miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p与非酒精性脂肪肝的相关性研究

摘要

目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)可加重代谢紊乱，增加相关并发症的发病风险。因此，早期发现NAFLD是避免并发症不良影响的关键。本研究旨在识别miRNAs，以早期诊断及治疗NAFLD。

方法：

1.动物实验：采用高脂饮食建立NAFLD大鼠模型。把实验大鼠的肝脏取出，作为本次实验的标本，检测肝组织甘油三酯含量，然后切取大鼠肝组织并使用HE染色和油红O染色观察其组织学改变。使用Quantitative Real-time PCR（qRT-PCR）手段，对大鼠肝脏组织中miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p的表达水平进行检测。

2.临床实验：在研究对象的选择上，选取生活习惯正常的健康人群和NAFLD患者进行对比，从河北省人民医院体检中心收集研究对象血清，用qRT-PCR方法检测研究对象血清中miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p的表达水平并进行比较。

结果:

动物实验

1.各组实验鼠的重量、鼠的肝脏湿重、实验鼠在未进食情况下的血糖数值、TG含量的比较

HFD组大鼠体重、肝湿重高于ND组（P<0.05）。TG含量在HFD组明显升高，且P值小于0.01。但两组实验组中的实验鼠未进食情况下的血糖值无明显差异，P值大于0.05。

2．肝脏组织病理学检测结果比较

HE染色：ND组肝组织健康情况良好，没有出现细胞发生炎症情况，也没有出现肝组织内脂肪发生病变。与之相比，HFD组肝脏情况就发生病变，病变肝细胞气球样变肿大且间质组织中，均匀一致的蛋白质蓄积物质呈现出没有结构、半透明的状态，肝小叶功能混乱，小叶内也有大量细胞出现炎症。油红O染色：ND组未见明显脂滴积累，HFD组可见大量脂滴积累。

3.各组大鼠肝脏miRNA的表达

与ND组比，HFD组肝脏中miR-182、miR-183-5P、miR-96-5P表达明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）；临床实验

1.基本数据的比较

获得了100名符合入选标准的参与者(50名男性，50名女性)的数据。收集以下指标进行比较：身体体脂指数，也就是常见的BMI指数；白蛋白，也被称为ALB指标；血压，就是BP值；免疫球蛋白，也就是GLB值；空腹血糖，即FBG值；尿酸，又称UA值；总蛋白，即TP值；总胆固醇，又名TCHO值；(RCOO)3C3H5(Triglyceride，TG)；a1脂蛋白，也就是HDL-C值；低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）[1]。通过和健康组进行对照比较，可以发现非酒精性脂肪性肝病患者的BMI（P<0.05）、DBP（P<0.05）较高，NAFLD患者的血清中AST（P<0.05）、ALT（P<0.01）、TG（P<0.01）、LDL（P<0.05）、UA（P<0.01）显著升高，HDL（P<0.01）显著降低。

2.血清microRNA测定结果

与正常组（Normal)相比，mir -182在非酒精性脂肪肝患者(NAFLD)的表达明显下降和减少,取得的差异值具有重要意义（P<5%）。与Normal组相比，miR-183-5P在NAFLD组表达明显减少，取得的差异值具有重要意义（P<5%）。与Normal组相比，miR-96-5P在NAFLD组表达明显减少，取得的差异值具有重要意义（P<5%）。

结论:

1.高脂饮食可以诱导大鼠肝脏脂肪变性。

2.miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p在脂肪肝组的大鼠肝脏中表达显著降低。

3.miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p在NAFLD患者的血清中表达显著降低，血清中miR-182、miR-183-5p、miR-96-5p可能成为筛查NAFLD新的标志物及潜在的治疗靶点。

关键词：非酒精性脂肪肝；miR-182；miR-183-5p；miR-96-5p

英文缩写

前言

NAFLD是世界范围内的一种常见的肝脏的疾病。NAFLD是由肝脏脂肪过度堆积引起的，没有其他明显的慢性肝病病因(如病毒性肝脏疾病或自体免疫性疾病)。在过去的二十年里，NAFLD的全球患病率从20%上升到30%[1, 2]。NAFLD可以引起多种疾病，包括肥胖症、胰岛素抵抗及高脂血症的发生几乎都与其相关，甚至还会引发更为严重的心血管疾病。2型糖尿病及肝脏相关并发症的风险[3]。经人们研究发现环境及遗传性相关因素共同决定了NAFLD的表现型并会对NAFLD的发展过程有所影响 ，NAFLD会引起DNA组蛋白等的复杂变化。表观遗传学可以解释基因和外部影响之间的一些关系，有助于非侵入性生物标志物的发展[4-6]。

