Sporothrix属人畜致病菌缺失基因FADDependentoxidoreductase

　中文摘要：Sporothrix属隶属于Ophiostomatales目，该目大部分为树栖腐生菌，且为木材的蓝变因子，能引起木材质量的下降。Sporothrix属是Ophiostomatales目中唯一含有人和动物致病菌的属。孢子丝菌病的病原体通常是一个双相真菌，酵母相和菌丝相。机体在感染孢子丝菌后临床表型不同：有固定型、皮肤淋巴管型、皮肤播散型和皮肤外型。本课题为了研究Sporothrix属人畜致病菌缺失基因FAD dependent oxidoreductase的进化关系，应用MAFFT7.0和MEGA7.0等生物信息学软件，构建FAD (flavin-adenine dinucleotide) dependent oxidoreductase序列的系统进化树，对基因序列进行鉴定和分析，以明确Sporothrix属人畜致病菌缺失基因FAD dependent oxidoreductase的亲缘关系和系统进化关系。结果可知进化树分成了三个大簇，其中同种属的真菌都聚集在了一起，并且拥有相似的致病性，为孢子丝菌病的临床研究，后续治疗和前期预防起到了指引了作用。

　关键词：申克孢子丝菌复合体、孢子丝菌病、系统进化树。

1.绪论

1.1Sporothrix属的简介

Sporothrix属第一个被描述的物种为申克孢子丝菌，可以感染皮肤，导致孢子丝菌病[1]。其中至少含有4种会引起孢子丝菌病的真菌，且这四种真菌在系统发育上亲缘关系极近，形成一个独立的进化分支[2,3,4,]。Sporothrix属的自然栖息地是土壤和植物材料，申克氏孢子丝菌通过损伤的皮肤或粘膜感染人，孢子丝菌病的特点是可引起皮肤、皮下发生慢性结节性或溃疡性[5]。也可侵犯肺、胃肠道、骨及中枢神经系统,尤其是在糖尿病、酒精中毒、HIV感染、血液恶性肿瘤患者中，但也见于正常宿主[6]。病原菌通过血流播散，引起全身皮肤出现结节、脓肿[7]。

1.2 孢子丝菌病和申克孢子丝菌复合体

孢子丝菌病（Sporotrichosis）是一种由双相真菌申克孢子丝菌复合体（Sporothrix schenckiicomplex）感染引起的常见真菌病，属于人畜共患病[8]。可引起皮肤、黏膜及淋巴管的炎症，有一定地理分布特点，主要流行于全球各地的热带或亚热带地区，以及亚洲的温带地区[9]。研究发现人畜致病菌之所以能够致病必需满足以下几个方面的特征：1）必须具有一定的耐热性，可在37℃条件下生长，因为大部分真菌在超过30℃后会停止生长或者死亡；2）能够到达、附着以及侵入寄主的组织；3）可以分解寄主的组织并能够从中吸收生长所需要的营养；4）能够克服寄主的免疫反应[10]。病变通常局限于皮肤、皮下细胞组织和邻近的淋巴管，最终，这种真菌可以传播到其他器官。或者在极少数情况下，通过呼吸吸入分生孢子可能会导致全身性疾病。并且接种量，宿主的免疫状态，接种菌株的毒力以及创伤接种的深度等因素都会影响孢子体病的不同临床形式[11]。

孢子丝菌病的病原体是在1898年首次分离，在1961年发现这种菌是一种双相型真菌，这是一类有致病性的深部真菌，是指在组织内和37℃培养时呈酵母相，而在普通培养基和室温培养时呈典型的霉菌相的真菌，该真菌能引起皮肤和内脏的感染，有时预后十分严重，是医学真菌中最重要的一组病原菌。1962年，被正式命名为申克孢子丝菌（S. schenckii）[9]。申克孢子丝菌是一种真核生物，不具有流动性和异养性，并在其细胞壁上呈几丁质质。内皮细胞和上皮细胞以及细胞外基质成分的主要粘附对于病原体有效侵入宿主组织至关重要。在自然界中，已发现这种真菌可作为腐生菌生活在腐烂的植被、动物排泄物和土壤中，土壤中的有机物质是菌丝体发育的基础。而感染通常也是通过创伤性接种受真菌污染的土壤，植物和有机物质而发生的[1]。

