增液汤对慢传输型便秘小鼠的初步实验研究

中文摘要

目的：

依靠复方地芬诺酯混悬液对普通大鼠进行灌胃以复制便秘动物模型，而后使用增液汤对实验动物进行治疗，对大鼠的排便情况进行观察分析，再对水通道蛋白3、4（AQP3、AQP4）表达水平进行检测，旨在观察增液汤对AQP3、AQP4的调节作用，对增液汤在治疗慢传输型便秘的作用机制进行初步探讨。

材料和方法：

选用60只SPF级昆明种小鼠，雌雄各30只，随机分成模型组、正常组、麻仁胶囊组、增液汤低、中、高浓度组六组，每组10只。对正常组之外的所有小鼠使用复方地芬诺酯混悬液建立动物模型，参照文献报道，将小鼠按照10mg/kg/d剂量用复方地芬诺酯混悬液灌胃,正常组则用蒸馏水灌胃，连续灌胃4周，即可造成慢传输型便秘的小鼠动物模型，模型复制成功后，分别用相应干预，观察增液汤对便秘模型小鼠的排便的影响，检测结肠中AQP3、AQP4的表达。

结 果：

1.造模情况：造模小鼠大便干结样明显，形状为圆珠状或串珠状，同时造模小鼠的排便数量以及重量呈现明显下降，运动量减少，与便秘临床症状相似，故而认定本次造模成功。

2.经增液汤治疗的便秘小鼠模型的首粒排便时间明显缩短，提示增液汤可发挥促便作用，较模型组存在统计学差异（P<0.01）。

3.Westem-blot：模型组的AQP3、AQP4表达明显高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01），麻仁胶囊组、增液汤与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结 论：

1.使用10mg/kg/d的复方地芬诺酯混悬液剂量对实验小鼠进行为期4周的造模，此方法可成功复制出鼠慢传输型便秘模型，且该模型安全性以及稳定性好。

2.增液汤通过下调AQP3、AQP4表达，是其发挥“增液行舟”效应而能够治疗STC的作用机制之一。增液汤中浓度组降低AQP3、AQP4效果最明显。

3.本实验中，治疗慢传输型便秘效果，增液汤中浓度效果最佳。

关键词：增液汤；慢传输型便秘；水通道蛋白3；水通道蛋白4

前 言

慢传输型便秘（STC）为一种临床上常见的疾病，本病也可作为多种疾病的临床表现之一，本病的病因病机负责，临床主要表现为排便次数少量少，大便干结、排便费力等。目前由于人群饮食习惯以及情志失调等因素，便秘发病率呈现上升趋势。据相关流行病学研究显示，我国部分城市慢性便秘患病率达到了4.6%，其中男性患病率3.37%，女性患病率5.2%。男性慢传输型便秘患病率要低于女性；对于大于50岁人群，慢性便秘的患病率逐渐升高的趋势。

现代医学对于便秘的发病机制仍未有统一的标准，并且还处于讨论阶段。有很多学者认为便秘的发病机制与肠道动力的改变、神经系统异常、Cajal间质细胞异常和心理精神因素等有关。

祖国医学概括便秘的病因有饮食不节、情志失调、年老体虚和感受外邪。中医学中关于本病病机的描述为大肠传导功能异常，主要病位在大肠，但与肺、脾、胃、肝、肾等脏腑存在密切联系。脏腑功能的异常，都会对大肠的传导功能，造成伤害，从而引起便秘，诸如胃热、津液损伤可导致肠道失去濡润；脾肺气虚可致大肠传导无力；肾阴不足可致肠道失于濡养；肾阳亏虚可致人体阴寒凝滞，故而津液不通，脏腑失去通利，可致肝气郁结、气机失调，而气郁化火伤津。

吴鞠通《温病条辨》中首载由玄参、麦冬、生地三味中药组成的增液汤。《温病条辨》所谓“水不足以行舟，而结粪不下者”，当增水行舟。本方药物成分少，但是每种药物的用量大，功能专一，但是疗效显著。本方重用玄参位君药，该药性味苦咸而凉，具有滋阴润燥、壮水制火以及启肾水以滋肠燥之功；以生地以及麦冬为臣药，生地性味甘苦而寒，可发挥清热养阴、壮水生津之功，可使得玄参滋阴润燥之力增加；肺与大肠相为表里，故而使用性味甘寒之药麦冬，以滋养肺胃阴津、润肠燥。玄参、麦冬、生地三药合用，可养阴以增液，补药之体、泻药为用，故而肠燥得润，大便乃下，故名之曰“增液汤”。

本实验研究前，经过长时间的临床疗效观察，对增液汤治疗便秘的临床疗效进行了验证，研究发现便秘患者在增液汤治疗后的大便情况明显改善，腹部不适情况也明显改善，此外患者自述津液得到补充，咽干口燥等症状得到缓解。此方药味少，临床使用该方治疗STC的疗效明显，可充分发挥中医药治疗慢性疾病的优势。

基于增液汤滋阴润燥的功效以及其临床效用开展本实验的动物学机制研究，使用复方地芬诺酯混悬液灌胃制造便秘的动物模型，而后使用增液汤对造模动物进行干预治疗，而后对增液汤干预造模动物排便情况的影响进行观察，明确STC发病与AQP3、AQP4的关系，该研究使用Westem-blot技术进行检测研究。研究增液汤治疗便秘的机制，从而体现出在临床上增液汤的实际意义

