ) 、Monostaph ( Bionor A / S.) 、Rida － Screen ( R － Biopharm GmbH Darmstadt.) 、DRYSPOT Staphytect Plus ( Oxoid ) 、 Staphytect( Oxoid) 、Slide Agglutination test( Becton Dickinson) 。基于 DNA 检测的试剂盒也已诞生，如：Accuprobe

S.aureus( GenProbe Inc.) 、GENE － TRAK Colorimetric( GENE － TRAK ) 和 TAQMAN ( PE AppliedBiosystems) 。这些方法操作简单但检测成本十分昂贵，我国极少拥有自己的知识产权，因此研究开发具有我国知识产权的快速自动检测系统是国内科学工作者的研究重点。

第4章 金黄色葡萄球菌四种检测方法的案例及分析

4.1传统的检测方法案例分析

传统和标准的食品微生物学分析( GB 4789.10－2010)金黄色葡萄球菌主要依赖于前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤。如将食物样品首先接种于 7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基内，进行增菌培养 24h，然后转种于血平板和 Baird－Parker 平板上划线分离培养 24h，再挑取 Baird－Parker 黑色的菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶实验。血浆凝固酶实验用新鲜兔血浆，放入小试管中，加入培养 24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物，振荡摇匀，放在温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察 6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为呈阳性结果，同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。进行肠毒素的检测，全程需时大概 4～8d，方法繁琐。

4.2免疫学检测方法案例分析

金黄色葡萄球菌自身具有多种蛋白质抗原，其中肠毒素（ 如 SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE） 和 SPA 经常用于金黄色葡萄球菌的检测。以抗体为基础的金黄色葡萄球菌检测方法大致有 5～6种，如：酶联免疫吸附法、反向被动胶乳凝集法、放射免疫测量法、反向血凝实验、显微玻片凝胶双扩散法等，后几种方法较为费时、麻烦、灵敏度也较差，而且要求有专门的技术和工具，在使用中不易掌握和现场检测。随着科学的进步，检测手段也日益先进，肠毒素的检测方法日益趋于快速、简便和高灵敏。研究发现，改变反向胶乳凝集法中的离心重力加速度 g的作用及时间，可以很好地减少检测时间，从原来的20～28h，减少到 4 ～6h；如果在这种方法中使用磁性颗粒和磁力来加速胶乳颗粒的沉降，将是一种很有发展前途的方法。酶联免疫吸附法是目前新近推出的比较实用的检测方法之一。酶联免疫吸附法是将酶分子与抗体分子联合结成酶标记分子，当与固相免疫吸附剂中相应的抗原或抗体、或抗原抗体结合物相遇时形成酶抗原－抗体结合物，加入酶底物，结合物中的酶水解底物，使无色的底物溶液生成有色的反应产物。根据颜色的深浅，即可测出溶液中的抗原（或抗体） 的量。酶联免疫吸附法又分为直接法和间接法两种，由澳大利亚进口的酶联法试剂盒（TECRA） 属间接法，用已知的抗原吸附在固相载体上，与待检的肠毒素标本中的抗原作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白（抗抗体） ，使之与特异抗原抗体复合物中的抗体作用，加入酶底物，产生的颜色反应与标本中的肠毒素抗原量成正比。

4.3以分子生物学为基础的快速检测方法案例分析

4.3.1 材料与方法

1.材料

（1） 菌种及其来源 菌种接种于营养肉汤培养基中37摄氏度，振荡过夜培养至菌悬液浓度达到109CFU/ml。

供试菌种及其来源

（2）培养基 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、Baird-Parker培养基，购自北京市陆桥技术有限公司Petrifilm RSA. Count Plate 购自X3M 公司；Baird-parker+RPF Agar 购自法国梅里埃公司。

（3） 乳制品 全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。

（4） 仪器及试剂10X PCR buffer、 dNTPs、 TaKaRa Taq 、DNA Marker DL2000，购自大连宝生物工程公司；引物（正向引物，反向引物）由大连宝生物工程公司合成；溶葡萄球菌酶购自上海高科技术有限公司；无水乙醇、石油醚 氯仿、氨水、糖原均为国产分析纯产品。