随着在相关研究的陆续深入，人们将种类的孢子丝菌合称为种复合体（Species complex）。使用钙调蛋白基因（calmodulin，CAL），将申克孢子丝菌复合体（S. schenckii complex），或称为广义的申克孢子丝菌（S.schenckii sensu lato）分为6个种，包括狭义的申克孢子丝菌（S. schenckii sensu stricto）、巴西孢子丝菌（S.brasiliensis）、球形孢子丝菌（S. globosa）、卢里孢子丝菌（S. luriei），以及环境中的墨西哥孢子丝菌（S.mexicana）和白孢子丝菌（S. albicans）[12]。研究显示不同菌种在地理分布、毒力、致病能力、临床表现、药物敏感性等方面均存在差异。比如球形孢子丝菌（S.globosa）主要引起固定型皮肤病变[13]。有研究发现孢子丝菌复合体自1955年以来就已经存在于临床病例的集合中，使用具有免疫功能的小鼠模型对5种具有临床意义的孢子丝菌进行研究，结果表明：巴西孢子丝菌（S. brasiliensis）和申氏孢子丝菌（S. schenckii）是最强毒的物种，并且致病机制可能具有物种特异性，且对唑类抗真菌药物敏感性最好，球形孢子丝菌（S. globosa）的毒力居中，对特比萘芬的敏感性最好，其次为伊曲康唑，对氟康唑敏感性最差，墨西哥孢子丝菌（S. mexicana）、卢里孢子丝菌（S. luriei）的毒力次之，白孢子丝菌（S. albicans）的毒力最弱，且对唑类抗真菌药物敏感性较差[8]。近年来动物感染的病例报道日渐增多，贺羽等对我国南、北方地区50株临床孢子丝菌进行菌种鉴定，结果显示目前我国南、北方地区孢子丝菌病的主要致病菌种是球形孢子菌[14]。它也广泛分布于全球各大洲，侠义的申克孢子丝菌同样分布广泛，但以美洲居多，在亚洲主要分布于日本。巴西孢子丝菌仅见于巴西，常常导致动物传播和人畜共患[15]，巴西地区也因出现该病的暴发事件而备受国际关注。卢里孢子丝菌目前报道很少，只有数例人类病例和动物感染的报道[16]，墨西哥孢子丝菌也偶有报道。孢子丝菌病作为一种人兽共患病，其发病率逐年上升，出现多次暴发流行，因此了解Sporothrix属人畜致病菌缺失基因的进化关系与致病力相关的研究对于疾病的诊治及预后至关重要。

1.3 目前孢子丝菌病的简况

孢子丝菌病呈全球性分布，在X、南美（哥伦比亚、巴西、墨西哥、秘鲁）、亚洲（中国、日本、印度）、澳大利亚均有报道，在热带及亚热带地区最高发病率可达2.5%，感染情况已上升至流行状态，造成了引起国际关注的公共卫生事件，世界卫生组织将其归为“被忽视的热带病”[17]。

孢子菌病能够影响到所有年龄和性别，在大多数地区，分布的差异与工作者的职业和真菌接触有关[18]。多数患者为“接种感染”，多因外伤发生而造成感染的劳动者中大多从事农业、园林艺术、药材培植、养殖业、造纸行业等[1]；极少部分免疫抑制者患肺孢子丝菌病是因其吸入了孢子所致的，很少见玉人际传播。通常在个别病例或家庭或从事高风险活动的专业人员中孢子菌病会小规模暴发[9]。

球形孢子丝菌（S. globosa）是我国主要的流行菌株，在孢子丝菌复合体中其致病性居于中上水平[19]。在我国很多地方都曾分离得到过具有感染小鼠并致病的能力的孢子丝菌，比如在吉林的农村地区，内蒙古自治区乌兰浩特，以及我国东南部的土壤、腐烂的木材、树皮、枯枝、玉米秸秆等物质中[20,21,22]，这可以说明在自然界中作为一种腐生菌而普遍存在的孢子丝菌其感染途径可以通过外伤接种等。在我国，报道的病例数量较多的是东北地区，其他地区如长江流域（四川、江苏等）地区流行情况也较为严重。淋巴管型在国际上报道多见，而在我国病例中以由皮损造成的固定型为主，知识由于上肢和面部等暴露部位最易被感染而产生皮损[9]。在巴西等地，通过动物如小鼠，犰狳，松鼠，狗和猫等抓咬也是本病的传播途径，但不常见于人畜间及人与人之间的传播[23]。孢子丝菌病即可大规模流行，也可地方性小范围流行或职业性流行。比如在日本女性患者多见，这是由于女性参与农业活动更多[24]。