　1、材料与方法

1实验材料

　1.1实验动物

选用60只健康的SPF级昆明种小鼠，雌雄各30只，体重范围控制在20±2g，所有实验小鼠均由辽宁中医药大学实验动物中心提供。且所有实验动物均经过筛选，筛选标准严格按照国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》要求拟定。

1.2实验药品及制备

　　1.2.1实验药品

复方地芬诺酯片：2.5mg/片（常州康普药业有限公司），国药准字：H32023716，生产批号：1503038。

增液汤：玄参30g，生地24g，麦冬24g。

麻仁软胶囊：0.6g/粒（佛山手心制药有限公司），批号：国药准字Z10930033。

1.2.2药物制备

制备复方地芬诺酯混悬液：使用研钵对复方地芬诺酯片进行研磨，将其尽量研磨成粉末状，参照实验所需浓度，使用蒸馏水与复方地芬诺酯片混合，充分混匀，制备混悬液，配制过程中需要对其进行充分且均匀的搅拌。

制备增液汤：称取玄参、麦冬、生地三味中药，而后将其放入煎煮容器中，再置入4倍药量的清水对其进行浸泡。浸泡时间为30min，大火将其煮沸，沸腾时进行计时，而后使用小火继续煎煮40min，煎煮时间到后，使用三层纱布进行过滤取汁。煎煮的第二、三次的用水量为药量的3倍用水，使用等同方法对其进行煎煮，煎煮失常为40min，同法取汁。将三次滤液合并，倒入容器中，置于4°C冰箱中保存备用。

制备麻仁软胶囊混悬液：待到使用时将麻仁胶囊拆开，将其内容粉末取出，参照实验所需浓度，使用蒸馏水与麻仁胶囊内容粉末混合，充分混匀，制备混悬液，配制过程中需要对其进行充分且均匀的搅拌。

制备碳墨糊：参照本研究预实验结果，使用15g羧甲基纤维素钠以及4g活性碳末，以蒸馏水定容至300ml，而后对其进行加热，观察至混合物粘稠即可，冷却后待用。

　1.3主要试剂

全蛋白抽提试剂盒（中国 南京凯基生物科技发展有限公司 KGP2100）

Western及IP细胞裂解液（中国 南京凯基生物科技发展有限公司 KGP701）

Invent 总蛋白提取试剂盒（X Invent SD001/SN002）

SDS-PAGE 凝胶电泳试剂盒（中国 南京凯基生物科技发展有限公司 KGP113）

BCA 蛋白含量检测试剂盒（中国 南京凯基生物科技发展有限公司 KGP903）

ECL 检测试剂盒（德国 Millopore WBKLS0100）

预染蛋白分子量（中国 Bio-Platform Bpwb10102）

　1.3实验所用仪器信息

基础电泳仪电源（威泰克有限公司 ELITE 300PLUS E5W0541）

高速冷冻离心机（德国 eppendorf 5415C）

分光光度计（日本 SHIMAZDU UV-2540）

蛋白印迹仪（威泰克有限公司 Yrdimes SW07D0567）

台式恒温振荡器（中国 上海精宏实验设备有限公司 THZ-312）

分析天平（德国 Sartorius BL310/BL21S）

移液器（康宁）（X corning 4070 4073 4075）

凝胶成像分析系统（威泰克有限公司 Dolphin 系列凝胶成像系统）

2实验方法

　2.1实验动物饲养

本研究所有实验动物均于辽宁中医药大学动物实验中心饲养，以全价动物饲料进行喂养，实验动物进行自由饮水，实验室环境均采用自然光照，通风条件良好，室内温度设置在20～25℃，相对湿度控制在40～60%。

　2.2实验动物分组

将60只SPF级昆明小鼠随机分成正常组、模型组、麻仁胶囊组、增液汤低浓度组、增液汤中浓度组和增液汤高浓度组，每组10只，雌雄各有30只。以每笼5只的规模将各组小鼠进行分笼饲养，共计6组12笼60只实验小鼠进入实验。

3实验数据统计处理 ：

实验所得数据均使用SPSS17.0统计软件分析，计量资料均以均数±标准差（

±s）表示，单因素方差分析进行多组间比较采用，方差齐则使用LSD检验对其进行组间。以P＜0.05提示具有统计学差异。

实验结果

　　1、慢传输型便秘模型的制备

　　1.1给药剂量

复方地芬诺酯混悬液：小鼠用药量为10mg/kg。

　1.2实验动物的分组

将60只SPF级昆明小鼠随机分成正常组、模型组、麻仁胶囊组、增液汤低浓度组、增液汤中浓度组和增液汤高浓度组，每组10只，雌雄各有30只。以每笼5只的规模将各组小鼠进行分笼饲养，共计6组12笼60只实验小鼠进入实验。

　1.3动物模型的建立

造模开始前对各组实验小鼠的每小时排便数量以及排便重量进行监测，对其差异性进行比较。而后将正常组之外的所有小鼠均依据复方地芬诺酯混悬液法[1]建立慢传输型便秘小鼠模型。以10mg/kg/d的复方地芬诺酯混悬液对实验动物进行灌胃，正常组用蒸馏水灌胃。连续灌胃4周。造模后检测24小时排便粒数和排便重量。

　1.4药物干预

造模前予以实验小鼠禁食不禁水12h，而后使用复方地芬诺酯混悬液以10mg/kg/d进行灌胃，予以正常组等体积蒸馏水进行灌胃。

　1.5结果及分析

对经筛选的60只实验小鼠的排便监测情况包括排便数量以及排便重量金鼎对比，发现不存在统计学差异（P＞0.05），故而提示所有实验动物之间均具备可比性。造模后，各组小鼠生存情况正常，不存在小鼠死亡情况，故而提示笨实验所采取的造模方法具备安全性。实验过程中正常组小鼠在饮食、行为、活动、二便等方面均显示正常。而造模的小鼠在日摄食量方面变化不明显，但活动量明显减少，并且造模小鼠大便干结样明显，呈圆珠状或串珠状，在排便数量以及重量方面显著下降，较正常组小鼠之间存在显著性差异（P＜0.01），符合便秘的临床表现，故认为造模成功。详见表1

