摘要：本研究旨在了解拟鬼伞属两个近似物种Coprinopsis atramentaria和C.romagnesiana的异同之处，因此对采自尖山自然保护区的四号拟鬼伞属真菌标本，zhu3625、zhu3622、zhu3240、ye562分别从形态特征与分子系统发育两个方面进行了研究，结果发现这两个种虽然宏观形态相近，但从显微形态及系统发育学分析来看仍有不同之处。
关键词：Coprinopsis atramentaria；C.romagnesiana；拟鬼伞属；基因序列；形态描述
1前言
在对文县的大型真菌进行物种多样性研究的过程中，发现该地过去被鉴定为墨汁拟鬼伞Coprinopsis atramentaria的标本，可能包含了C. atramentaria和C. romagnesiana两个物种，后者在中国尚未被报道，属于新记录种。为了证实这一判断，故开展本项研究。
1.1标本产地概况
文县坐落在甘肃省陇南市，位于其最南端，与川、陕交界，位于东经104°16′16″-105°27′29″、北纬32°35′43″- 33°20′26″之间[1]。地处秦巴山地，是甘肃的南大门，西面与九寨沟县和甘南藏族自治州为邻，北邻武都区，东南与四川青川县、平武县相接。文县地质复杂，地表不平坦，高山峡谷、沟壑纵横，为北亚热带半干旱大陆性季风气候区[1]。气候特征为干旱少雨，且有暴雨、大风、冰雹等灾害性天气[2]。
文县拥有丰富的天然森林及大型林场，森林覆盖率达到40%[3]。特殊的地形地貌和丰富的森林资源以及山地气候等因素，使得文县境内植物分布多样、菇菌种类繁多、植被资源极其丰富。当地特有的大型真菌有香菇、松茸、羊肚菌、牛肝菌、木耳等。
1.2大型真菌的研究意义及作用
大型真菌(Higher fungi)通常是指能够产生肉眼可见的子实体的真菌，俗称为伞菌或蘑菇(Mushroom)，大多数属于担子菌门，少数属于子囊菌门[4]。据菌物学家估算, 地球生物圈中大约有150多万种真菌，是地球上的第二大生物群体[5]。如此数目巨大的种群，根据功能可以分为食用菌、药用菌、毒菌等几类。而且有些种类同时具有食用和药用双重价值。经文献考证，我国对真菌的食用历史已有数千年，目前发现可食用的大型真菌达九百多种[6]。此外，因其药用价值，大型真菌也在我国医药学宝库中有举足轻重的地位，我国古代多部医学著作中均有记载，如我国古典药籍《本草经》、《本草纲目》中均记载了真菌的药用功效，比如灵芝可提高免疫力，助睡眠；猴头菇助消化等[7]；还有部分真菌含有毒素，在野外无法准确辨认，食后导致中毒，轻则出现腹泻、幻视等症状，重则致人死亡，一旦误食，后果不堪设想[8]。也有研究表明，毒菌及其毒素是一种具有潜在开发前景的资源，其毒素可以应用于生物防治、药用抗癌等方面[9]，若正确开发利用，将会造福人类社会。
1.3 我国鬼伞属的研究现状及意义
中国地域辽阔，植被类型多样，物产丰富，对大型真菌的研究也颇有热度，但对鬼伞类真菌的研究很少，主要集中在可食用的物种Coprinus comatus (O.E Miill.) Pers.的人工栽培及活性成分研究上。在物种描述方面，邓叔群在《中国的真菌》中记录并且描述了14个Coprinus属的物种[10]，戴芳澜在《中国真菌总汇》中收录了18种[11]，中国科学院青藏高原综合科学考察队在《西藏真菌》中记录了7种[12]，臧穆、费勇1991年发表了新种Coprinus giganteosporusZang et Fei[13]，应建浙、臧穆在《西南地区大型经济真菌》中记录6种[14]，毕志树在《广东大型真菌志》中记录了6种[13]，卯晓岚在《香港蕈菌》中记录了8种[16]，卯晓岚在《中国大型真菌》中记录了15种[17]，张东柱等在《X大型真菌》中记录了7种[18]，崔波、申进文在《河南大型真菌》中记录了11种[19]，综合国内研究结果，共记载鬼伞属真菌44种。
1.4 Coprinopsis atramentaria和C. romagnesiana的研究意义
鬼伞类真菌因成熟时菌盖自溶成墨汁状这一特征在野外容易被辨认[20]，但鬼伞类真菌种类繁多，部分种之间特征并不明显，无法准确辨认。而且部分鬼伞类真菌如墨汁拟鬼伞，晶粒小鬼伞等虽然可以食用，但也含有毒素，若食用不当会导致中毒。除此之外，部分种还有一定的药用价值。因此对比研究C.atramentaria和C.romagnesiana可以明确这两个种的特征，为可以准确辨别提供依据，使其物有所值，也可以防止因辨识错误出现中毒等情况。