MicroRNA (miRNA)是分子构成较小的RNA，这种RNA的核苷酸有按照特定的排列顺序，它的特性是内源性并且非编码，这种特性对于后续蛋白质的合成有一定的辅助作用。超过30%的人类信使RNA (mRNA)受到miRNA的调控，细胞程序性死亡、细胞的分化、增殖和代谢等过程都与这类mRNA有着密不可分的联系[7, 8]。经实验显示特定组织的miRNA可以在血浆、血清、唾液、尿液、母乳和眼泪等多种体液中检测到[9-11]。循环mirna可能受到外泌体、微泡和凋亡小泡的保护，并对RNase活性、极端pH值和温度都具有抗性，因此它在循环中是稳定的[10, 12]。许多研究都探讨了血清/血浆miRNA作为NAFLD生物标志物的作用[13-15]。早有研究报道了在日本中年NAFLD患者中血清miR-21、miR-34a、miR-122和miR-451含量提高，并且无论是男性还是女性NAFLD患者，血清miR-122水平随着肝脏脂肪变性的加重而升高[15]。

非酒精性脂肪肝患者大多无症状，多数是在做常规影像学检查时发现该疾病。一种潜在的检测方法是检测血清中与NAFLD发病机制相关的miRNA水平。候选miRNA包括miR-182、miR-183-5P和miR-96-5P，这些miRNA这些miRNA被证实与胰岛素抵抗及脂代谢相关[2, 16, 17]，所以miR-182、miR-183-5P和miR-96-5P可能在NAFLD发病机制中发挥关键作用。

本课题首先通过高脂饮食喂养Wistar大鼠构建NAFLD模型，观察大鼠肝脏组织中miR-182、miR-183-5P和miR-96-5P与NAFLD的相关性；随后，我们进行了临床实验，我们研究了相同年龄段人群血清中miR-182、miR-183-5P和miR-96-5P的表达是否与NAFLD相关，以评估血清中miR-182、miR-183-5P和miR-96-5P的表达对肝脏代谢异常的意义。从而为人们揭开NAFLD部分的发病机制的神秘面纱，也提供经过实验的可靠的治疗方法，对于临床上发现治疗这个疾病的新方的可以也有一定的参考价值。

材料和方法

1材料

1.1实验动物

选取年龄为一个半月左右的的清洁级雄性Wistar大鼠，实验大鼠的是通过北京维通利华实验动物技术有限公司采购，原本在河北省进行养殖。实验室环境：屋内温度恒定（20摄氏度或25摄氏度），相对湿度为百分之四十到百分之六十，半天12个小时变化一次光亮条件。实验室内动物可以任意喝水。所有饲养过程均通过有关组织批准，并且严格遵照河北省实验动物管理条例开展。

1.2研究对象

所有进行实验的血清样本均来自在河北省人民医院体检中心参与体检的人。且所有参与者皆知情并且签署了文件表示同意自身血清参与该实验，实验者不能患有其他全身性炎性疾病，如急性呼吸道感染、由病毒引起的肝部发炎、由于自身免疫差而引发的肝炎、由于过度饮酒引起的肝炎或癌症。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者的诊断依据来自肝病学分会的《非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）诊疗指南（2010年修订版）》[18]，且本研究获得了国家相关部门的准许。

1.3主要仪器

1.4主要药品、试剂

2.方法

1动物实验

1.1动物模型的建立及分组

研究使用7周龄雄性Wistar大鼠16只，重量处于180克至200克之间，大鼠购买于维通利华有限公司（北京），且在河北省动物中心饲养。在实验进行前，大鼠可以随机进食标准食物和水一周。将大鼠随机分为2组:对照组8只（NC），热量的配比：蛋白质百分之二十，碳水化合物百分之七十，脂肪百分之十，总热量为3.85 kcal/g，脂肪肝组8只（HFD），食物配方：蛋白质占全部的1/5，碳水化合物占2/5，脂肪占2/5，且热量总量为 4.49 kcal/g。饲料来自博奥派克公司（北京生物技术公司）。各组大鼠对于饮水量不做控制，需实验员每日记录大鼠摄取食物的量，并且严格监控大鼠每周重量变化并记录。

1.2.1血清标本采集

实验大鼠在夜间不可以进食，然后称实验鼠重量，然后在空腹情况下，对大鼠进行麻醉，麻醉药剂为1%戊巴比妥钠 60 mg/kg，待麻醉成功之后，从实验鼠腹部主动脉吸取一定的血量，保持4℃低温3000转离心20min，收集血清，-80℃保存备用。

1.2.1肝脏组织标本采集

成功取血之后需要立刻将肝脏部分取出，称取其重量。将刚刚拿出的完整肝脏随即切割，分为数块，然后立刻浸入液氮中，之后把其放置在低温冰箱（-80℃）中进行保存，以备之后实验标本的需要。将从中切分出的部分肝组织放入百分之十浓度的甲醛液(PH=7.4)中进行固定，并且进行HE染色。再将部分肝脏组织放进OCT（optimum cutting temperature compound）中，于低温冰箱(零下八十摄氏度)中进行保存，冰冻后制成切片染色（试剂：油红O）。