表1 各组小鼠小时排便情况

注：与正常组相比，**P＜0.01

　1.6小结

以10mg/kg/d的复方地芬诺酯混悬液剂量对实验小鼠进行为期4周的造模，此方法可成功复制出鼠慢传输型便秘模型，且该模型安全性以及稳定性好。

2增液汤对模型小鼠排便功能的影响

　2.1给药剂量：

增液汤：临用时，取已制备增液汤混悬液。实验小鼠药物灌胃剂量为0.125ml/10g/d。按照临床成人每日用药剂量设定等效剂量，依据人与实验动物标准计量换算公式[2]计算实验小鼠的的灌胃剂量为11.8g/kg/d。依照预实验的标准情况，将等效剂量作为中浓度，低中高三种药物浓度之比为：1:2:4，使用此剂量作为实验用药剂量，分别为5.9g/kg、11.8g/kg、23.6g/kg。

麻仁软胶囊：将蒸馏水与麻仁软胶囊内容粉末混合而成制作为均匀的混悬液,以实验动物的体重按照0.125ml/10g/d的剂量进行灌胃给药,生药量为0.27g/kg。

予以正常组以及模型组等体积蒸馏水进行灌胃，不进行其他灌胃操作。

所有实验小鼠均连续灌胃给药一周。灌胃期间，所有小鼠予以充足的饲料以及饮用水，任其摄食以及饮水，称重没3天一次，依据体重调整给药剂量。

复方地芬诺酯混悬液：小鼠用药量为10mg/kg。

　2.2分组

将60只SPF级昆明小鼠随机分成正常组、模型组、麻仁胶囊组、增液汤低浓度组、增液汤中浓度组和增液汤高浓度组，每组10只，雌雄各有30只。以每笼5只的规模将各组小鼠进行分笼饲养，共计6组12笼60只实验小鼠进入实验。

　2.3造模

依据前人研究[1]结果，将实验小鼠在造模前禁食不禁水12h。以10mg/kg复方地芬诺酯混悬液的剂量对造模小鼠进行每天一次灌胃，连续灌胃4周。

　2.4药物干预

造模成功后，药物干预，使用增液汤低浓度、中浓度、高浓度，分别为5.9g/kg、11.8g/kg、23.6g/kg，进行灌胃，正常组和模型组则灌等体积蒸馏水。

使用增液汤进行干预灌胃，30min后，再以0.3ml/10g碳墨糊对所有小鼠进行灌胃，而后将实验小鼠放置于存在滤纸的烧杯内进行观察，对每只小鼠的首次排黑便时间以及6小时内排便粒数进行记录。

　2.5结果及分析

　　2.5.1小鼠体重变化

各组小鼠在实验初始时测体，组间无差异。造模后再测体重，仍无明显差异。在灌胃给药期间内，各组小鼠的体重均正常增长，各组间无显著性差异。这说明复方地芬诺酯造模和增液汤治疗均对复方地芬诺酯所造的慢传输型便秘模型小鼠的体重无影响。各组小鼠体重变化详见表2

表2.各组小鼠体重变化

　2.5.2小鼠6小时排便情况

模型组与正常组相比，大便质地干硬且颗粒较小，首次排出黑便的时间明显较正常组延长，存在显著统计学差异（P＜0.01）；同时6h内排便粒数明显较正常组少，存在统计学差异（P＜0.01）。麻仁胶囊组与模型组相比，大便质地变软，首次排出黑便时间显著缩短，存在统计学差异（P<0.01）；同时6h内排便粒数明显较模型组增加，存在统计学差异（P＜0.01）。增液汤低剂量组、中剂量组、高剂量组的大便质地明显稀软，首次排出黑便的时间均明显缩短，存在统计学差异（P＜0.01）；同时中剂量组与高剂量组的粪粒明显增大，6h排便粒数明显增加，存在显著统计学差异（P<0.01）。低中高剂量组比较结果显示，中剂量组增液汤对实验小鼠排便情况改善效果最为明显。（结果见表3，图1，图2）

表3.增液汤对便秘模型小鼠排便情况的影响

2.5.3小结

2.5.3.1使用稳定剂量的复方地芬诺酯混悬液建立的动物慢传输型便秘的模型稳定性以及安全性较好。

2.5.3.2使用复方地芬诺酯混悬液建立便秘模型以及增液汤对慢传输型便秘小鼠干预治疗均对模型小鼠的体重无明显影响。

2.5.3.3增液汤对慢传输型便秘小鼠的排便功能具有明显的促进功能，同时本研究验证了增液汤的用量与作用发挥程度存在明显的关系。

3增液汤对STC模型小鼠肠组织中的AQP3、AQP4表达的影响

3.1给药剂量：同2.1

　　3.2分组

将60只SPF级昆明小鼠随机分成正常组、模型组、麻仁胶囊组、增液汤低浓度组、增液汤中浓度组和增液汤高浓度组，每组10只，雌雄各有30只。以每笼5只的规模将各组小鼠进行分笼饲养，共计6组12笼60只实验小鼠进入实验。