2标本的采集
野外采集获得大型真菌标本的过程主要包括：野外发现子实体，首先进行拍照记录，并观察其发生地点、生态习性、生境特点、子实体的宏观特征等，再采集标本，为保持其完整性，需得注意采集包括菌盖表面的附属物、菌环、菌托及地下部分等，并做编号。取小部分蘑菇用薄纸包裹，置于变色硅胶中干燥，作为分子材料，用于提取基因组DNA；剩余样本用35℃-45℃烘箱烘干保存，制作标本。
2.1野外摄影
本文的样本采集地点是甘肃文县尖山自然保护区，针阔叶林混合地带。
2.2习性特征记载
对获得的大型真菌标本进行实体拍照后，先观察记录子实体的发生地点、生态习性、生境特点、子实体的宏观特征及采集日期等信息。最后采集标本，保持其完整性，包括菌盖表面的附属物、菌环、菌托及地下部分等。如果菌盖表面有沙粒、树叶等杂物时，应当在尽可能保持菌盖原状的情况下清理杂物；注意观察菌肉质地、颜色、伤变等情况。
2.3标本保存方法
用灭过菌的镊子或小刀于酒精灯上方从子实体上取一小部分组织用薄纸包裹，与标签一同放入自封袋中，装入适量硅胶吸水干燥，用于后续分子生物学实验；剩余子实体放入烘干机中于35℃-45℃下烘干，干燥后的子实体与标签一起放入自封袋封存，制成干标本，用于形态研究。
3分子系统学研究
采用改良CTAB法及真菌DNA提取试剂盒提取标本总。用特定引物扩增特定片段；用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并送交测序公司测序。所得序列结果输入GenBank数据库中，进行比对，根据比对结果，与同源性最高的物种序列构建系统发育树[21]。
3.1 实验的过程与方法
3.2.1 DNA的提取
DNA提取的具体步骤如下：
取适量实验材料置于1.5 ml离心管，加1小勺石英砂、2小勺聚乙烯基吡咯烷酮、350μL65℃预热的4×CTAB和2 μLβ-巯基乙醇，充分研磨，至糊状，无明显颗粒物为止，再加350μL 4×CTAB液， 65℃温浴2 h，每隔30 min充分震荡摇匀一次；温浴结束，将其冷却至室温，离心管中加700 μL核酸提取液,充分摇匀3-5 min，10000 rpm室温离心20 min；离心结束，转移上清液至新的1.5 ml离心管中，加等体积核酸提取液，充分摇匀3-5 min，12000 rpm室温离心10 min；（4）转移上清液至新的1.5 ml离心管中，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，沉降DNA，充分混匀后于4℃静置沉淀12-24 h；
（5）取出冷冻保存的离心管，待温度恢复到室温之后，12000 rpm室温离心10 min；
（6）弃上清液，加入200 μL的70%乙醇漂洗，12000 rpm室温离心2 min，弃上清；
（7）加入200 μL无水乙醇漂洗，12000 rpm室温离心2 min，弃上清，将离心管置于37℃恒温箱中约30 min，使残留的乙醇充分挥发；
（8）加50 μL双蒸水，摇匀，-20℃保存备用。
3.2.2 PCR扩增
3.2.2.1 PCR扩增引物的选择
本研究所选用的基因片段为：核糖体内转录间隔区（ITS）。
表1 本实验所用ITS片段扩增引物
Tab.1 Primers of ITS fragment amplification used in this experiment
| 扩增片段 引物名称 引物序列 |
| ITS ITS5（正向） 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ |
| ITS ITS4（反向） 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ |
3.2.2.2 PCR扩增
PCR扩增的体系为：2.5 μL的扩增缓冲液、2.5 μL的dNTP，正、反向引物各1 μL，0.3 μLTaq DNA聚合酶，0.5-2 μL DNA模板，最后加入双蒸水定容至25 μL。
用正向引物ITS5和反向引物ITS4对ITS区域进行扩增。PCR程序为：95℃的条件下预变性4 min，进入35个循环；94℃变性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸80 s，循环结束72℃延伸8 min。扩增结束，取3 μL的产物与溴酚蓝溶液混匀，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