PCR仪为Whatman T Gradient基因扩增仪，电泳仪为北京市六一厂生产DXY-33A型电泳仪，凝胶成像系统为华粤企业集团有限公司UVIpro凝胶成像系统。

2.方法

（1）乳制品人工污染

在人工污染金黄色葡萄球菌前 全脂乳 脱脂乳和奶酪均按国标法检测证实不含有金黄色葡萄球菌 1 将金黄色葡萄球菌人工污染到全脂乳和脱脂乳中 使样品中金黄色葡萄球菌的浓度依次为 100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/ml 直接提取人工污染脱脂乳和全脂乳中金黄色葡萄球菌的 DNA。（2） 奶酪人工污染金黄色葡萄球菌的方法为：取 20 g 奶酪在研钵中磨碎 加入 40摄氏度2%柠檬酸钠 90 ml 混匀制成均质液，然后对奶酪均质液人工污染的浓度依次为 100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/ml 直接提取奶酪均质液中金黄色葡萄球菌的 DNA。

（2）DNA 提取

步骤如下 ： 1）将 1 ml 无水乙醇 1 ml 氨水和 1 ml 石油醚分别加入到 5 ml 人工污染金黄色葡萄球菌的全脂乳 脱脂乳和奶酪均质液中，混匀。

2） 混合物以 12 000X g，离心 10 min。弃去上清液，沉淀用 300 μl 10 mmol·L-1TE（pH 7.8）溶解后，加入 5 μl 10 mg·ml-1溶葡萄球菌酶 37 摄氏度温育 1 h，期间不断剧烈振荡。然后加入 50 μl 10%的 SDS 煮沸 5min。

3）将等体积的氯仿加入上述混合液中，充分振荡混匀， 17 000 Xg 离心 10 min 弃沉淀，保留上清液。

4）将上清液移入一新的离心管中，用 0.1 倍体积 2.5 mol·L-1乙酸铵 （pH 5.4 ），2.5 倍体积预冷无水乙醇和 5 μl 10 mg·ml-1糖原沉淀 DNA 混合物 17 000g 离心 20 min。 DNA 沉淀干燥后用 100 μl 灭菌双蒸水溶解，备用。

（3）PCR 引物序列引自文献[1， 4] 由大连宝生物公司合成 正向引物 5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′ 目的扩增产物大小为 279 bp 反向引物 5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′PCR 反应体系：总反应体系 50 μl 包括 5 μl10×PCR buffer，4 μl dNTPs 混合物 0.5 μl 40 μmol 正向引物 0.5 μl 40 μmol 反向引物 0.25 μl （5 U·μl-1）Taq，模板 2 μl ，水 37.75 μl。PCR 扩增程序 ：PCR 反应采用冷启动 。94 摄氏度预变性 4 min，再按 94摄氏度1min→52摄氏度 0.5 min→72摄氏度 1.5 min 进行 35 个循环，最后72摄氏度延伸 3.5 min。电泳检测：取 5 μl PCR 产物在 2%琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并成像。 PCR 产物鉴定：大连宝生物工程公司对 PCR扩增产物进行 DNA 测序。

（4）PCR 方法与其它快速检测金黄色葡萄球菌方法比较 1）本研究利用 PCR 直接检测乳品中金黄色葡萄球菌方法与两种快速检测致病性金黄色葡萄球

菌的培养基及 GB 4789.10–94 方法进行比较，确定PCR 直接检测乳品中金黄色葡萄球菌方法的特异性、符合率、灵敏度。2）所采用的两种快速检测致病性

金黄色葡萄球菌的培养基分别为：Petrifilm RSA.CountPlate 是由X 3M 公司生产的薄膜型快速检测金黄色葡萄葡萄球菌的计数平板；Baird-parker+RPF Agar 是由法国梅里埃公司研制生产的 Baird-parker 琼脂加兔血浆纤维蛋白原的金黄色葡萄球菌检测计数平板。这两种快速检测培养基的接种方法均按生产商所提供的使用说明进行操作。共检测乳品 35 件，其中鲜牛奶20 件、 UHT 灭菌乳 5 件、奶粉 5 件、奶酪 5 件。将 4种检测方法作对比，确定 PCR 直接检测乳品中金黄色葡萄球菌方法的符合率、敏感性。计算公式分别为：