　3.3造模

依据前人研究[1]结果，将实验小鼠在造模前禁食不禁水12h。以10mg/kg复方地芬诺酯混悬液的剂量对造模小鼠进行每天一次灌胃，连续灌胃4周

　3.4药物干预

造模成功后，药物干预，使用增液汤低浓度、中浓度、高浓度，分别为5.9g/kg、11.8g/kg、23.6g/kg，进行灌胃，正常组和模型组则灌等体积蒸馏水。

　3.5取材

增液汤治疗一周后，对实验小鼠进行禁食不禁水24h，而后以3ml/kg剂量的10%水合氯醛对实验小鼠进行腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉完全后，将小鼠至于解剖台上，剃毛消毒，而后迅速打开腹腔，回盲部至肛门之上3cm截取实验用结肠，待截取完毕，使用生理盐水对实验用结肠进行冲洗，将其内容物尽量冲洗干净，小心仔细剥离肠系膜，放置在相应的器皿中，存放于-80℃冰箱中以备WB使用。

　3.6主要试剂配

电泳缓冲液制备：①Tris碱：25mM；②甘氨酸：960mM；③0.5％SDS；再使用800ml去离子水与200ml5×电泳缓冲液充分混匀，制备1×电泳缓冲液。

转膜缓冲液制备：①Tris碱：125mM；②PH8.3甘氨酸：960mM；再使用800ml去离子水与200ml的5×缓冲溶液充分混匀，制备1×电泳缓冲液。

洗膜缓冲液制备：①Tris碱：250mM；②Nacl：1500mM；③PH7.5Tween-20 0.5％；再使用900ml去离子水与100ml的10×缓冲溶液充分混匀，制备1×电泳缓冲液。

3.7小鼠结肠 AQP3、AQP4表的达检测

采用蛋白质印迹法（Western blot）对小鼠结肠AQP3、AQP4的表达水平实施检测，严格参照相关使用试剂盒的说明书进行操作步骤进行操作，实验证实开始前将实验用标本以及试剂盒放置在室温环境下，达到室温后在进行相关实验操作。

　3.7.1蛋白制备

使用RIPA裂解液对组织样本进行蛋白提取，对Lysis Buffer进行预冷而后向其中以10μL/ml浓度添加磷酸酶抑制剂，而后将1μL蛋白酶抑制剂以及5μL 100mM PMSF充分混匀，置于冰上保存待用。将组织充分收集后，将其转入新的无菌预冷的EP管中，加入Lysis Buffer混合溶液，加入剂量入下表所示：

而后将其充分混匀，在放置在玻璃匀浆器中进行匀浆，注意在低温环境下进行操作。分装保存于-70℃，避免反复冻融。

　3.7.2蛋白定量

依据样本数量，按照50：1比例将BCA定量试剂盒中A试剂与B试剂充分混匀，制备适量的BCA定量工作液。向EP管中添加1000ul的BCA定量工作液。将其充分混匀，于37℃环境中静置30min，使用酶标仪，检测562nm波长的吸光值。而后以蛋白含量(ug)作为横坐标，吸光值作为纵坐标，进行标准曲线的绘制。将待测样本稀释到恰当的浓度，按1：10比例向其中添加样本稀释液与BCA定量工作液，样本稀释液总体积为100ul，BCA定量工作液为1000ul，将其充分混匀，于37℃恒温环境下放置30min后，使用标准曲线0号管最为内参，使用酶标仪检测562nm波长的吸光值并记录。依据所测样品的吸光值，运用标准曲线运算得相应的蛋白含量(ug)，而后再除以100ul样品稀释液总体积，再乘以样品稀释倍数，即可算得样品的试剂浓度（单位：ug/ul）。

　3.7.3SDS-PAGE电泳：

将玻璃板进行清洗，放置以待备用。依据蛋白分子量按照表4、表5制备分离胶以及浓缩胶，而后进行灌胶上样操作。待胶体完全凝固后，将其放置在电泳槽中，设定电压与时间进行SDS-PAGE电泳。

表4聚丙烯酰胺分离胶配方

表5浓缩胶配方

3.7.4免疫反应：将PVDF膜放入培养皿中，向其中添加足量的使用TBST配置且含5%脱脂奶粉的封闭液，放置在摇床上低速摇晃振荡2h。封闭结束后，用TBST洗膜5min×3次。然后分别加入一抗及二抗进行解化（具体步骤详见说明书)。

　3.8结果

图3样品检测结果

注：A-正常组；B-模型组；C-麻仁软胶囊组；D-增液汤低浓度组；E-增液汤中浓度组；F-增液汤高浓度组。AQP3、AQP4对应的条带分别为目标条带，Actin为相应组的actin内参条带。

AQP3：与正常组相比，模型组明显高于正常组，p＜0.01，差异极其显著。与模型组比较，增液汤组含量较低，ｐ＜0.05，具有统计学意义；增液汤中浓度组含量明显低于模型组，p＜0.01，差异非常显著。

AQP4：与正常组比较，模型组明显高于正常组，p＜0.01，差异极其显著。与模型组比较，增液汤组含量较低，ｐ＜0.01，具有统计学意义；增液汤中浓度组含量明显低于模型组，p＜0.01，差异非常显著。