1.4孢子丝菌病的毒力因素和预防措施

孢子丝菌在进化过程中发展出能够削弱机体免疫系统的功能一系列毒力因子，从而避免被完全消灭，目前研究显示影响孢子丝菌毒力的因素主要有黑色素及粘附力[25]。

黑色素是一种分子量很大、难溶于水、耐酸耐热、负电性的聚合物，可以保护真菌细胞免受宿主巨噬细胞的攻击、具有抗吞噬抗氧化能力、提高了其在巨噬细胞内的生存能力。事实上，在生物界当中，不管是低等的单细胞生物，或者是植物，还是动物以及人类，其实都能够合成黑色素，而且这些所有合成的黑色素能够给机体自身提供伪装性的保护色，阻挡紫外线的损伤，降低自由基的损害等等，大多都具有保护功能。并且在有些主要针对病原真菌的研究结果中知道，其实真菌颜色的深浅与它的致病力有很大关系，侵袭力和毒力的大小往往是由黑色素的含量决定的，黑化的程度越高，其毒力就会越强[26]。孢子丝菌在不同温度下会发生双相转化，在25℃时能够合成黑色素，主要呈现为菌丝相，当在37℃的条件下时也就是侵入机体之后，会发生转化，菌丝相转化为酵母相，所以酵母相就是孢子丝菌的致病相。也有相关研究观察孢子丝菌在37℃下培养时它的表型，得到结果发现虽然其酵母相菌落呈现出白色或者黄白色，但是仍有一定量的黑色素存在于酵母细胞的细胞壁中，这就揭示了黑色素在机体感染早期最为重要，并且黑色素在孢子丝菌感染人体的整个致病过程中可能都有参与。

增强菌体表面粘附力能够增加其致病能力和降低抗真菌药物的药效等，内皮细胞和上皮细胞以及细胞外基质成分的主要粘附对于病原体有效侵入宿主组织至关重要。申氏孢子丝菌和酵母细胞都能够识别来自细胞外基质的三种重要糖蛋白：纤连蛋白，拉米宁和II型胶原[28]。纤连蛋白粘附素位于酵母细胞表面，其表达与真菌毒力有关[29]。这些粘附素的存在将有利于宿主组织的粘附和真菌在全身的传播[30]。这些分子在申氏孢子丝菌中的表达可能与毒力有关，因为它们的优先表达是在真菌寄生而不是腐生的形式。

通常二型性也被认为与真菌的致病力相关。很多人畜致病真菌在室温条件下为菌丝状，但是当外界环境变化，尤其是温度升到30℃以上后，便会改变生长模式，转变为酵母状。酵母状相对于菌丝状更容易在寄主体内扩撒，并且更容易附着和侵入组织细胞。该特性在其它非人畜致病菌上偶尔也能发现，比如榆树枯死病的致病菌和其潜在致病菌就有发现[31]。另外黑化作用以及各种蛋白酶、水解酶和脲酶的产生也被认为是致病因子相关[1]。

研究可知，宿主的免疫状态被看作是导致孢子丝菌病不同分型的主要原因，固定型孢子丝菌病往往在免疫力较强时形成；而免疫力较弱时，真菌则容易在机体内迁移形成淋巴管型孢子丝菌病，有时甚至是播散型孢子丝菌病[32]。目前对于孢子丝菌需要联合系统性治疗，体外药敏试验是临床治疗选择药物的依据之一，可以评价抗真菌药物的活性。目前在临床治疗中抗真菌药物伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素Ｂ被广泛应用，对皮肤型及皮肤外型均有良好效果。主要在我国的流行株球形孢子丝菌对特比萘芬的敏感性最好，其次为伊曲康唑[8]。

孢子丝菌可以感染所有性别和年龄，所以对其的预防是必不可少的。在处理例如水苔，电线，玫瑰丛，干草，针叶树（松树）幼苗或其他可能有助于暴露于真菌的材料时，要佩戴手套和长袖以及穿靴子，以避免通过切开或刺穿皮肤引起真菌感染。该病是人畜共患疾病，动物感染中最常见的是猫感染，在受伤治疗或药物治疗期间，应该使用乳胶手套以减少真菌的接触，以避免物种内部以及从动物到人类的传播[33]。

2. 构建基因FAD dependent oxidoreductase的系统发育树

2.1 引言

FAD (flavin-adenine dinucleotide) dependent oxidoreductase是以 FAD为初级电子受体的酶。在 Monascus类真菌中，MrPigF是编码FAD-dependent oxidoreductase基因。该基因与真菌色素形成相关。而色素的形成往往影响真菌的致病力。在Cercospora nicotianae中，CBT7也是编码FAD-dependent oxidoreductase基因，该基因与cercosporin类真菌毒素的合成相关。有趣的是cercosporin是一种褐红色的毒素[34,35]。前期研究对比了Sporothrix属中的致病菌和非致病菌，以及Ophiostomatales目其它种的全基因组，发现FAD基因在所有Sporothrix属中的致病菌中是缺失的(未发表)。