1.3肝脏组织HE染色

1.切片脱腊

5、显微镜镜检，图像采集分析。

1.4肝脏组织油红O染色

1、固定冰冻切片：冰冻切片在室温中进行恢复，并使其干燥，余固定液中放置15分钟，随即使用自来水进行清洗，自然干燥。

2、油红O脂肪染色法：在避光条件下，把切片浸入油红染液浸染八到十分钟，使用蒸馏水进行清洗；

3、背景分化：75%酒精稍分化，蒸馏水洗。

4、苏木素-伊红染色（HE染色）：苏木素染液染中放置切片三到五分钟→自来水进行清洗→使用分化液→自来水进行清洗→放入返蓝液中→使用流水进行冲洗。

5、封片：甘油明胶封片剂封片。

6、显微镜镜检，图像采集分析。[]

1.5肝脏甘油三酯含量测定

2）具体操作方法：①精确称取肝组织：检测的原理如下，使用脂肪酶降解甘油三酯（血清中）为甘油→甘油激酶磷酸使甘油变成3-磷酸甘油→磷酸-甘油脂氧化酶将3-磷酸甘油氧化后产生H2O2→H2O2酶变底物为为苯醌亚胺（甘油浓度升高，光密度值也随之升高）。

称量0.05g的组织，放置裂解液一毫升，作用于肝脏组织匀浆裂解与肝脏中脂肪的抽取。用高速匀浆器是组织碎裂。将组织完全破碎后，静置十分钟。②向1.5毫升的离心管中加入一定量的上清液，完成后续步骤。其他尚未使用的匀浆，用于进行蛋白定量（BCA法蛋白定量试剂盒）。③使用70℃偏高温加热10 min，不宜使组织量较多，否则可能产生絮状沉淀。④室温环境下2000 转离心5 min，得到上层清液即为酶学测定的标准液体。⑤以4:1的比例配置溶液作为工作液，取4mlR1与1 mlR2混合后，必须现配现用，或在4℃的冰箱保存，且保存时间不宜多于24小时，如果变色则需要弃除重新配置。⑥稀释标准品：使用蒸馏水倍比稀释4 mM甘油标准品为8个梯度，从1000开始至7.8125 μmol/L，通常我们只选用取其中1/2~2/3用于实验，设置对照组。⑦加样：可分为空白管、标准样品和样品，三种均分别加入190μL的工作液，再分别加10μL的蒸馏水、标准品和样品。如果样品不适宜在线形图中进行观测，可以适当稀释样品，使之更适于线形图，最后再将稀释倍数加入到计算中去。⑧在适宜的温度下（37℃或25℃）反应10 min。待反应达到平衡后，样品颜色颜色将在60 min内保持不变。⑨以550 nm波长的酶标仪检测上述溶液，接下来使用加蒸馏水的空白管进行调零处理，并且准确检测各管光的密度值。⑩依据曲线计算甘油三酯的浓度并绘出标准的曲线。使用BCA法来测定蛋白浓度, 每mg蛋白浓度都需要校正甘油三酯（TG）的含量。[]

1.5肝脏组织miR-182、miR-183-5p、miR-96-5p表达的测定

采用实时荧光定 PCR(RT-qPCR)测定miRNA的表达。

miR-182正向引物:5’-UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACCG-3’;

miR-183-5p正向引物:5’-UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU-3’;

miR-96-5p正向引物:5’-UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU-3’。

1.5.1肝脏组织 miRNA 的提取

借鉴天根生化科技有限公司（北京）的提取分离miRcute miRNA试剂盒方法，操作步骤如下：

1）从零下八十摄氏度的冰箱中拿出冰冻的肝脏组织，分割出20 mg左右的肝脏组织，将其放入1.5 毫升离心管（去除RNA酶）中，加入1 mLMZ溶液，使用匀浆器（电动）快速将组织打碎变为匀浆。

2）在室温条件下放置匀浆5分钟，直到核酸蛋白复合物已经完全分离，使之转化的核酸、蛋白质单独存在。

3）4℃ 条件下高速12000转离心5 min，提取上清液，放入一个新的离心管中。

4）放入200 μL Methyl trichloride（三氯甲烷），再强烈震荡15 sec，在室温条件下放置5分钟，

5）四摄氏度下，以一万两千转的速度再离心15 分钟，直到样品已经分为3层，分别是水相，有机相和中间层，其中水层是无色的，而有机层显黄色。因为聚集于在水相中的RNA（核糖核酸），转移其到新管中，用以进行后续操作。

6）称取适量转移液→缓缓向其中加入体积为转移液0.43倍的无水乙醇→均匀混合→将沉淀和溶液分两次移入miRspin向吸附柱中→离心→去除miRspin向吸附柱→得到流出液。

7）称得一定体积的流出液→缓缓向其中加入体积为转移液0.75倍的C₂H₆O→进行均匀的混合→沉淀和溶液→将它们转到向吸附柱miRelute中→室温条件下以一万两千转的素的进行一分钟的离心1→去除流出液，获取吸附柱miRelute。