3.9小结

3.9.1复方地芬诺酯造模可以明显增加AQP3、AQP4蛋白的表达。

3.9.2增液汤通过下调AQP3、AQP4表达，是其发挥“增液行舟”效应而能够治疗STC的作用机制之一。

3.9.3增液汤中浓度组降低AQP3、AQP4效果最明显。

分析讨论

1关于便秘

便秘是临床上常见的疾病，发病率逐年增长。便秘是指排便困难，排便次数减少( 每周少于3次)，排便时间延长，且粪便干硬，便后无舒畅感，是一种常见的消化道症候群。伴随着社会经济的发展，人们的饮食习惯、来自于生活各方面的压力以及心理因素的影响日益加重，故而便秘的发病率也呈现逐年上涨的趋势，对人们的生活以及生存质量产生严重影响。我国部分省市的流行病学研究结果表明，慢性便秘患病率4.6%，其中男性患病率3.37%，女性患病率5.2%。男性慢传输型便秘患病率比女性的患病率低；对于大于50岁人群，慢性便秘的患病率逐渐升高的趋势[3]。

长期慢性便秘不仅对患者有很多烦恼，而且还会对诸如乳腺疾病、结肠癌以及老年痴呆等疾病的发生发展产生促进作用，甚至还会引发急性心梗或者其他心脑血管意外对患者的生命产生严重的威胁。目前有相当多的文献对于由便秘引发的不良心脑血管意外的进行报道，这引起了人们对于便秘的高度重视。便秘按发病机制主要分为三大型，即慢传输型、出口梗阻型以及混合型。慢传输型便秘在以上三种便秘类型中发病率较高，并且老年人居多[4]。慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是指大肠功能紊乱，肠蠕动功能降低引起的便秘，行直肠指检时发现无粪便或者可触及坚硬粪便，但是肛门外括约肌缩肛功能以及排便功能如常，无任何器质性病变，主要表现为大便次数减少，少便意或便意消失，大便质地坚硬，有腹胀，大便干燥、排出困难、久蹲难下等，症状顽固。研究显示，中老年人、育龄妇女以及体虚者在比便秘患者中占比较大。在目前的诊疗水平条件下，慢传输型便秘的应用范围以及研究价值最高，主要因为其发病率较高，患病人数以及范围最广，而中老年人、育龄妇女以及体虚者在患者中占比较大，便秘的风险以及危害性显著提高了这些人群相关疾病的危险系数，对人们的生命健康产生严重威胁。综上所述，在便秘的三种类型中，慢传输型便秘的研究价值以及相关药物治疗价值最高，且其还具备广阔的临床和市场应用前景。

目前对于STC的病因病机的研究尚未明确，故而存在诸多关于STC病因病机的说法。目前较为公认的学说有神经系统学说、平滑肌学说、胃肠肤类激素学说、间质细胞学说以及精神自理因素学说等等。

目前临床上治疗STC主要使用一般治疗法、药物治疗法以及手术治疗法等。一般治疗法主要是对患者进行排便健康教育，进行合理的饮食习惯的规划，认识到增加膳食纤维和饮水量的重要性，培养良好的排便习惯，并且增强运动。药物治疗目前治疗STC的西药可分为促动力剂和泻剂两种[5]，有容积性、刺激性、渗透性以及润滑性等多种类型的泻剂。刺激性的泻剂主要作用于肠神经系统，药物本身或者其他代谢产物对肠黏膜感觉神经末梢进行刺激，以增加肠蠕动、促进排便，但是长期服用可以导致不可逆的肠神经损害，导致黑肠病。容积型泻剂作用机制是吸收肠管内水分，而后产生膨胀，对肠道容积进行扩张，从而增大排便量，对肠蠕动进行刺激，诱发排便反射，故而缓解便秘症状，但此类药物可诱发患者腹胀等副作用，部分患者不可耐受。润滑性泻剂的主要组成部分为石蜡油、甘油，此类泻剂的口感差，作用相对较弱，并且长期使用该类泻剂可诱发脂溶性维生素吸收障碍。渗透性泻剂有乳果糖、山梨醇、聚乙二醇等，相比前三种泻剂，其副作用较小受到临床的重视。促动力剂目前有，西沙比利、莫沙必利以及替加色罗等。但西沙比利以及替加色罗可诱发严重的心血管的意外事件，故而临床上已经不再应用此类药物。莫沙必利具备强效的促胃动力作用，对便秘患者的腹胀等相关症状的改善作用相当明显，但对结直肠的作用的相对较弱，故而临床上使用此药多采用联合治疗法。目前临床上，若其他相关治疗手段无明显效应，则采取手术疗法进行治疗，但是对于此类治疗方法的远期疗效尚有待进一步研究证明。

中医药治疗本病是一个循序渐进的发展过程，相关疗效不断得到改善以及完善，与西医西药相比存在明显的优势。中医的辨证论治以及单方验方、中成药治疗便秘的临床疗效均已得到明确的临床验证，并且中医药治疗副作用少，故而临床应用度广，目前已有较大范围的中医药应用。中医药治疗便秘的手段以及方式众多，但也存在一定的不足之处，比如依照循证医学原理，中医药对便秘证型的辨证治疗的中成药较少。故而需要研究者进行更多的动物实验研究以及临床研究，对相关证型进行针对性研究，最大力度发挥中医药辨证论治便秘的优势，减轻临床压力以及患者痛苦。当下科学技术水平的不断提升以及便秘模型的不断完善，为便秘的动物实验研究提供极为有利的研究条件，为中医药治疗便秘提供更为明确、更为科学的理论依据，对攻克便秘问题提供扎实的基础，为完全解决便秘问题提供希望。

