PPAR-γ抑制剂T0070907抑制破骨细胞生成及拮抗小鼠卵巢切除诱导骨量丢失

1引言

骨稳态环境的动态平衡是破骨细胞的再吸收和成骨细胞的不断生成共同维系的结果(1,2)，过度的破骨细胞活动会导致骨质疏松等骨代谢疾病(2)。骨质疏松症被认为是一种以骨量减少、骨组织构造异样、骨脆性及骨折增多为特性的慢性病症，现已变成世界性的公共卫生难题(3)。当前世界有10.2亿左右的人口罹患上骨质疏松病症，预计到2030年，人数将增加至13.6亿(4)。OPG/NF-κB激活RANK/RANKL复合物应是一个在骨新陈代谢中起极其重要调节作用的子系统，调控成骨细胞介导的骨基质制备以及破骨细胞介导的骨吸收进展的动态平衡(5)。RANKL是一种与骨代谢有着密切联系的细胞因子，积极参加到破骨细胞的动态形成过程中，推动破骨细胞的成熟与分化(6)。RANKL-RANKL复合物（RANKL受体）可以引发调节因子（如TRAF 6基因）的秩监测分离及其随后的MAPK激活(7,8)，从而上调NFATc1和c-Fos的表达水平，诱导破骨细胞的发生(9)。OPG应是由成骨细胞分泌的可溶性蛋白质，借助和RANKL竞争结合的手段而进一步提高骨密度，达到抑制骨吸取的最终目标(10)。RANKL/OPG的值能视为骨量与骨质安全的极其重要指标(11)。因而，由RANKL管理控制的信号源通路可以成为骨细胞的生物降解等病症的药理靶点(12)。

抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）的药物因其阻碍多种癌细胞生长的巨大潜力而成为众多课题研究的对象。PPAR-γ不仅介入到成骨细胞的生成过程中(13)，同时其在破骨细胞中的表达水平也可以被彻底上调(14,15)。PPAR-γ被公认为外源性药物的药理靶点(16)，因为PPAR-γ特异性抑制剂导致骨吸收，从而导致骨吸收的增加(17,18)。虽然在目前的一些研究工作中报道，PPAR-γ在破骨细胞诱导骨病变病理生理中的作用尚不清楚，尚待进一步阐明。

T0070907（T007；PubCheM数据库SID：53790303）已被发现并证明是PPAR-γ的有效和高特异性的竞争对手(19)。以往的体外研究表明T007对PPAR-γ有抑制作用(20)。此外，T007还具有抑癌特性(21,22)。例如，先前有研究显示T007调节PPAR-γ的表达以阻碍乳腺恶性肿瘤的发育和活力(21)。并且，T007以PPAR途径(23)作为细胞粘附和侵袭的抑制剂，在特定肝癌细胞系中诱导失巢凋亡。鉴于上述PPAR信号通路的调节特性，我们推测该基因可能代表了克服骨代谢疾病的新方法。因此，我们的目的是探讨T007对破骨细胞的作用特性，尽可能破译T007介导的破骨细胞发生机制，并用小鼠卵巢切除模型检测T007对骨质疏松症骨丢失的治疗作用。

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要实验试剂与材料

2.1.2主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1原代细胞的分离提取与培养

1. 骨髓巨噬细胞（BMMs）：把6周龄左右大小的雌性C57BL/6小鼠,将其处死，在将整个小鼠置于75%乙醇中浸泡5分钟后取出，放在培养皿（10cm）中。用已经完成灭菌的医用剪刀等器械将小鼠股骨和胫骨取下并尽量剔除附着的肌肉组织。用1xPBS溶液清洗后，一手持眼科镊夹持股骨或胫骨，另一只手用医用眼科剪刀剪断股骨或者胫骨的两端，然后吸取1mlα-MEM完全培养基（10%血清+1%青霉素/链霉素+30ng/mL M-CSF），将骨髓血冲出到10cm培养皿中反复吹打混匀，48小时后放置在37°C、5%CO2的培养箱中培育。

2. 骨髓间充质干细胞（BMSCs）：取雌性C57BL/6小鼠（约2-4周龄）颈椎脱臼处死，将整个小鼠置于75%乙醇中浸泡5分钟后取出，在无菌条件下从小鼠后肢踝关节处剪开皮肤，并向髋部分分离至骶尾椎，取两侧股骨和胫腓骨，剔除多余组织，用1ml无菌注射器，反复抽取含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基轻柔冲洗髓腔至少五次，并用1ml移液器反复吹打混匀骨髓血，将其吹打散开混匀再接种至25cm2培养瓶中，48小时后放置在37°C、5%CO2的培养箱中培育。