8）将五百微升的去蛋白液MRD放入向吸附柱miRelute，进行两分钟的室温静置，高速离心机室温12000转离心1 min，去除其流出液。

9）将五百微升的漂洗液RW放入向吸附柱miRelute，进行两分钟的室温静置，高速离心机室温12000转离心1min，去除其流出液。

10) 重复操作步骤9。

11）转移吸附柱miRelute至两毫升收集管中，室温12000 转离心1min，丢弃残留和剩余的液体。

12）转移吸附柱miRelute至全新的 RNase-Free 1.5毫升的离心管中，放入十五微升RNase-Free ddH2O，进行两分钟的室温静置，离心机12000 转离心1 min。[]

miR-182、miR-183-5p、miR-96-5P及U6的引物购自于北京天根生化科技有限公司。

1.5.2 miRNA的逆转录反应

借鉴天根生化科技有限公司（北京）增强型miRcute 第一链合成miRNA cDNA试剂盒的操作，反应体系如下：

反应条件：42℃，60min，95℃，3 min，－20℃冰箱保存。

1.5.3 miRNA的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

PCR反应体系：

反应条件：

按以上箭头方向需进行40个循环。

1.5.4结果分析

待扩增完成，操作流程为：点击荧光定量PCR仪（ABI 7500型）软件分析结果的页面→设定内参照基因为U6→设定三至五个循环的基线→获取来自每份样本和基因的Ct扩增值→设定标准1为对照组样品→根据RQ=2-△△Ct公式计算，可以获得不同样本中，每种目的基因表达水平的相对定量值，即RQ值，进而将用RQ值做统计分析。

　　2 临床实验

　　2.1研究对象基本信息采集

研究纳入2019年于河北省人民医院参加体检的50例健康人群及50例NAFLD患者为研究对象，符合非酒精性脂肪性肝病的诊断标准。对参与者的基础信息进行统计，包括但不限于性别、年纪、身体健康情况、有无饮酒和吸烟的习惯、有无家族遗传性病史以及自身的病历。

　　2.2NAFLD 的诊断标准

NAFLD（非酒精性脂肪性肝病）的临床诊断标准:①不能患有可以导致脂肪肝的疾病。②从不饮酒或者饮酒量较少，女性乙醇量小于七十克每周，男性乙醇量小于一百四十克每周。③确诊为脂肪性肝病。由于肝活检进行比较困难难，故将NAFLD（非酒精性脂肪性肝病）定义为以下几个方面:①无其他影响后，经过影像学的鉴定是脂肪肝②患有代谢综合征的参与者可能会持续性出现的谷丙转氨酶和(或)谷草转氨酶、y-GT的升高，时间超过半年。当进行减肥，并通过治疗，胰岛素抵抗有所改善后，通过影像学鉴定，确定脂肪肝也有所好转，甚至达到正常水平，就可以确诊是非酒精性脂肪性肝病。

NAFLD超声诊断:至少具备以下两项:①肝脏的远场回声呈不断降低趋势②肝内管道成像模糊③具有“明亮肝”特性，即肾脏回声低于肝。

　　2.3排除标准

排除病毒/药物/自身免疫性肝病肝病；既往饮酒史：男性≥140g/周，女性>70g/周；妊娠；肾功能不全；严重的炎症性疾病。2.2标本采集

收集每个参与者的空腹静脉血五毫升,以三千转每分钟的速度，进行十分钟的离心，将适量血清放入无RNase/DNase Ep管内，零下八十摄氏度进行保存。其余的血清则用作检测其他不同的生化指标。

　　2.3血液生化

取所有患者空腹血清用生化分析检测仪检测尿酸（UA)、丙氨酸氨基转移酶（ALT)、检测空腹血糖，又称FPG值、三酰基甘油，又称TG值、总胆固醇，又称TC值、高密度脂蛋白胆固醇，又称HDL-C值、低密度脂蛋白胆固醇，又称LDL-C值、白蛋白，也被成为ALB值。

　　2.4血清中miR-182、miR-183-5p、miR-96-5p表达的测定

采用实时荧光定 PCR(RT-qPCR)测定miRNA的表达。

2.4.1血清miRNA 的提取

借鉴天根生化科技有限公司（北京）的提取分离miRcute miRNA试剂盒，操作步骤如下：

1.放二百微升的MZ溶液裂解复合物于等体积的血清、血浆或者全血中，振荡30sec。

2.经过五分钟的室温静置，使得其充分分离为核酸、蛋白质而独立存在。

3.室温条件下高速离心机12,000转的速度，进行10 min的离心，获取上清液后，将其放置于新离心管内。

4.加入200μl四氯甲烷，避光保存，进行剧烈振荡15sec之后，再进行五分钟的室温静置。

5.高速离心机在室温条件下以一万两千转的速度，进行十五分钟的离心，样品会分成水层，中间层和有机层三层，其中水层呈无色，而有机层呈黄色。由于RNA（核糖核酸）主要存在于水相中，所以要把转移水相至新管中，进行后续操作。