2关于增液汤

清吴鞠通《温病条辨》中首载增液汤，其主要成分为一两玄参、八钱麦冬以及八钱生地，依据古今方药剂量换算，即为 30g玄参、24g麦冬以及 24g生地。增液汤可发挥增液润燥之功，主要用于治疗阳明温病以及津亏便秘证。对于临床表现为便结不通、口干、舌质红、脉细数或沉而无力的疾病具有十分可靠的疗效。增液汤擅养阴润燥，是中医临床上滋阴润燥的著名方剂。《温病条辨》是吴鞠通在《伤寒论》基础上，再以叶天士治疗温热病经验所著的代表著作。其治疗温病首要治则即为保护津液：“温为阳邪，易伤津耗液”。创立增液汤便是对温病的治疗法则主要体现，吴氏创立了三焦辨证，他认为温邪始于上焦，再传中焦，最后传于下焦。如果津伤肺燥，肺与大肠相表里，肺燥则肠热，大肠缺乏津液，失于濡养，大便干结；“上焦病不治，则传中焦，胃与脾也”，胃为阳明，邪入阳明则化为燥热，温邪热与阳明热相结合，可伤胃部津液，故而燥热津伤。胃阴亏耗则脾阴也会受损，脾为气血生化之源，脾伤必定会引起津液不足，导致肠失濡润；如果再传入下焦，导致肾阴亏耗，肾乃先天之本，若身体阴虚以及胃津久耗，必然可诱发肾津干涸以及肾阴不足。肾阴乃人身阴液根本，肾阴不足可致肠液亏虚，故而传导不畅排便艰难。津亏液竭则燥屎内结，故而“无水舟停”之症显现。《温病条辨》所谓“水不足以行舟，而结粪不下者”，当增水行舟。本方药物成分少，但是每种药物的用量大，功能专一，但是疗效显著。本方重用玄参位君药，该药性味苦咸而凉，具有滋阴润燥、壮水制火以及启肾水以滋肠燥之功；以生地以及麦冬为臣药，生地性味甘苦而寒，可发挥清热养阴、壮水生津之功，可使得玄参滋阴润燥之力增加；肺与大肠相为表里，故而使用性味甘寒之药麦冬，以滋养肺胃阴津、润肠燥。玄参、麦冬、生地三药合用，可养阴以增液，补药之体、泻药为用，故而肠燥得润，大便乃下，故名之曰“增液汤”。本方咸寒苦甘同用，旨在增水行舟，非属攻下，欲使其通便。

玄参(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)为玄参科草本植物，又名元参，性味甘苦咸微寒，归肺、胃、肾经，可有清热凉血、滋阴降火、解毒散结之功。此药在增液汤为君药，重用以滋阴润燥、清热凉血、壮水制火，故而可启肾水以滋肠燥。《本草纲目》：“滋阴降火，……通小便血滞”，亦有“肾水受伤，真阴失守，孤阳无根，发为火病。法宜壮水以制火，故玄参与地黄同功”之说。《神农本草经》：“主腹中寒热积聚，……补肾气，令人明目。”以及《本草正义》：“玄参，禀至阴之性，专主热病，味苦则泄降下行……”。

玄参在现代药理研究中发现可有抗氧化镇痛、抗菌抗炎、增强免疫活性以及保肝等作用。刘瑶等人[6]对便秘模型小鼠采用玄参破壁粉粒进行干预，研究结果显示小鼠首粒排便时间明显缩短，显示玄参破壁粉粒对小鼠小肠的推进作用明显，6小时内的排便粒数增加，说明玄参滋阴润燥的作用很好。

地黄（Rehmannia glutinosa (Gaetn.) Libosch. ex Fisch. et Mey.），玄参科地黄属多年生草本植物，性味甘苦而寒，归心、肝、肾经。具有滋阴补肾、

养血补血、凉血的功效。方中生地清热养阴，壮水生津，以增玄参滋阴润燥之力。李杲曾说“生地黄，治手足心热及心热，能益肾水而治血，脉洪实者宜此。若脉虚，则宜熟地黄。”《珍珠囊》曰：“大补血虚不足，通血脉，益气力”。《本草从新》曰：“滋肾水，封填骨髓，利血脉，……，黑发乌须。……为壮水之主药”。《本草汇言》曰：“生地，为补肾要药，益阴上品，……，肾得之而骨强力壮……又肾开窍于二阴，而血主濡之，二便所以润也”。

现代药理学研究表明地黄具有降血糖、止血、抗弥散性血管内凝血、抗炎免疫、抗肝损害等作用。张红敏[7]等进行生地提取液润肠通便作用的实验研究发现，生地提取液对小鼠小肠推进运动有明显增加，首次排便时间缩短，排便粒数及排便重量都有所增加，说明生地能够治疗肠燥便秘。

麦冬（Ophiopogon japonicus (Linn. f.) Ker-Gawl.）百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，性味甘、微苦寒，归胃、肺、心经，可发挥益胃生津、养阴润肺、清心除烦之功。增液汤中麦冬为臣药，可发挥滋养肺胃阴津之功，故而可润肠燥。麦冬在《本草分经》：“甘、微苦，微寒。润肺清心、泻热生津、化痰止呕、治嗽行水”。《本经》：“主心腹结气，……..羸瘦短气，久服轻身不老不饥。”《本草汇言》：“麦门冬，清心润肺之药也……主脾胃燥涸，虚秘便难”。

麦冬在现代药理学研究中发现具有清除自由基、降血糖抗疲劳以及提高细胞免疫功能的作用。此外还可镇静催眠、抗心肌缺血以及心律失常、抗肿瘤。谢华通等[8]用凝胶色谱法测定麦冬多糖 MDG-1 在大鼠胃肠道含量变化，说明麦冬能促进胃肠道蠕动，能够缓解便秘。