敏感性=真阳性数/ （真阳性数+假阴性数）

符合率= （真阳性数+真阴性数） /被检总数

4.3.2 结果与分析

1. 引物特异性

从所有供试菌株中提取DNA进行PCR扩增检测引物特异性(图1)。由图1可知，只有金黄色葡萄球菌才可特异扩增出靶基因，其余菌种均未扩增出任何产物。因此该引物特异性强，可用于PCR检测金黄色葡萄球菌。

金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌 PCR 反应结果

2.PCR 检测乳品中人工污染的金黄色葡萄球菌

由图 2 可知，除了含 100CFU/ml 金黄色葡萄球菌的全脂乳、脱脂乳、奶酪均质液样品外，其它人工污染的样品（含 101~108CFU/ml 金黄色葡萄球菌）均成功检测出了金黄色葡萄球菌。由于奶酪中脂肪含量比较高，采用本方法虽可移除大部分的抑制因子，但可能仍有少量抑制因子存在，影响了 PCR 扩增，所以图 2-C 的电泳带不甚清晰

由表 2 可知，全脂乳和脱脂乳的检出限为 10CFU/ml 奶酪均质液的检出限为 10 CFU/ml 。因为本试验将 20 g 奶酪经研磨后与 90 ml 的 2%柠檬酸钠溶

液混合成 110 ml 的奶酪均质液，进行人工污染，然后进行 PCR 检测。因此，经换算奶酪中金黄色葡萄球菌的检出限为 55 CFU/g （10 CFU/ml 110 ml/20 g）。

人工污染后乳及乳制品中 PCR 检测金黄色葡萄球菌的检出限

人工污染的全脂乳（A）、脱脂乳（B）、奶酪均质液(C)中金黄色葡萄球菌 PCR 检测结果

3. PCR产物鉴定

大连宝生物工程公司对PCR扩增产物进行DNA测序。通过序列测定可知，PCR扩增产物DNA序列与文献报道的靶基因序列的同源性达99.6%，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物(数据略)。

4. PCR方法与其它检测金黄色葡萄球菌方法比较

为了验证本检测方法对实际乳品检测的效果，本研究检测了从超市购买的UHT灭菌乳、奶粉、奶酪和鲜牛奶等样品，共计35件。该检测方法同时与GB

4789.10-94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片比较。检测结果(表3)表明，PCR方法的敏感性为100%，符合率为94.3%；Petrfilm RSACount Plate方法的敏感性为100%，符合率为97.1%；Baird-parker+RPF Agar方法的敏感性为100%，符合率为97.1%。 PCR方法与Petrfilm RSA. Count Plate方法和Baird-parker+RPF Agar方法的敏感性相同，检出率均高于这两种方法，但符合率略低于这两种方法，分析其原因可能是因为PCR方法灵敏度高，且有时不能区分样品中的死菌与活菌所致。

PCR方法敏感性、特异性、符合率

Petrfilm RSA. Count plate 及 Baird-parker+RPFAgar 都在样品接种后 28~ 30 h 观察结果，不必再做证实试验，而 Baird-parker Agar 检测，须在接种后 48 h观察平板，并挑取可疑菌落转到营养肉汤中，再经18 ~24 h 后做血浆凝固酶或耐热 DNA 酶试验进行证实，前后须 80 h。X 3M 公司生产的 Petrifilm RSA.