3.2.3测序
PCR产物在用DNA纯化试剂盒进行纯化之后，送到生物技术公司进行测序，测序所采用的仪器是ABI3730，测序引物和扩增引物相同。
3.3序列校对、数据汇编和系统发育分析
3.3.1 序列核对
用SeqMan软件打开测序得到的序列进行拼接，同时在拼接前，可以修整质量差的序列以及清除污染序列或者载体序列。最重要的是需要和测序色谱进行对照，核对碱基的准确性，将所得的序列在GenBank数据库中进行blast,与数据库中的序列进行比对，确保所得的序列与研究对象相对应。
3.3.2 矩阵的构建
为了解决Coprinopsis atramentaria和C. romagnesiana中各类群的系统位置及其相互间的系统关系问题，使用ITS矩阵。将本研究所获得的序列与从GenBank下载的序列进行整合，构建矩阵。然后对使用PRANK软件进行比对排序，在BioEdit软件下进行必要的手工调整。
3.3.3分子系统发育分析
采用最大似然法进行分子系统学分析，用Mrmodeltest2.3软件选择其最适碱基替代模型，模型选择标准为Akaike Information Criterion。ITS片段的最适模型分别为：K80+I。
最大似然法分析使用RaxML v7.2.6软件。但RaxML只支持GTR模型，所以联合矩阵的碱基替代模型采用GTR+G；而ITS矩阵的碱基替代模型采用K80+I。 其余参数均为默认值。
3.3.4构建系统发育树
用Clustal X 1.8软件对自测序列及从GenBank下载的同源种序列的rDNA-ITS序列进行比对，比对后的序列用系统发育分析软件MEGA4.1的NJ(neighbor-joining)方法进行计算并开始构建系统发育树，用Bootstrap对系统树进行检验，重复1000次。通过分析进化树的拓扑结构及其稳定性，确定研究标本的物种归属。
本实验构建的系统发育树如下：
图1基于ITS序列构建的系统发育树1
Fig.1Phylogenetic tree constructed based on ITS sequence
4研究结果及讨论
4.1形态学研究
4.1.1Coprinopsis atramentaria形态学特征
墨汁拟鬼伞Coprinopsis atramentaria（图1），又名柳树蘑、柳树钻，是拟鬼伞属中最具有代表性的物种[22]，生长于腐朽的木材或者树根上。子实体群生，幼时呈卵形至钟形，未开伞前，顶部钝圆，菌盖表面和菌柄基部有浅褐色鳞片，颜色为浅褐红色，菌褶很紧密；菌柄污白，中生，长达5～15 cm，粗1～2.2 cm，向下渐粗或者等粗，表面光滑，内部几乎中空，能见海绵状组织；无菌环和菌托形成，只是在菌盖与菌柄分化的时候产生一道明显的印记遗留在菌柄上，使得菌柄下半部分颜色明显深于上半部分[23]；菌肉幼时为白色，成熟后变为灰褐色。墨汁拟鬼伞幼嫩时都是玉白、灰色或者灰黄色，成熟时菌盖张开，菌褶便渐渐变色，暗红转至暗紫，再成褐黑色，最后完全变黑自溶。其孢子便在这墨汁之中，随着雨水的流淌而传播。墨汁拟鬼伞的子实体从产生到衰败的时间很短，环境适宜时一般只有一天寿命。
显微镜观察显示，墨汁拟鬼伞的菌丝无隔，交错连接，有锁状联合；孢子椭圆形，有典型的脐突，深褐色，约7～10 μm × 5～6 μm[24]。
墨汁拟鬼伞的子实体可食用，并具有较高的药用价值，在民间，人们经常用墨汁拟鬼伞的子实体与醋调制成糊状治疗外伤。近代医学界认为，该菌具有降糖降脂的功效[25～27]。墨汁鬼伞与酒同食可引起脸部红肿[28]，心率上升，头晕、恶心、呕吐，并出现呼吸困难等现象，罪魁祸首为鬼伞素，首先由X人 Hatfield 等于 1936 年分离得到[29]。
4.1.2 C. romagnesiana形态特征
C. romagnesiana，菌盖直径6～7cm，成熟前呈圆锥形，有时边缘上卷，呈灰白色，越往外颜色越浅；表面有赭褐色棱纹，从中心发散，呈辐射状，不易脱落；菌褶和鬼伞属真菌相似，成熟后会液化，疏，类似于墨汁拟鬼伞；菌肉白色，柔软易碎，可液化。菌柄圆柱形，中生，长5～8 cm，粗0.5～0.80.6cm，白色，具细条纹，顶部具白霜，近基部有环形带，脆，易碎，和液化，有细小鳞片（图2）。显微镜观察显示：孢子椭圆形，9.0～11.5 ×5.0～5.5μm，光滑，。
群生或丛生在落叶林中，常附着在树桩上。该种的食毒性目前尚不明朗。
4.2 分子系统学研究结果