3动物模型探讨

目前建立便秘实验动物模型的方法众多，主要方法有手术法、药物法以及中医证型造模法等，对多种实验目的的需求都可以满足。依据动物实验的目的，药物法主要包括硫糖铝法、泻剂法、复方地芬诺酷法以及吗啡法，再此就不一一赘述。

　3.1手术造模法

该类方法主要是利用直肠缩窄术复制大鼠便秘模型。此法的主要步骤为对实验动物进行麻醉，而后开腹使得直肠充分暴露,使用号丝线从腹壁至肛门处，使用8字型，再从直肠下方绕过，腹壁引出，丝线引入点与引出点距离腹壁约，将引出的丝线以直径为的铁丝进行打结，而后退出铁丝,将直肠缩窄并且悬吊于腹壁之上，再次缝合腹腔。该类方法可使得模型大鼠排便功能减弱甚至无排便，同时在直肠结扎线以上大量存积坚硬粪便，使得肠管扩张，这些症状与临床上出口梗阻性便秘患者症状相似，故而此类方法多在出口梗阻性便秘研究重应用。

　3.2中医证型造模法

目前较为公认的中医证型造模法主要造模证型有实热型、寒积型、脾虚型、失水燥结型以及阴虚血瘀型。而又可进行食醋活性炭冰水法、过食肥甘法以及饥饱失常+过度疲劳+缺水燥结法建立脾虚型便秘动物模型。

依据寒积中阻致腑气不通的理论，建立寒积型便秘动物模型。使用0.1g/L浓度的2°活性炭冰水，按1ml/只/d对小鼠进行为期三天的灌胃，造模结果显示模型动物的首粒排便时间延迟、排便粒数减少，此类表现与临床上寒积里实证的便秘表现相似。

依据实验动物自身粪便混悬液可导致实验动物产生急性细菌性腹膜炎，故而对肠道动力出现障碍而致大便秘结，以此建立实热型便秘模型。此类方法的主要步骤为：适量小鼠粪便磨碎，与生理盐水混合而成0.1g/L的混悬液，按1ml/只/d进行为期三天的灌胃。该种方法建模可见模型动物少动、蜷曲蹲伏、竖毛、拒绝进食以及排便量明显减少。对实验动物进行解剖可发现其腹腔内存在少量浑浊液体，并且肠管充血，表面附着纤维素性沉积物，肠管充气膨胀及部分肠管痉孪，类似于阳明腑实证。

禁水不禁食建立失水燥结型便秘模型，此类方法依据为粪便缺水故而燥结。只对小鼠进行为期三天的喂食但不喂水。建模结果发现小鼠体质量减轻，大便减少，粪便质硬成珠状，类似于阴液亏损型便秘。

使用利平建立阴虚血痪型便秘模型，利平可耗竭机体内的去甲肾上腺素，而甲状腺素可加速机体代谢，故而利平可降低交感一肾上腺素能神经的功能，使得副交感神经功能亢奋，加速机体阴虚症状。照射可明显损害血液系统导致血流滞缓。利平+副交感神经兴奋+照射导致动物阴虛血瘀型便秘。

过食肥甘法建立脾虚型便秘动物模型：饮食失节致脾虚，而脾虚气血不足可致肠道推进无力而便秘。该法是以纯度100精炼猪油对实验动物进行为期8天的每日2次饮食。建模结果显示实验动物体质量下降、粪便量少且干硬。

食醋+活性炭冰水法建立脾虚型便秘动物模型是依据“味过于酸,脾气乃绝”、“欲令脾实,食勿太酸”及“过寒伤阳”等理论，对实验动物喂养白醋以及0°C活性炭冰水建立动物模型。此法的主要步骤为：对实验动物进行白醋灌胃，首剂量为0.3ml/只,而后每天按0.01ml/g剂量灌胃,灌胃持续9天，灌胃第7天开始，按0.04ml/kg剂量，分2次对实验动物给予0.1g/L0°C活性炭冰水灌胃,持续3天。建模结果显示实验动物出现体质量减轻、腹胀、首粒排便时间延迟、排便粒数减少、肠推进率减慢,类似于临床上阳虚便秘。

饥饱失常+过度疲劳+缺水燥结法建立脾虚型便秘动物模型：此法依据劳倦伤脾、劳则气耗、饮食失常损伤脾胃以及肠道失却濡养而致便秘等理论，对实验动物使用隔日饮食以及每天的2次时常为15min游泳方法，在实验第13天起禁水，共持续15天。建模结果显示实验动物出现皮松毛竖、无光泽，消瘦，首粒排便时间延迟，粪便干结且粒数减少，肠推进率减慢，结肠粘膜肥大细胞密度降低，类似于临床脾虚便秘。

3.3药物造模法

硫糖铝法建立脾虚型便秘动物模型：硫糖铝附着于胃肠粘膜表面，对胃肠液体渗出产生障碍,极大的减少胃肠道内液体，故而胃肠运动减慢。此类方法的主要步骤为：将含质量比为33.55%的硫糖铝配成浓度为0.5g/L的溶液，以1ml/只/d对实验动物进行灌胃，每日一次,连续2天，第3天剂量减半。建模结果显示实验动物首粒排便时间延长，4h内排便粒数减少。此法适用于泻下类泻剂药物药效的研究。

复方地芬诺酯法：此类药物具促使大肠吸收水，可以抑制肠粘膜的感受器，消除局部粘膜的蠕动，从而减弱蠕动，使动物不排便或少排便的功能复制便秘模型。具体步骤为：将实验动物禁食不禁水12h，而后按50ml/kg浓度将复方地芬诺酯片混悬液对实验动物进行一次灌胃。建模结果显示实验动物排便粒数显著减少。此类建模方法对动物的生理功能影响较小，便秘症状也与临床便秘症状相似，此法为实验研究中应用较多的建模方法之一。