6.称量转移液的体积→缓缓向其中加入转移液体积1/3体积的C₂H₆O均匀混合（沉淀可能会在这时出现）→转移得到的沉淀和溶液到miRspin吸附柱中→在室温中放置两分钟→在室温条件下以 12,000 rpm的速度，进行离心30 sec→吸附柱miRspin被去除，得到流出液。

7.称量流出液的体积，缓缓向其中加入流出液体积2/3体积的C₂H₆O→均匀混合（沉淀可能会在这时出现）→转移得到的沉淀和溶液到miRspin吸附柱中→在室温中放置两分钟→在室温条件下以 12,000 rpm的速度，进行离心30 sec→流出液被去除，得到吸附柱miRelute。

8．加入五百微升的去蛋白液MRD（注意查看是否已加入C₂H₆O）刀miRelute吸附柱中→在室温条件下放置两分钟→在室温条件下以 12,000 rpm的速度(~13,400×g)离心30 sec→此时得到弃废液。

9.向miRelute吸附柱中加入五百微升漂洗液RW（注意查看是否已加入C₂H₆O）→在室温条件下放置两分钟→在室温条件下以 12,000 rpm的速度(~13,400×g)离心30 sec→此时得到弃废液。

10. 重复操作步骤9。

11. 在两毫升的收集管中加入miRelute吸附柱→在室温条件下以 12,000 rpm的速度(~13,400×g)进行一分钟离心→去除残留的其他液体。

12. 转移miRelute吸附柱到新RNase-Free 1.5毫升离心管中→向其中放入十五到三十微升的 RNase-Free ddH2O→在室温条件下放置两分钟→在室温条件下以 12,000 rpm的速度(~13,400×g)进行两分钟离心。[]

2.4.2血清miRNA 的逆转录反应

借鉴来源于天根生化科技有限公司（北京）的第一链合成miRNA cDNA试剂盒和增强型miRcute的系列操作，反应体系如下：

Total RNA 2μL

2×miRNA RT Reaction Buffer 10μL

miRNA RT Enzyme Mix 2μL

RNase-Free ddH2O 6uL

总体积 20μL

反应条件：42℃，60min，95℃，3 min，－20℃冰箱保存。

2.4.3 miRNA的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

PCR反应体系：

2×miRcute Plus miRNA Premix (with SYBR&ROX) 10 μL

Forward Primer 0.4 uL

Reverse Primer (10 µM) 0.4 μL

miRNA第一链cDNA 1 μL

RNase-Free ddH2O 8.8 uL

总体积 20 μL

反应条件：

按以上箭头方向进行40个循环。

2.4.5结果分析

完成扩增后，按照以下步骤进一步操作：进入实时荧光定量PCR仪（ABI 7500型）软件的系统分析界面→设定内参照基因为U6→基线设置为三到五个循环→获取来自每份样本和基因的Ct扩增值→设置对照组样品为标准1→按照RQ=2-△△Ct公式得到各目的基因在各样本中表达水平的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。

　　2.5统计分析

使用SPSS23.0软件进行数据分析。并且使用均数±标准差(`x±S)来代表符合或拟合正态分布曲线的计量资料，而四分位数则代表着不符合正态分布的计量资料。如果两样本的均数方差齐并且正态就可以使用t检验，如果均数方差不齐或者不是正态分布的就需要通过秩和检验，也就是非参数检验的方式进行；用Graphpade prism5软件绘制数据图。具有统计学意义的数据需要统一将P＜5%作为差异[]。

结果

1动物实验

1.1各组大鼠重量、肝脏湿重、空腹血糖、TG含量的比较

HFD组大鼠体重(Fig.A)、肝湿重高于ND组(Fig.B)（P<0.05）。TG含量(Fig.D)在HFD组明显升高（P<0.01）。空腹血糖(Fig.C)在两组间无明显差异（P＞0.05）。

1.2肝脏组织病理学检测结果比较

HE染色：ND组肝组织健康情况良好，没有出现细胞发生炎症情况，也没有出现肝组织内脂肪发生病变。与之相比，HFD组肝脏情况就发生病变，病变肝细胞气球样变肿大且间质组织中，均匀一致的蛋白质蓄积物质呈现出没有结构、半透明的状态，肝小叶功能混乱，小叶内也有大量细胞出现炎症。油红O染色：ND组未见明显脂滴，HFD组有大量脂滴（Fig.2）。

