HPLC法测定饮片蒲公英中咖啡酸的含量及鉴别

　　中医中药在我国有着十分悠久的历史，上古时神农氏尝百草，为后世开辟了中医药先河，其在中华民族的休养生息和生命安康两方面做出了巨大贡献，在传统医药中也占据不可或缺的位置，在我国医疗保健事业的发展中起着极其重要的作用。在发展速度之快、回归自然的今天，中药材更以特别的方式，以成效好、反作用小、治疗难以解决病症等诸多优点备受瞩目。中药的质量直接关乎人们的生命健康，近几年随着我国的中药产业不断发展，药品生产监督变得格外重要，通过检查发现企业对中药材质量控制存在一些问题，甚至存在误区，使得中药质量难以控制，而质量控制对中药来说又拥有特别的意义，因此将中药质量检测放在首位，保证药品质量，为人们生命健康保驾护航。

　　本课题所研究的中药材蒲公英为菊科蒲公英属多年生草本植物的干燥全草，味苦、甘、性寒。归肝、胃经。具清热解毒，消肿散结，利尿通淋的功效[1]。随着科学技术的不断发展，对药理学的探究逐步加深，在研究中药蒲公英方面，其生物活性成分所具有多种药理作用也不断被证实。蒲公英中含有咖啡酸、绿原酸、阿魏酸等多种化学成分，其中咖啡酸是蒲公英的一种重要成分。近年来通过对蒲公英中咖啡酸的不断探究，为蒲公英的开发利用奠定了基础。

　　中药企业饮片蒲公英的检测是根据2015版《中国药典》一部，通过薄层色谱法鉴别咖啡酸的存在，通过高效液相色谱法检测咖啡酸的含量，对蒲公英进行定性和定量的研究，从而保证中药饮片蒲公英的质量，为人类用药安全提供保障。

　　1.1.1研究药材

　　蒲公英是菊科多年生草本植物，种类繁多，分布较为广泛，遍及全国多数省区，是我国常见的野生蔬菜和中草药[2]。《中国药典》中收载的不同种类的蒲公英是呈皱缩卷曲团块的干燥全草。根呈圆锥状，多弯曲；表面棕褐色，抽皱；叶呈波状齿或羽状深裂，为绿褐色。花冠黄褐色或淡黄白色，气微，味微苦[3]。

　　蒲公英作为我国常用的传统中药，最初记载于《唐本草》中。其药理作用在《唐本草》、《黄帝内经》、《伤寒论》等历代医学专著中均有记录，而且给出了很高的评价。

　　在蒲公英的现代药理学探究中发现，对蒲公英中所含的化学成分研究较多，许多从事质检方面的专家已从蒲公英中提取分离出许多有效成分，其中酚酸类成分被认为是蒲公英具有抗菌作用的主要原因[4]。蒲公英的营养成分丰富，具有很高的药用价值，主要表现在抗病毒、提高免疫力、抑癌、抗氧化等的作用，因此，蒲公英药材具有很好的发展前景，不仅可以作为中药治病，还可以作为各种食品和化妆品的原材料，发挥其药用和保健的双重功效。

　　1.1.2有效成分

　　咖啡酸是有机酸中的一种酚酸类物质，在冷水中的溶解度比较低，具有广泛的抑菌作用。咖啡酸在西红柿、胡萝卜、谷类等多种植物性食物以及在蒲公英、一枝黄花、杜仲升麻等中草药中广泛存在，另外也可以在饮品检测到，如酒、咖啡、茶、苹果汁，其化学式为C9H8O4，相对分子质量180.16，化学结构式如图：

　　由上图1-1咖啡酸的分子结构式能够看出，咖啡酸作为一种酚类化合物，在反应中可以提供氢原子，还能使芳环羟基化，使得咖啡酸还原能力较强[5]。酚类物质中的氢原子可以发生解离，为保持结构稳定具有抗氧化作用，可利用电子在共轭环和侧链之间的移位。咖啡酸不仅具有抗氧化性，还有显著的抗菌、消炎和镇痛作用，且对身体危害极小，预示了其作为新型抗炎药物的前景[6]。