Count Plate 培养基和法国梅利埃公司生产的Baird-Parker +RPF Agar 培养基检测乳品中的金黄色葡萄球菌，与国标检测方法相比，时间可缩短一半，但检测时间仍然较长。而 PCR 方法从对样品的处理到检测结束约需 6 h ，大大缩短了检测时间，该方法对于检测乳及乳制品中金黄色葡萄球菌是一种快速、有效

的方法。该方法省略了样品前增菌的过程，比目前采用的先增菌再进行 PCR 检测的方法，检测时间可缩短12~24 h。更加符合快速检测的要求。

4.3.3 讨论

食品的成分极为复杂，有些成分为 PCR 反应抑制因子，可导致 PCR 检测灵敏度的下降，食品中的脂肪成分被认为是降低 PCR 检测灵敏度的主要因素之一。Wilson 等利用 PCR 从脱脂乳中检测出105CFU/ml 的金黄色葡萄球菌，灵敏度较低，可能是由于提取的 DNA 中含有 PCR 反应抑制因子或是 PCR反应条件没有优化到最佳所致。Mclauchlin 等报道从奶酪中提取的 DNA 中含有 PCR 反应抑制因子，影响 PCR 检测。Lantzetal 等利用多重 PCR 技术检测猪

肉样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌，该方法对样品进行增菌后，使检测灵敏度达到 102CFU/ml 。Jinneman等利用多重 PCR 扩增技术检测原料奶、牛肉等样品中 E coli O157:H7的 DNA 也是利用增菌来提高检测的灵敏度，虽然增菌提高了检测灵敏度，但也延长了检测时间，一般可延长 12~24 h。

本研究无需增菌，直接从污染金黄色葡萄球菌的乳品中提取 DNA，利用 PCR 技术对金黄色葡萄球菌的 nuc 基因进行扩增来检测该菌。该方法可直接从人工污染的全脂奶、脱脂奶和奶酪中检测出金黄色葡萄球菌，全脂奶检出限为 10 CFU/ml 、脱脂奶检出限亦为 10 CFU/ml 、奶酪的最低检出限 55 CFU/g，整个检测过程可在 6 h 内完成，比目前普遍采用的先增菌再进行 PCR 检测的方法缩短了 12~ 24 h。其检测灵敏度远高于导致食物中毒所需的金黄色葡萄球菌数。该方法对于检测乳及乳制品中金黄色葡萄球菌是一种快速、有效的方法，而且还可以用来监测 HACCP 的危害分析关键控制点，以监控在牛奶的收集过程以及产品加工后金黄色葡萄球菌的污染情况。但在对实际样品检测中还无法区分样品中的死菌与活菌，且需要专门的仪器设备和专业人员操作，此外在推广 PCR 方法时还应尽量完善 PCR 检测方法的标准，便于其推广使用。

4.4商业化快速检测方法案例分析

一种新的快速检测方法的实际应用性主要是通过与传统的标准检测法进行对比而得出。本章通过将金黄色葡萄球菌的快速检测法与传统平板培养法（国标法）进行对比，确定该快速检测方法的检测灵敏性、与传统检测方法的相关性，并建立标准曲线，对该方法进行评价。

4.4.1 试验材料与设备

1.试验菌株

金黄色葡萄球菌来自于吉林大学畜牧兽医学院的菌种保藏处。使用时将其用营养琼脂传代培养两次后，接种于 LB 培养基中于 37℃、120rmp 条件下振荡培养 18h-24h 后用无菌生理盐水中做 10 倍系列稀释，得到浓度为 101~108cfu/ml 的金黄色葡萄球菌菌悬液。以上操作于无菌环境下进行。

2. 试验仪器

试验仪器表

试验用器具还包括玻璃棒、培养皿、棉花、纱布、载玻片、酒精灯、接种环、移液枪头、烧杯、试管、注射器、漏斗、锥形瓶、量筒、报纸、麻绳、擦镜纸、滤纸等。

3. 试验主要试剂及配制方法

液体 LB 培养基：需要时取 25.0g 溶于 1000ml 蒸馏水中，加热溶化后调节至PH7.4±0.1，然后分装于锥形瓶或者试管中于 121℃条件高压灭菌 15min 备用。

1%亚碲酸钾溶液：将 1g 亚碲酸钾粉末溶于 100ml 水中，然后用孔径为 0.45μm 的混脂低吸附水系膜过滤器进行过滤除菌后备用。

卵黄亚碲酸钾增菌剂：将新鲜鸡蛋浸泡于 1：1000 的氯化汞溶液中 1min（或浸泡于 70%酒精溶液中半小时），以无菌操作打开鸡蛋，使蛋黄与蛋白分开，将蛋黄加于生理盐水中（30%）充分振荡摇匀，然后将 10ml 过滤除菌的 1%亚碲酸钾水溶液加入到 50ml 该卵黄乳液中混匀，于 4℃的条件下储存备用。