基因的缺失与寄主和致病力的改变相关。许多致病菌在适应新的寄主时都会伴随某些基因功能的丧失，这主要通过点突变、基因片段插入或基因丢失来实现的[36]。其实基因的丢失，尤其是次生代谢产物相关基因的丢失，在人和植物致病菌中经常被报导[36,37,38,39,40,41]。前期研究发现Sporothrixspp.致病菌中缺失很多与降解植物组织相关的酶类[42]。

2.2 课题研究的材料，方法和步骤

2.2.1 材料：基因FAD dependent oxidoreductase的序列

2.2.2 研究方法和步骤

利用同源性比对的方法对Ophiostomatales中的FAD基因的蛋白质序列在X国立生物技术信息中心(NCBI)蛋白质数据库中的BLAST功能进行比对，并下载相关的序列。在浏览器中搜索NCBI官网，进入NCBI后在blast中输入基因的序列，在Program Selection部分选择Algorithm blastp (protein-protein BLAST)选项，其它选择默认选项，点击BLAST，然后在Alignments中下载完整的FASTA序列,并对文件进行重命名将其保存为FASTA文件。

序列下载后使用MEGA[43]软件，保留所得序列的号，种名以及序列，删除不需要的部分。然后通过MAFFT[44]分析，在选项中修改我们需要的条件，在UPPERCASE/Lowercase中选择第二项让氨基酸序列都大写，在Direction of nucleotide sequens中选择第二项调整序列顺序，其它都为默认选项，提交之后输出结果，全选并复制所有调整好的序列然后粘贴在一个新的MEGA比对文件中（在新建过程中选择蛋白质选项），检查序列没有问题后分析结果使用MEGA进行编辑，去除序列开始和尾端的没有对齐的序列，并对序列中出现的错误碱基和短的缺失序列进行修正，修正后的比对序列通过MEGA软件导出。

在MEGA中打开从MAFFT得到的序列，点击Data选择系统发育分析，建立了一个新的文件，将文件最小化，在数据分析里面选择最大相似性分析(ML)和最大简约法分析(MP)，对当前激活的数据进行分析，并修改相关的参数，在Test of Phylogeny中选择用Bootstrap method,数据输入500，其它都为默认选项，然后进行计算，得到两个不一样的系统发育树。然后点击View再选择Arrange Taxa中的For Blanced Shape调整树形，因为在系统发育树的数值中低于75的数值是不可信的，所以在branch中输入75以隐藏低于75的数值。通过File中的Export Current Tree输出系统发育树。

将导出的系统发育树在PowerPoint中进行最后的编辑。将隐藏了不可信数值的ML系统发育树复制粘贴到一个新的PPT当中，设置纸张为A4纸且竖直方向，对图片进行编辑，调整系统发育树在纸张中的树形。对比两个系统发育树，将MP系统发育树中Bootstrap value整合到ML发育树上，用斜杠隔开，相当于把两个系统发育树规整为一个更加便于观察和分析的发育树。

2.3 课题研究的结果

对基因FAD dependent oxidoreductase的氨基酸序列进行种属分布分析，结果显示，相似性最大的100条序列中，43条属于曲霉属（Aspergillus），12条属于镰刀菌属（Fusarium），16条属于炭疽菌属（Colletotrichum），6 条属于炭团菌属（Hypoxylon），4 条属于青霉属（Penicillium），2条属于黑腐皮壳属（Valsa），轮层炭壳菌属（Daldinia）,丛赤壳属（Nectria）和孢子菌属（Phialemoniopsis），其余篮状菌属（Talaromyces），红曲霉属（Monascus），木霉属（Trichoderma），鞘孢属（Chalara），晶杯菌属（Hyaloscypha ），锥毛壳属（Coniochaeta），弯孢壳属（Eutypa），炭角菌属（Xylaria），蓝菌属（Grosmannia），蛇口壳属（Ophiostoma）等均为1条。对基因FAD dependent oxidoreductase蛋白序列的系统发育树进行分析，结果显示进化树中聚类成3簇（即A,B和C簇）。

A簇：主要为曲霉属、镰刀菌属、青霉属、炭团菌属、红曲霉属和木霉属。但是曲霉并没有聚集成单一的分化枝，其中20种曲霉聚齐成单一亚分化支，与篮状菌属、镰刀菌属聚集在一起，这当中包含多种食源性霉菌。另外20种曲霉属再另外聚集成独立的亚分支。