　　1.1.3发展前景

　　蒲公英适应性强，可在各种类型的土壤条件生长，因此分布广泛。蒲公英不仅是很好的中药开发资源[7]，而且还可用于美食、观赏等方面。蒲公英的营养成分丰富，具有很高的药用价值，主要表现在抗病毒、提高免疫力、抑癌、抗氧化等的功效，因此，蒲公英药材具有很好的发展前景，不但可以作为中药治病，还可以作为各类食品和化妆品的原材料，蒲公英的开发前景主要体现在三个方面：药品、食用、日用品。

　　(1)药品开发：提取有效成分制成药品，可根据药典中方法和配方制成蒲公英复方中成药，可制成丸状、散类、膏状和冲剂等。

　　(2)食用开发：作为新鲜蔬菜，软制罐头，烘干制茶。用其精提液掺制泡泡糖等，作为具有新型功效可食用产品。

　　(3)日用品：对其多次提取得精制液用于制作保健牙膏或加入奶类及皂类中。

　　1.2.1薄层色谱法

　　薄层色谱法对中药材进行鉴别，是利用不同药材的有效成分在相应的溶剂中的，在其指定薄层板上展开的比移值具有一定的特殊性，使物质中组分分开。其实验操作简单，便捷，且重现性好，是现代实验室检验使用最多的方法[8]。1999年凌云，张永林等人在《中药蒲公英的理化鉴别研究》中采用UVS和TLC对常用蒲公英品种进行了检测区分，结果显示多种常见蒲公英的紫外光谱图一样，薄层色谱显示均含有咖啡酸，其中薄层色谱的展开剂为氯仿-甲醇-甲酸（9：3：1）[9]，为蒲公英在理化方面的鉴别提供了依据。2007年师绘敏等人在《蒲公英中咖啡酸和绿原酸的含量测定》中采用TLCS对蒲公英中的咖啡酸、绿原酸进行定量检测，薄层展开条件为氯仿-甲醇-甲酸(16.5∶6∶2)，在此条件下咖啡酸、绿原酸均可达到定量分析要求[10]。2008年李喜凤在《蒲公英现代分析方法研究进展》中的薄层鉴别中提出咖啡酸可在甲醇及水中快速溶出，由此简化了提取过程[11]。

　　1.2.2高效液相色谱法

　　20世纪60年代末70年代初发展起来的高效液相色谱法是一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，已成为当前应用非常普遍的化学分离分析的重要技术[12]。2006年晏媛、刘世霆等人在《HPLC同时测定蒲公英中咖啡酸和阿魏酸的含量》中利用了反相高效液相色潽法同时定量的方式，色谱条件：C18分析柱，柱温40℃，流动相甲醇-0.01M磷酸二氢钾溶液，波长323nm，得咖啡酸r=0.9991（n=6），回收率为95.3%-98.2%，该方法分离度好，快速，简便，重现性好[13]。2012年邵礼梅、陈立柱等人在《HPLC法同时测定蒲公英中绿原酸和咖啡酸的含量》中利用反相高效液相色谱法对蒲公英中绿原酸和咖啡酸的含量进行同时测定，采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，流动相：甲醇-乙腈-0.05%磷酸溶液（5：5：90），检测波长：328nm，流速：1.0mL·min-1；进样量：10µL；柱温：35℃。咖啡酸的线性范围r=1.0000（n=7），提取回收率为99.69[14]。2013年卢宏军在《蒲公英药材中咖啡酸的含量测定》中利用高效液相色谱法测定不同种类及产地的蒲公英中咖啡酸的含量。方法：C18(4.6 mm*250 mm,5μm)色谱柱；以甲醇-PBS（pH3.8～4.0）（23：77）为流动相；检测波长：323 nm，柱温：30℃。得出咖啡酸的r值为0.5820~149μg/m L，回收率为101.59%，药材含量平均1.84mg/g[15]，实验条件的不断改进提高了咖啡酸的回收率，进一步完备了HPLC测定蒲公英中咖啡酸含量的方法。