吗啡法：此类方法的依据为吗啡在中枢与外周阿片受体相结合，降低机体肠道推力，故而可减少排便。相关临床研究结果显示作为强效阿片类镇痛药的吗啡被广泛使用在晚期癌症镇痛治疗中，虽然疗效尚可，但可诱发严重且持久的便秘。相关实验动物研究结果表明，将阿片受体激动剂给予便秘动物灌胃，则可导致肠道传输变慢,变慢速度与受体激动剂的剂量存在密切关系，而给予阿片受体拮抗剂肠道传输功能增强，同样与拮抗剂剂量存在密切联系。此类研究结果证明吗啡与便秘的产生存在十分密切的联系。

综上所述，临床出口梗阻性便秘模型建立适合选用手术法，而单一证型的中药复方研究的动物模型建立适合选用中医造模法。本研究的实验目的为阐述增液汤对STC的治疗作用以及作用机制，与其证型不存在关系，故而未选择手术法以及中医造模法，考虑建模稳定性以及安全性，故而采用复方地芬诺酯法，该建模方法对实验动物的生理功能影响极低，而其便秘症状也与临床上便秘症状相似，也是目前建立便秘模型中应用较多的建模方法之一。

　4水通道蛋白与STC探讨

肠道中具有活跃的水液代谢过程，研究显示每天大约有10L人体肠道转运的液体，其中有约8L在小肠中吸收，约1.5L在结肠中吸收，小肠长度比结肠长度长的多，故而单位面积内的结肠吸水大于小肠吸水。结肠的重吸收水分的主要结构位于近端结肠上皮细胞，所以升结肠中的水液代谢与便秘的发生发展存在密切关系。STC发病与肠道水液代谢素乱存在十分紧密的联系，尤其与结肠内水转运关系密切。结肠上皮细胞的排列十分紧密，故而细胞旁路水转运受限，所以结肠水分吸收的主要途径是跨细胞膜转运。跨膜通道蛋白的重要组成部分为AQP，此类蛋白在水分吸收以及水液分泌等方面发挥重要作用。

实验结果显示，AQP3、AQP4主要是位于近端结肠的吸收细胞，不是主分泌功能的杯状细胞，结肠重吸收水的部位与此类细胞的位置相一致，故而水液吸收重要通道之中有表达于结肠上的AQP3、AQP4。本研究显示，AQP3以及APQ4的表达未伴随时间延长而减少，使用复方地芬诺酯混悬液灌胃后AQP含量增多，增加了结肠的水液吸收，减缓结肠蠕动，相互作用之下导致便秘病情进一步加重。

AQP与多数通便药的通便作用存在十分密切的联系。相关研究结果[9]显示，MgSO4溶液可使得大鼠的结肠内渗透压在2h时达到峰值，严重腹泻发生灌胃后的4-8h。AQP3表达在渗透压最高时不明显，无法达到水运输需求。而4-8h渗透压相比较有所下降，但AQP3蛋白上升明显，此时肠腔含有充足水分。这些实验结果提示容积性泻剂药硫酸镁的通便作用的发挥不是依靠渗透压升高，主要是通过调节AQP3表达。刺激性泻剂药比沙可巧对于巨唆细胞的产生具有直接刺激的作用，故而可増加PGE2分泌。而PGE2为旁分泌因子，可降低结肠黏膜上皮细胞AQP3的表达，肠腔向水管转移受到其阻碍，故而可产生通便效应。

综上所述，APQ与便秘发生发展以及多数治疗药物发挥疗效的过程中发挥了重要的作用。

　5问题与展望

　　5.1问题

在本实验中，主要存在以下不足。小鼠便秘模型存在一些不足之处：小鼠给药的剂量、方式、以及采血时间需要更进一步来探究，试验时间有限、试验某些器材、试剂因经费问题可能无法使用精度更高的以及其他一些非试验所需的因素造成的影响，所以在评价小鼠药物代谢和自体等差异方面的评价存在片面性。在本实验中，仅从水通道蛋白AQP3、AQP4的表达来描述增液汤治疗STC疗效，所以需要进一步试验来探究更深的机制。

　5.2展望

在以后的试验中增液汤治疗STC的具体机制需要从其他的方面进行进一步的研究，比如增液汤如何调控AQPs以及是否存在其他的信号通路等。增液汤中存在多种药物，因此需要将这多种药物分别提取有效成分进行动物或者细胞的试验，明确产生治疗作用的具体成分。

在后期的试验中，希望可以进一步改良增液汤的药物配伍，增加或者减少某些药物，再结合中医的一些理念，使其对于不同类型的患者都可以产生有效的治疗结果。

参考文献

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[7]张红敏,侯书杰,陈世伟.生地提取液润肠通便作用的实验研究[J].河南预防医学杂志,2001(05):265-266.

[8]谢华通,王硕,阮克峰,冯怡,徐德生.凝胶色谱法测定麦冬多糖MDG-1在大鼠胃肠道含量变化[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(13):139-145.

[9]占煜,陈泰宇,唐诗宇,刘芳,孔鹏飞,覃勤,唐学贵.从水通道蛋白3介导的结肠水液代谢思考治疗慢性便秘的药物研究[J].川北医学院学报,2014,29(06):542-54

增液汤对慢传输型便秘小鼠的初步实验研究

价格 ¥9.90 发布时间 2023年5月8日

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