1.3各组大鼠肝脏miRNA的表达

与ND组比，HFD组肝脏中miR-182、miR-183-5P、miR-96-5P表达明显减少，P<1%，差异有统计学意义（Fig.3）。

2临床实验

2.1 基本数据比较结果

获得了100名符合入选标准的参与者(50名男性，50名女性)的数据。与健康对照组相比，NAFLD患者的BMI（P<0.05）、DBP（P<0.05）较高，NAFLD患者的血清中AST（P<0.05）、ALT（P<0.01）、TG（P<1%）、LDL（P<5%）、UA（P<1%）明显增高，HDL明显下降。TP、Alb、TC、SBP在两组中没有显著差异（P>0.05）(Table 1)。

2.2 血清microRNA测定结果

与正常组（Normal)相比，mir -182在非酒精性脂肪肝患者(NAFLD)的表达明显下降和减少,取得的差异值具有重要意义（P<5%）。与Normal组相比，miR-183-5P在NAFLD组表达明显减少，取得的差异值具有重要意义（P<5%）。与Normal组相比，miR-96-5P在NAFLD组表达明显减少，取得的差异值具有重要意义（P<5%）。

讨论

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是发达国家最常见的慢性肝病。它的造成可能有多种因素构成，其中遗传和生活方式的影响十分重要，超重、糖尿病、血糖升高、高脂血症和胰岛素抵抗(IR)已经被业界内认为是NAFLD的确认危险因素，肝脏胰岛素抵抗被认为是NAFLD的核心组成部分[19, 20]。NAFLD最终会导致严重的慢性肝病并增加心血管疾病发生的风险。大多数人长期无症状，并且他们的日常生活不受影响，医生难以分辨和预防患者经长时间的非干预发展，进而导致了肝硬化（liver cirrhosis）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）最终向肝细胞癌（HCC）进行转变[13, 21]。在过去的十年中，人们对非侵入性NAFLD评估的新方法越来越感兴趣。这些技术是依靠于两种方法共同实现：一种是测量血清生物标志物的水平，而另一种则是成像技术，这就包含MRI、传统超声、CT以及基于超声弹性成像而进行的，对于肝脏硬度的测量[22]。Bedogni等人在2006年首次提出脂肪肝指数(Fatty Liver Index, FLI)。近几年，人们从芬兰人群中评估出了NAFLD肝脏脂肪评分[23]。该评分纳入了一些简单的变量，如代谢综合征和T2DM是否存在、空腹血清胰岛素、AST水平和AST/ALT的值。这些评估方法各有优缺点，然而，它们的一个共同特征是由已知的血清生物标志物组成。

miRNAs是一种很好的生物标志物，因为它们具有明确的定义、化学上的均一性、局限于可管理的物种数量以及在细胞和循环中稳定存在[24]。miRNAs在许多肝脏疾病中有诊断意义，然而，目前较多是关于肝脏肿瘤方面的研究[25-27]。Zhang等[28]研究发现HCC患者的血浆中hsa-miR-139-3p的相对表达水平明显降低，而hsa-miR-7-5p和hsa-miR-760的表达明显升高。此研究发现这三个miRNA可以作为评估HCC患者预后的指标。还有研究发现miR-224在早期肝癌中具有显著的诊断效率，miR-224和miR-125b在预后诊断中具有重要价值[29]。

MiR-182与miR-183和miR-96都属于多顺反子miRNA簇，位于小鼠6q染色体上的4千碱基的区域内。人类的同源区域位于染色体7q32.2上，这三个家族成员的定位顺序与小鼠基因组中的顺序相同。这些miRNA共享相似的种子序列(miR-96和miR-182相同)[30]。但是，这些miRNA似乎通过靶向不同的下游基因而具有不同的功能[31]。既往研究证实miR-182、肿瘤的产生，被miR-183-5P和miR-96-5p通过多种途径方式干预。根据研究表明可能miR-182在肝癌的发生发展中极为重要，根据以往研究证明miR-182在肝癌中高表达[32], 在肝癌Hep3B细胞发育、进攻正常细胞的过程中发挥着重要的促进作用[33]。Hu等人[34]研究发现miR-182可能通过直接和负调控PDCD4的表达而在肝癌细胞中发挥致癌作用。Zheng等人[35]经过实验发现，外泌体miR-182可以抑制RECK的水平，进而可以对胆囊癌细胞产生影响，促使其转移。所以，miR-182可用作胆囊癌的治疗靶标。Li等研究发现[36]miR-182的表达通路是，通过阻碍APC基因的表达，来激活Wnt信号,进而促进宫颈癌细胞生长。根据已有研究显示，miR-183在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等18种肿瘤中上调，在骨肉瘤、黑色素瘤等6种肿瘤中下调。在这些癌症病例中，miR-183上调时发挥致癌基因的作用，而在下调时则发挥辅助基因的作用。但在肝细胞癌(HCC)、子宫内膜癌等7种癌症中，有研究报道miR-183在组织或细胞系中上调，也有研究报道miR-183在组织或细胞系中下调，miR-183在促进或抑制这些癌症中发挥双重作用[37]。Li等[38]在HCC中发现，在分析的25个样本中，与匹配的非肿瘤肝组织相比，有17个样本中miR-183显著上调(2倍至367倍)。miR-96-5p被证实通过靶向调节ZDHHC5在胃癌中增强细胞增殖和侵袭[39]，还有研究发现miRNA-96-5p可能通过负调控抑癌基因FOXO3和促进细胞增殖而发挥促进肿瘤的作用[40]。虽然miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p已被发现为某些癌症的致癌基因，但是目前其与NAFLD的相关性的研究较少。而我们的研究显示，miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p可能是诊断NAFLD的潜在标志物。