　　本文主要根据2015版《中国药典》中定性及定量的检测方法对安徽林兰药业有限公司所生产的饮片蒲公英进行研究。首先去饮片车间进行取样，观察生产的饮片蒲公英的外观是否符合药典要求，观察之后对其进行编号，送去质量部检测。按照药典中步骤对所取药材和对照品进行一系列处理，作为薄层色谱法所需要的样品溶液和对照品溶液。然后利用薄层点板对饮片蒲公英进行定性鉴别，依据薄层色谱法鉴别原理，若在板上相同的位置上显同种颜色颜色的斑点则说明该饮片中确有咖啡酸的存在。配制测定含量所需要的咖啡酸对照品溶液和蒲公英样品溶液，进行系统适应性试验，若五针咖啡酸对照品的峰面积的RSD<2%，说明系统适应性良好，可以进蒲公英样品溶液，对样品进行定量测定。最后，测量得出的实验数据与药典中有效成分含量规定值相比较，从而得出该批饮片是否合格。

　　薄层色谱法简称TLC，起源于二十世纪初，其在理论和技术方面发展迅速，是当前国家药典中收载最多的检查方法，应用范围也非常广泛，可用于检查药物中的杂质、鉴别、药物分析等方面，还可用于跟踪实验反应进程。优点主要有设备和使用方法简单、分离速度快、灵敏度和分辨率较高等。薄层色谱法成为药品检测中快速分离和定性分析少量物质中必不可少的一种实验方法。

　　薄层色谱法是依据物质成分性质的差异，在相应的流动相和固定相中溶解度或吸附度的不同，来进行分离物质组分的方法。因为展开剂中展开的时候会不断地产生吸附、解吸，在分离后会在薄层板上显示出一系列的斑点，将样品比移值(Rf值)与相同处理所制得到的对照品薄层图Rf值相比较，以此对药品进行检测鉴别。

　　在进行薄层色谱分析时，要选择薄层板，薄层板按照固定相或载体的不同又分为多个种类，其中最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254。根据2015版药典规定，本次实验中采用硅胶G薄层板，进行定性分析。

　　高效液相色谱法崛起于20世纪60年代,有着近三十的发展历史，在仪器水平、色谱原理研究、离子分离分析方面进步了许多,并且在理论和实践方面日趋完善,其应用范围已涉及医药方面、环境保护方面、化学工程方面等基础应用。其中在药品检验方面的研究进步飞快且最为普遍。1985年，中国药典将高效液相色谱法收录其中，随着时代的发展和药品检验的需求，高效液相色谱法成为一种主流的色谱分析方法，其在药品检验中应用逐渐增加，在药品质量控制方面也起到十分重要的作用。

　　高效液相色谱法简称HPLC,是一种以液体作为流动相，采用颗粒特别细的高效固定相的柱色谱分离技术，利用试样在两相中的吸附或分配系数的微小差异，也就是试样中各组分在色谱柱中的两相中不断进行分配的过程，以此达到分离的目的。由于检测的物质中组成成分在性质和结构的不同，与所选用的固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间不断分配，达到平衡，使混合物中各组分在固定相中保留时间不同，从而按照一定顺序从中流出，然后与相应的检测方法相结合，实现混合中各组分的分离和检测。它的主要特点是：快速、高效、灵敏度强、样品回收利用比较简单。

　　本课题采用的是液固色谱法，色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以甲醇-磷酸盐缓冲液（23:77）为流动相，对饮片蒲公英中咖啡酸含量进行定量分析。