本研究中对采自尖山自然保护区的四号拟鬼伞属真菌标本zhu3625、zhu3622、zhu3240、ye562进行了一系列的分子系统学研究，包括采用CTAB法提取标本总DNA，扩增ITS片段且测序，并在NCBI中进行BLSAT，结果发现这四号标本属于拟鬼伞属（Coprinopsis）的两个姊妹类群：zhu3622、zhu3625为墨汁拟鬼伞Coprinopsis atramentaria；zhu3240、ye562为C. romagnesiana，通过与同源性高的序列一同构建系统发育树（图1），更证实了这一观点。
从系统发育树来看，zhu3622与zhu3625为同一个种，且有95%的后验概率，更重要的是，它们和Coprinopsis atramentaria并在同一小分支上，后验概率为94%，这说明zhu3622与zhu3625为Coprinopsis atramentaria；zhu3240与ye562聚在另一个大分支上，该分支属于Coprinopsis属的另一个类群：Coprinopsis romagnesiana，zhu3240与ye562是该类群的后验概率为100%，且为同一个种，后验概率为98%。
5. 讨论
通过对C. atramentaria和C.romagnesiana从形态解剖学和分子系统学两个方面的对比研究，发现不论从形态还是系统发育方面，都有一定差别。
形态方面两者从子实体大小、特征、孢子大小、颜色等方面均有不同，具体对比如下表所示：
| 物种名
形态描述 | Coprinopsis atramentaria | C.romagnesiana |
| 担子果 | 小到中型 | 中型 |
| 菌盖直径 | 3.5～8.5cm | 6～7cm |
| 菌盖形状 | 幼时卵形至钟形，成熟后边缘上卷 | 扩初期呈锥形，有时边缘上卷 |
| 菌盖颜色 | 灰白色 | 白色 |
| 表面特征 | 被棱纹，附灰褐色鳞片，边缘呈花瓣状， | 辐射状棱纹，从中心发散 |
| 菌肉 | 薄，初期白色，后变灰白 | 柔软 |
| 菌褶 | 离生或弯生，密，不等长，初期白色至灰白色，后期变成灰褐色至黑色，成熟时与菌盖自溶 | 菌褶和鬼伞属真菌相似，成熟后会液化，疏，类似于墨汁拟鬼伞 |
| 菌柄 | 3.5～15cm×6～22mm，圆柱形，白色至灰白色，向下渐粗，中空，光滑或者被纤维状鳞片 | 5～6×6mm,白色，具有微小的细条纹，近基部具环状 |
| 孢子大小 | 7～10 × 5～6μm | 9.0～11.5 × 5.0～5.5μm |
| 孢子形态 | 椭圆形或者宽椭圆形，光滑 | 椭圆形，光滑 |
| 孢子颜色 | 深灰褐色至黑褐色 | 灰褐色至深褐色 |
| 生境 | 春、夏、秋三季单生或丛生于腐木上或者地上 | 群生或者从生在落叶的树干上或者树干下，也有附着在木材上。 |
从进化树来看，两者在系统发育树上的位置相邻，但不属于同一个类群，是同一个属中的姊妹类群。
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致谢
回首大学四年，时光匆匆，转瞬即逝。这四年是我人生中举足轻重的时光。感谢母校西北师范大学，在我的人生中画上浓墨重彩的一笔，为我的读书生涯画上圆满的句号；在这里，我的知识和人格得到升华，严谨的校风和严格的校训让我在无形中形成积极奋斗，昂扬向上的性格；在这里，我遇到人生导师、知心挚友，在我学业及生活有困难的时候给予我帮助和温暖，这些是我一辈子的财富。
值此论文完成之际，借花献佛，首先感谢生科院各位老师，他们孜孜不倦的教诲使我成长，传授给我的知识和人生道理，我一生受用不尽，正所谓“十年育树，百年育人”，各位老师的品格和态度是我一生学习的榜样。
其次要特别感谢我的导师：xxx老师。在论文写作的整个过程中，老师既是传授知识的学业导师，又是塑造人格的人生导师。为了提升论文写作的实践性和原创性，去年暑假老师赴甘肃文县进行实地考察采集标本时带领我同行。半个月的野外旅程中，我不仅体验到了大型真菌世界的奇妙与魅力，更对科学研究产生无穷的乐趣。从野外的采集标本到论文的完成，让我难以忘怀的是老师诲人不倦的教导风格和一丝不苟的工作态度，以及严谨拼搏的治学风格，值得我一生学习和敬仰。
最后感谢实验室每一位同学，还有论文的写作期间，xxx师姐对我耐心的指导和协助，他们为我付出了珍贵的时间和精力，这一切都让我深深的铭记在心。我深感遇到一个人生导师和耐心的师姐是我在大学里获得的最宝贵的财富。
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