Baird-Parker 培养基：取蛋白胨、丙酮酸钠各 10.0g，牛肉膏、氯化锂各 5.0g，

酵母膏 1.0g，甘氨酸 12.0g，琼脂 20.0g 于 950ml 蒸馏水中加热至完全溶化，调节 PH 至 7.4±0.2，分装每瓶 95ml，于 121℃条件高压灭菌 15min，临用时加热溶化该琼脂混合物，冷却至 50℃左右，同时取加热至 50℃左右的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5ml 加入到95ml 琼脂混合物中，摇匀后倾注平板，可以在冰箱中存储48h。

金黄色葡萄球菌选择培养基：取胰蛋白胨 17.0g，植物蛋白胨 3.0g，氯化钠

68g，磷酸氢二钾 2.5g，葡萄糖 2.5g，丙酮酸钠 5g，甘氨酸 9g，苯乙醇 3.8ml

溶于 990ml 水中溶解后，用 1mol/L 的氢氧化钠溶液调节 PH 值至 7.4±0.1，然后于121℃高压灭菌 20min 后取出冷却至室温，然后向该冷却液中加入 6ml 已灭菌的1%亚碲酸钾溶液。混匀后备用。

4.4.2试验及分析方法

1. 快速检测方法检测范围的确定

取不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液采用快速检测方法进行检测，确定该检

测方法的检出限。并同时采用食品安全国家标准中金黄色葡萄球菌的检测方法中

的 Baird-Parker 平板计数法进行检测。通过对两种检测方法的对比分析快速检测法的检出限。

（1）金黄色葡萄球菌快速检测方法：取 1.5ml 无菌离心管，加入 0.9ml 金黄色葡萄球菌选择培养基，将金黄色葡萄球菌悬液 0.1ml 接种到该离心管中，置于 37℃条件下培养 4h，然后将该培养混合物用无菌蒸馏水稀释至 10ml，用无菌注射器取该 10ml 稀释液用孔径为 0.45μm，直径为 13mm 的混脂低吸附水系膜过滤进行过滤浓缩。再向该浓缩膜中打入 50μL 气体，并将过滤膜中的剩余液体反复吹打三次，将其混匀。取膜中剩余液体的 2μL 滴到载玻片上固定位置，在自然条件下风干、然后用胶头滴管取无菌蒸馏水冲洗，用滤纸吸去载玻片上多余的水分。如果存在少量的液体，也可以自然风干。最后将该载玻片插入 WKJ-II 型微生物快速检测仪中进行检测。

（2）金黄色葡萄球菌的 Baird-Parker 平板计数法：根据 GB 4789.10—2010 中金黄色葡萄球检测方法中的第二法金黄色葡萄球菌 Baird-Parker 平板计数法进行检测。对固体样品称取 25g 置于装有 225ml 生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打 1min~2min，制成 1：10 的样品匀液。而液体样品直接吸取 25ml 加入到装有 225ml 无菌生理盐水的锥形瓶内混匀制成 1：10 的样品匀液即可。然后对 1：10 样品匀液依次做 10 倍系列稀释，得到不同浓度的样品匀液。取 2、3个浓度适宜的样品匀液吸取 1ml，并以 0.3ml、0.3ml、0.4ml 接种量分别接种到Baird-Parker 平板中并涂布（涂布时避免触及平板边缘），静置 10min 后翻转平板，放在 37℃恒温培养箱中培养 45h~48h。然后统计颜色为黑色，边缘带有浑浊带和透明圈的菌落数，可疑菌落还要进行血浆凝固酶实验进一步确定。