　　本课题研究的中药饮片蒲公英是在六安市金寨县的安徽林兰药业有限公司的仓库中包装好的蒲公英饮片中随机抽取的。该公司生产的蒲公英饮片是原料蒲公英经过去除杂质，清洗，用刀切段，在烘箱中干燥，得到。气微，味微苦，其为不规则的段，根表面棕褐色，抽皱；花冠微乳色，瘦果暗褐色；叶呈波状齿或羽状深裂，为绿褐色。

　　3.2.1采样与保存

　　取样：对生产部送来的饮片蒲公英进行抽样，根据2015版《中国药典》一部通则中记录的药材抽样方法，取药材100包，将药材包件摆放成正方形，取四个角及中心的五件，对取出的饮片包件沿对角线画“×”，用取样棒按不同方向，不同深度取对角及中心的五份，每个包件取100g，共取药材500g。

　　保存：取样完成后，将取得的样品分成三份用塑封袋保存好并贴上注有品名、批号、取样重量、取样日期等标签，根据《药品经营质量管理规范》，将样品分别放置在阴凉留样室、常温留样室、打粉室，供留样保存、复核、实验所用。

　　3.2.2试样前期处理

　　取适量的饮片蒲公英放入高速万能粉碎机中，为了防止粉碎机运转时间长，机体温度高，损坏电机，打粉时进行间隔粉碎，每十秒钟间隔一次。打粉结束之后，将蒲公英粉末倒入二号筛中，对粉末进行手动过筛，将过筛后的粉末装入塑封袋中，贴上标签，注明品名、批号、打粉时间及所过的筛号。

　　3.2.3咖啡酸的鉴别

　　鉴别步骤：样品制备点样展开检视

　　（1）供试品溶液：用四位数的分析天平称取粉末1.0015g为样品1、1.0008g粉末为样品2，置于50mL的锥形瓶中，贴上标签，分别向其中加入20mL的5%甲酸的甲醇溶液，超声处理20min，用普通漏斗过滤置蒸发皿中，在水浴锅上将其蒸干，然后加10mL的水溶解残渣，再次滤过，用10mL乙酸乙酯振摇提取，两次，然后将两次得到的乙酸乙酯液放在一个蒸发皿内，再次蒸干，向其中加入1mL甲醇，使之溶解，置于红外管中，作为供试品溶液。

　　（2）对照品溶液：用五位数的分析天平精确称取0.00051g咖啡酸对照品，加入1mL甲醇溶液，制成每1mL含有0.5mg的溶液，置于安口瓶中。

　　（3）点样：取硅胶G板，在板上下两端1cm左右处用2B铅笔轻轻的画出一条直线，在其中一端的线上点3个点，标注好相应的字母，用于区别，用毛细管吸取样品溶液和对照品溶液各6μL，先后点在同一块G板上，用洗耳球缓慢的将点在板上的溶液吹干。

　　（4）展开剂的配制：分别用量筒准确的量取乙酸丁酯14mL、甲酸5mL、水5mL比例为（7:2.5:2.5），用分液漏斗振摇充分，发生萃取后，将下层溶液放出，剩下的上层溶液倒入展缸中。

　　（5）展开与检视：将点过的薄层板轻、快的放入展缸中，然后密封展缸，防止展开剂挥发，注意观察，在流动相爬到薄层板上端的线时，将板拿出，放置通风橱内晾干，晾干后将板放在波长为365nm的紫外分析仪下进行检视，观察样品和对照品色谱是否在相同位置呈现一样颜色的荧光斑点。

　　3.2.4咖啡酸含量的测定

　　1、供试品溶液的制备：用万分之一的分析天平分别精密称定蒲公英粉末1.0007g、1.0004g，分别放入贴好标签的50mL带塞锥形瓶中，精确加入10mL5%甲酸的甲醇溶液，密塞摇匀后，对其称重，然后在超声机中设置功率250W，频率40kHz，处理30分钟。取出后，放凉，再对其称重，用上面所用的溶液补足减少的重量，振摇均匀，倒入离心管中，在离心机中离心，完成后，取上清液置于棕色量瓶中，为供试品溶液。