本研究以高脂喂养的大鼠成功建立了NAFLD模型，发现高脂干预导致了大鼠肝脏的脂质沉积（直观表现为HE染色的脂滴空泡和/或油红O染色的红染），且肝组织甘油三酯含量增加。在本研究中我们还发现miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p在NAFLD模型的大鼠肝脏中明显降低。

已有动物实验表明，miR-182在NAFLD大鼠肝脏组织中表达明显降低，这与本实验研究结果一致。这项研究还表明miR-182在老年NAFLD大鼠肝脏组织中表达明显降低可能与胰岛素分泌相关，这可能是诊断和治疗衰老相关NAFLD的新的靶点[2]。更有研究表明含有7、E3泛素蛋白连接酶(FBXW7)的叉头盒O3和F-box WD重复域可作为miR-182的潜在靶点，并发现在纤维化样品中叉头盒O3的水平显著降低，而FBXW7没有降低，这一发现支持了miR-182在NAFLD相关纤维化的发病机制中的作用，这对肝纤维化和肝硬化的启动和进展的分子机制提供了新的见解[41]。Tessitore等人[42]证明，在NAFLD-非酒精性脂肪性肝炎-肝细胞癌（HCC）转移期间，肝组织和肿瘤中有15种miRNA被调节，miR-182参与早期肝损伤的转移，并影响HCC的发展，这项研究表明miR-182的早期失控可能与肝病的进展有关。也有研究表明，在NAFLD进展过程中，miR-182过表达可能参与了NAFLD的发生[43]。董美娟等人[44]研究发现miR-182与脂代谢相关。miR-182的表达水平在白脂肪形成过程中显著下调，在肥胖大鼠和人类的内脏脂肪组织中显著降低。miR-182在3T3-L1细胞和人脂肪细胞中的异位表达抑制了脂滴的形成和成脂基因的表达。荧光素酶报告基因结果显示，miR-182直接靶向CCAAT/增强剂结合蛋白(C/EBP – a)的3′-未翻译序列。研究结果表明miR-182是脂肪形成的新型负调节剂，并且是肥胖症的潜在治疗靶标。

已有动物实验表明，miR-183-5P在NAFLD大鼠肝脏组织中表达明显降低,这与本实验研究结果一致[2]。肥胖被认为是许多代谢异常（尤其是非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD））的危险因素，有研究发现肥胖小鼠肝脏和棕榈酸（PA）诱导的细胞模型中miR-183-5p的表达均增加。在PA诱导的细胞模型和肥胖小鼠中miR-183-5p的过表达导致肝甘油三酸酯（TG）积累和脂肪生成基因的上调，而在细胞模型中对miR-183-5p的抑制则改善了TG的积累。此项研究还使用萤光素酶报告基因测定法来确定Btg1是miR-183-5p的直接靶标。因此miR-183-5p影响了肝TG稳态的调节，这为肝脂肪变性提供了潜在的治疗靶点。既往已有研究证实miR-183与脂代谢相关[45]。Zhao等[46]研究发现miR-183的过表达增强了脂质的积累，并显着增加了脂肪形成基因PPARγ，C /EBPα，SREBP-1c，FAS和ACC的mRNA表达，且miR-183可以促进脂肪细胞分化，通过Smad4。另有实验发现miR-183的增强前脂肪细胞分化的路径为，通过靶向LRP6抑制Wnt /β-连环蛋白的表达，进而增强了3T3-L1前脂肪细胞分化和脂肪形成[47]。miR-183还被证实与胰岛素抵抗相关。Motiño等研究发现COX-2通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/p300信号通路增加死盒解旋酶p68 (DDX5)的水平，并通过与DDX5的物理关联调节Drosha (RNase型III)复合物的酶促功能，从而抑制miR-183在肝细胞中的表达。miR-183表达的减少通过增加胰岛素受体底物1（IRS1）水平改善对胰岛素抗[48]。