B簇：相对较小，包含镰刀菌属、丛赤壳属、曲霉属和轮层炭壳菌属。其中镰刀菌属聚集在一起形成独立的亚分支；曲霉菌聚集在一起形成另一个亚分支。该簇中的镰刀菌很多是植物致病菌。

C簇：主要包含炭疽菌属、黑腐皮壳属、孢子菌属、蛇口壳属、蓝菌属、弯孢壳属、轮层炭壳菌属、炭团菌属、锥毛壳属、晶杯菌属、鞘孢属。其中蓝菌属、孢子菌属、蛇口壳属为Ophiostomtales目。该簇大部分以植物为寄主，有些是植物的致病菌。

2.4 课题研究的结论和讨论

系统进化树既是基因亲缘关系的衡量依据，也可作为基因进化速率的相对判断标准。从FAD序列得到的系统进化树与物种本身的进化关系并不一致，说明不同FAD基因的进化速率是不同的。

在A簇当中，曲霉属分成两个分支，分支内的相似度很高，说明这些曲霉属中的真菌在进化关系上可能具有同源性。在这个系统进化树上第一个分支里曲霉属很多都会造成人畜致病，例如A. brasiliensis、 A. niger 、A. awamori、A. kawachii等都会造成人畜致病。在另一个分支里的曲霉属也会造成人畜致病，比如黄曲霉（A.flavus）的毒素可以抑制人畜蛋白质的合成，对人畜的肝脏组织由破坏作用，严重时，还可导致肝癌甚至死亡[45]；小曲霉菌（A. minisclerotigenes）会引起人类的真菌性角膜炎[46]；黑曲霉（A. nomius）会造成犬类的皮肤疾病[47]；曲霉属中最常见的致病形式是引起人畜的角膜炎，一般情况不会造成死亡。与第一个分支亲缘关系较近的镰刀菌属通常会造成植物感染或者通过饮食中污染的镰刀菌毒素而对机体造成多种病理损伤[48]。

B簇中镰刀菌属和曲霉属聚集在一起，具有较近的亲缘关系。B簇的镰刀菌属和在A簇中的有所不同，B簇中主要是引起花卉致病，造成人畜感染的较少。

C簇中炭疽菌属都会引起植物致病，但不造成人畜致病，它们完全聚集成一个独立的进化分支，说明它们的亲缘关系都很近。C簇中包含Ophiostomatlaes目中的菌种，这些菌与Sporothrix 属中的致病菌亲缘关系较近。这些菌多为木材的蓝变因子，不是动物的致病菌。该簇中的其它菌也大部分以植物为寄主或是植物的致病菌。由此推测，致病菌中缺失的FAD可能在侵染动物寄主的过程中不发挥作用，而且不是真菌生存所必需的基因，所以在进化的过程中丢失了。

该研究分析了系统进化树之后可以发现，相同种属的真菌大都聚集在一起，并且拥有相似的致病力，亲缘关系都比较近。但有些真菌虽然是相同的属而且拥有相似的致病力但是相似度不高，这说明这些真菌在进化过程中可能发生过突变，从而产生了新的分支，目前对这一现象研究较少，这些讨论都有待进一步研究探讨。

构建Sporothrix属人畜致病菌缺失基因FAD dependent oxidoreductase的系统进化树可以让人们直观认识到基因FAD dependent oxidoreductase的进化，为进一步对致病菌致病机制的实验研究起到一定的指引作用，可以用来评价基因或蛋白在进化过程中的演变和亲缘关系。

Sporothrix属人畜致病菌缺失基因FADDependentoxidoreductase

图:Sporothrix属人畜致病菌基因FAD dependent oxidoreductase的系统进化树（斜杠前面的数是由最大似然法构建的进化树得到，斜杠后面的数是由最大简约法构建的进化树得到，横杆表示得到的数小于75%，可信度不高）

4. 致谢：

路漫漫其修远兮，吾将上下而求索，四年的大学生活即将画上句号，在这个炙热的夏天，我也即将踏上人生新的旅程。

学贵的得师，亦贵的友。三生有幸遇见学识渊博又平易近人的老师，感谢每一位在我学习和生活上帮助过我的老师们，在此特别感谢我的论文指导老师，名如其人，时常温润如玉又而光明磊落。在整个论文的写作过程中，都是老师耐心指导，竭尽全力的帮助我，再次感谢老师对我的指导和关怀。

平生感知己，方寸岂悠悠。感谢我的室友们四年来对我的包容和关怀，理解与支持，祝大家以后都前程似锦。

同时感谢我的父母，含辛茹苦养育我，默默支持我，他们的无私奉献和爱是我前进路上的动力，祝我的家人幸福健康，平安喜乐。