　　2.对照品溶液的制备：用十万分之一的分析天平精密称取咖啡酸对照品0.0001514g，精密加入50mL甲醇溶液，制成每1mL含有30μg的对照品溶液，将其置于容量瓶中，得到对照品溶液。

　　3.流动相的配制及处理：称取1.562g磷酸二氢钠于烧杯中，向其中加1000mL水使其溶解，使用1%的磷酸溶液将溶液pH值调至3.8~4.0，得到磷酸盐缓冲液。在对流动相进行抽滤和脱气前，要清洗流动相瓶和抽滤瓶，第一遍用自来水清洗，第二遍用纯化水清洗，最后用纯净水。清洗后在抽滤瓶瓶口放上滤膜，先抽滤少量缓冲液润洗抽滤瓶和流动相瓶，再进行抽滤，完成后倒入流动相瓶中，放入超声波清洗器中超声处理15min，脱气。

　　4.高效液相色谱仪操作步骤：

　　对照品和样品溶液的过滤：用一次性针管分别吸取适量对照品溶液和样品溶液，然后拔下针头插上微孔滤膜过滤器，将它们过滤到棕色进样瓶中。

　　开机操作：

　　（1）打开电脑、自动进样器、仪器、Cactus软件，点击采集，用单泵纯甲醇冲泵，50min左右。

　　（2）停泵，压力稳定后换上流动相（A泵纯甲醇，B泵磷酸缓冲液），拧开A泵和B泵的放空阀，点击启动Purge，进行冲洗约3min，排出气泡旋紧放空阀。

　　（3）点击单样品分析，创建方法，设置梯度，检测波长323nm，柱温30℃，保存后，选择该方法，柱温达到30℃后，启动平衡30min，然后将将进样瓶放入自动进样器中，记住位置。

　　（4）点击样品组分析，添加样品名称，设置检测方法、起始位置、结束位置、进样次数（对照品5针，每个样品2针）、进样体积（10μL）。完成设置后，开始进样。

　　在理化室中洁净的实验台上采用毛细管分别吸取咖啡酸对照品溶液和两个样品溶液点在G板上，完成后将其放入展缸，进行展开，展开完成取出晾干，置于紫外灯下观察。

　　对照品样1样2

　　质量（g）0.00051 1.0015 1.0008

　　在三用紫外仪下用365nm波长检视，结果如下图所示：

　　

　　由上述计算结果得出饮片蒲公英中咖啡酸的含量为0.0356117%>标准值0.02%，安徽林兰药业所生产的饮片蒲公英质量符合要求。

　　蒲公英作为我国传统常用中药，其所含化学成分非常多，并且有重要药理作用。本文还依据2015版《中国药典》中的方法，对安徽林兰药业公司生产的一批饮片蒲公英进行检测。利用薄层色谱法定性鉴别蒲公英中的咖啡酸，该方法能够快速准确地确定中药材中有效成分的存在；采用高效液相色谱法对饮片蒲公英中咖啡酸含量进行检测，以甲醇-磷酸盐缓冲液位流动相，根据药典规定，以干燥品计算，饮片蒲公英中咖啡酸含量≧0.02%，经过计算，测得该企业生产的180801批次饮片蒲公英的平均含量为0.0357%>0.02%，符合要求，该批次饮片合格，可以进行下一步包装，进行销售，也可送至该公司的颗粒剂车间，用作制剂辅料。

　　本次实验的目的是为了检验林兰药业公司生产的饮片蒲公英进行检测，在检测的同时，锻炼了我们的实验操作能力，能够熟练使用实验中所用的仪器，为我们以后从事检验工作奠定了一定的基础。

　　通过本次对企业生产的饮片蒲公英的鉴别与鉴定，企业在下次检测时可以按照本次实验方法，从而达到检测目的。相信随着企业的不断发展，会找到更加快速、准确的方法来检测中药，提高实验效率，进一步为人们的用药安全提供保证。

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