通过试验得到的金黄色葡萄球菌快速检测法的检测结果如下：

快速检测系统检测试验结果表

WKJ-II 型微生物快速检测仪的最低检测限理论上应该为 1 cfu/ml，但是在样品的处理过程中因增菌、稀释、浓缩及洗涤等操作会对菌体产生一定的影响，使菌体数产生损失。表中表明当样品中微生物的含量在 10cfu/ml（g）以下时利用快速检测法测得的金黄色葡萄球菌的检测值与快速检测系统前处理后的实际值之间的差异较大。因此，该快速检测法检测金黄色葡萄球菌的最低检出限为10cfu/ml（g）。同样从该表中也可以发现当金黄色葡萄球菌菌悬液原始浓度达到

108cfu/ml（g）时，快速检测法检测的菌数与快速检测法前处理后的实际值之间的差异较大，不能将菌全部检出，其原因为当菌液浓度过高时，滴在载玻片上的 2μL 菌液由于面积的限制会造成菌体的叠加，致使其在洗涤的过程中被冲洗掉而损失，同时在检测过程中有可能把叠加的菌体误认为成一个细菌，因此使检测结果比实际值低，准确性下降。因此，WKJ-II 型微生物快速检测仪检测金黄色葡萄球菌的检测范围为 10cfu/ml（g）~107cfu/ml（g）。

传统的检测方法已经越来越不能适应现代化大规模检测的需要，快速检测方法的研究势在必行。目前各种快速检测方法所依托的科技基础主要来自两个方面，一是免疫学方面的知识，主要采用免疫学中抗原抗体特异性反应和免疫学方法中高灵敏度等特性； 另一方面是来自分子生物学技术的发展，PCR是这一类快速检测方法的核心。快速检测技术实用性总体趋势是灵敏、快速、特异、操作简便，其发展趋势应该是多学科交叉和多项高新技术的整合。今后一项性能优越且具有竞争力的病原微生物快速检测技术可能要运用分子生物学、免疫学、电化学、生物信息学和计算机科学等多学科的原理及知识。如利用生物芯片技术和免疫学技术进行检测，利用生物传感技术对检测结果进行信号转换，利用计算机技术对检测结果进行分析比较，利用网络技术进行信息交流，这正是我们所期待的。

第5章 结论

金黄色葡萄球菌在引起人类细菌性食物中毒的致病菌中位居第二，已成为人们关心的重要食品卫生问题之一。由于其传统检测方法用时长，对食品这些快消品无法进行实时监控，因此，寻找一种快速检测方法就显得尤为必要。本文通过在金黄色葡萄球菌的快速检测中应用计算机视觉技术，同时结合金黄色葡萄球菌还原亚碲酸钾的特异性着色原理，对食品中金黄色葡萄球菌的快速检测进行了初步探究并取得了一定成果。将本实验室研究开发的微生物快速检测系统在应用于细菌总数、大肠菌群、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌检测的同时也可以应用于致病菌金黄色葡萄球菌的检测。若将该系统应用于食品和农产品的现场实时监测可以有效控制终产品微生物超标的情况，减少食品卫生安全事件的发生。

谢 辞

在老师的指导下，我终于顺利完成这篇论文，回首四年求学生涯，感触颇多，尤其是指导老师高尚的人格和渊博的知识对我产生了深刻的影响，写作毕业论文是一次再系统学习的过程，毕业论文的完成，同样也意味着新的学习生活的开始。

通过此次的论文，我学到了很多知识，跨越了传统方式下的教与学的体制束缚，在论文的写作过程中，通过查资料和搜集有关的文献，培养了自学能力和动手能力。并且由原先的被动的接受知识转换为主动的寻求知识，这可以说是学习方法上的一个很大的突破。在以往的传统的学习模式下，我们可能会记住很多的书本知识，但是通过毕业论文，我们学会了如何将学到的知识转化为自己的东西，学会了怎么更好的处理知识和实践相结合的问题。

在本论文的写作过程中，我的导师芮闯老师倾注了大量的心血，从选题到开题报告，从写作提纲，到一遍又一遍地指出每稿中的具体问题，严格把关，循循善诱，在此我表示衷心感谢。同时我还要感谢在我学习期间给我极大关心和支持的各位老师以及关心我的同学和朋友。

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葡萄球菌的快速检测方法研究

价格 ¥9.90 发布时间 2022年11月12日

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