一项研究表明miR-96-5p能够通过靶向p66shc mRNA 3’UTR来抑制p66shc /细胞色素C级联，而catalpol可能通过上调miR-96-5p水平来抑制NAFLD，因此，miR-96-5p / p66shc /细胞色素C级联可能是NAFLD潜在的治疗靶点[49]。miR-96还被证实与胰岛素抵抗相关。Jeong等在具有线粒体功能障碍的SK-Hep1细胞中发现了被预测为靶向IRS-1 3’UTR的miR-96的显着上调。此外通过报告基因分析证实了miR-96确实靶向IRS-1 3’UTR。此外，miR-96的异位表达导致IRS-1蛋白表达显着下降，并因此导致胰岛素信号传导受损。这些发现表明，线粒体功能障碍引起的miR-96上调通过靶向SK-Hep1细胞中的IRS-1促进了胰岛素抵抗的发展[17]。食用含饱和脂肪酸（SFA）较多的饮食会使得人们更加肥胖和并且也会引起肝脏脂肪变性，从而使人们患上肝胰岛素抵抗的可能加大。Yang等[50]研究发现用棕榈酸盐处理的肝细胞中miR-96的表达水平显著升高，并且miR-96可以直接调控INSR和IRS-1的3’UTR，并且在蛋白质表达水平抑制INSR和IRS-1。因此miR-96被SFA上调并抑制参与胰岛素信号传导中间体，导致肝细胞中的胰岛素抵抗。

我们进一步研究了miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p在NAFLD患者中的变化。经研究发现NAFLD患者的BMI、DBP比起健康人群来说明显升高，且患者血清中的AST、ALT、TG、LDL、UA显著升高，这与既往研究相同[15, 51, 52], 有研究表明UA可以作为一种简单无创、便宜且有效的标记物来预测NAFLD患者的肝脏脂肪变性[52]。另外我们还发现3个循环miRNA水平与NAFLD相关，其中包括miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p。虽然其他一些研究已经对血清miRNA进行了研究，但是对人类血清miRNA的流行病学研究还很少。目前已有部分研究表明血清miRNA和NAFLD相关。关于NAFLD研究最多的miRNA是miR-122，它可以称得上是脂肪肝中最多的miRNA，它通过直接或间接的途径调节了胆固醇和脂肪酸的代谢水平[53, 54]。miR-122的低表达可能导致参与NASH发病的脂质代谢改变[55]。从实验研究的最终数据可以看到，非酒精性脂肪性肝病患者血清的miR-122、miR-34a、miR-21、miR -451含量有明显增长，分析可知miR-122在血清当中的含量与肝脏发生脂肪变性的进程息息相关[15]。在Cermelli等人的一项研究中，发现NAFLD患者循环miRNAs水平升高，如miR-34a和miR-122[56]。Hendy等[13]研究发现，与对照组相比，NAFLD患者血清中的miRNA-122和miR-34a水平均升高mi-RNA-122区分NAFLD患者和健康人群的敏感性为92％，特异性为85％，NAFLD患者血清中的mi-RNA-99a显着降低，miRNA-99a区分SS（单纯脂肪变性）和NASH（非酒精性脂肪性肝炎）的敏感性为94％，特异性为96％。研究表明miRNA可诊断NAFLD病例并区分SS和NASH。Okamoto等人[57]经过实验发现与身体健康正常的人群（对照组）相比，NAFLD患者的血清miR-379含量显著较高，用它来作为NAFLD生物标志物是十分具有发展空间的。miR-379可能通过干扰与IGF-1信号通路相关的靶基因，增加了胆固醇的脂毒性，导致了NAFLD的发生和发展，此研究促进对NAFLD的发病机制，诊断和治疗的进一步研究。Ando等[51]发现miR-20a和miR-27a在NAFLD患者的血清中显着降低，Logistic回归分析显示低循环miR-​​20a和27a水平与严重NAFLD之间存在显着关系，所以若NAFLD变得严重其中有一定参考价值的诊断因素为循环miR-​​20a和miR-27a。

本研究的创新之处在于我们发现高脂喂养大鼠肝脏中miR-96-5p的表达显著降低。此外，我们还发现在NAFLD患者血清中miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p水平下降。目前未发现循环miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p与NAFLD的相关性，尚不清楚它们如何影响NAFLD的脂质稳态，以及它们如何诱导或加重NAFLD的发生。从功能的角度，可能需要进行一些专门的研究来阐明这些miRNAs如何影响脂肪肝的发病机理。此项研究的另一个影响实验准确性的因素就是样本容量较小，若要取得可靠的结论应该扩大样本量，再进行试验来证实实验结果。我们仍需进一步研究这些候选miRNA如何调控NAFLD的发生发展，为如何调控NAFLD的脂质代谢提供生物学依据，从而早期预防、诊断和治疗NAFLD。

总而言之，本研究发现miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p在NAFLD组的大鼠肝脏中及NAFLD患者的血清中表达降低，它们可能成为筛查NAFLD新的标志物。

结论

1.高脂饮食可以诱导小鼠肝脏脂肪变性。

2.miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p在脂肪肝组的大鼠肝脏中表达显著降低。

3.miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p在NAFLD患者的血清中表达显著降低，血清中miR-182、miR-183-5P、miR-96-5p可能成为筛查NAFLD新的标志物及潜在的治疗靶点

miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p与非酒精性脂肪肝的相关性研究

价格 ¥9.90 发布时间 2022年11月26日

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