3. 原代成骨细胞（OB）：取新生1周内的C57BL/6小鼠的颅盖骨，放入预冷PBS中，清除附着的肌肉等结缔组织，PBS洗三次，将其置入盛有10%血清、1%青霉素/链霉素DMEM培养基的培养皿中，剪成约0.8mm×0.8mm大小的碎块，加入0.25%胰蛋白酶10ml培育30分钟，之后再加入1.0g/LⅠ型胶原酶15ml培育1小时，取上清以1000rpm/分钟离心15分钟，使细胞沉淀，收集消化所得细胞，PBS洗三次，重悬细胞，均匀接种至25cm2培养瓶，放置于37°C，5%CO2的培养箱中，48小时后更换上述条件培养基并继续培育。

2.2.2CCK-8测定药物毒性范围

1. 检测T007对BMMs的细胞毒性：当提取的细胞达到80-90%的融合度时，吸弃上层培养液，用1xPBS缓冲液清洗三遍，加入适当胰蛋白酶消化。在倒置显微镜下观察，待细胞开始变圆，加入混有10%血清的培养基停止消化，随后将消化后的细胞刮下并转至15ml离心管中，室温离心800rpm5分钟。弃上清，加入完全培养液重悬，并细胞计数以每孔2×104个细胞数接种于96孔板，并设置三个重复。24小时后换液：T007（0、0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6μM）+30ng/mL M-CSF的培养基，继续培养48和96小时。然后每孔加入CCK-8液体10μL，混匀37℃孵育2小时，于450nm波长处测量吸光度。

2. 检测T007对BMSCs和OB的细胞毒性：当提取的细胞达到80-90%的融合度时，吸弃上层培养基

加入适当胰蛋白酶消化。在倒置显微镜下观察，待细胞开始变圆，加入混有10%血清的培养基停止消化，加入混有10%血清的培养基停止消化，随后将消化后的细胞刮下并转至15ml离心管中，室温离心800rpm5分钟。弃上清，加入完全培养液重悬，并细胞计数以每孔1.5×104个细胞数接种于96孔板，同时设置三个重复。24小时后换液：T007（0、0.078125、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM）的新鲜培养基，继续培养48和96小时。然后每孔加入 CCK-8液体10μL，充分混匀后置于37℃孵育2小时，于450nm波长处测量吸光度。

2.2.3细胞转染

2.2.3.1PPAR-γ过表达实验：BMMs、OB和BMSCs细胞铺床以后密集程度高达80%-90%，使用Lipofectamine 3000进行转染空白对照质粒和PPAR-γ质粒。接着展开相应细胞的分化诱导实验。主要操作如下：

1. 转染前日，将细胞铺板于6/24/96孔板中，培育细胞至汇合度达90%左右；在新的1.5ml的EP管中将10/2.0/0.5μl Lipo3000与250/50/25μl Opti-MEM培养基充分混匀成A管，室温静置5分钟；将250/50/25μlOpti-MEM和4.0/0.8/0.2μg PPAR-γ/空白对照质粒混匀于另一灭菌1.5ml EP管中（B管）。将A、B两管混合，室温孵育15-20分钟；

2. 再将以上混合溶液分别置于6/24/96孔板中，并补足培养基至2000/500/100μl；转染24-72小时后，开始进行细胞分化实验。同时提取RNA，使用荧光定量PCR验证过表达效率；提取蛋白质，通过免疫印迹检测过表达效率。

2.2.3.2 PPAR-γ沉默实验：BMMs、OB和BMSCs细胞铺床以后密集程度高达30%，用Lipofectamine 3000进行转染对照siRNA和PPAR-γsiRNA。主要操作如下：

1. 转染前日，将细胞种植于6/24/96孔板中，培育细胞至汇合度达30-50%；在一新的1.5ml EP管中将5.0/1.0/1.2/0.25μlLipo3000与250/50/25μlOpti-MEM培养基充分混匀；在另一1.5ml EP管中将250/50/25μlOpti-MEM和100/20/5pmol siRNA/Negative Control充分混匀。在每管已稀释的Lipo3000试剂中加入稀释的siRNA/Negative Control，室温孵育15-20分钟。

2. 将孵育结束的混合溶液分别的加入6/24/96孔板中，并补足完全培养基至100/2000μl；转染24-72小时后进行细胞分化实验。同时提取RNA，使用荧光定量PCR验证沉默；提取蛋白质，通过免疫印迹检测沉默效率。

2.2.4体外破骨细胞分化实验

将BMMs以8×103个细胞每孔的密度种入96孔板，并设置三个重复。次日弃去上清，更换为含有30ng/mL新鲜的完全培养基(M-CSF+50ng/mL RANKL+T007（0、0.15、0.3、0.6 μM）)的隔日更换培养基，培养至破骨细胞形成后，弃上清，用PBS缓冲液轻洗细胞三次.然后用4%多聚甲醛固定20分钟。固定结束，弃去多聚甲醛固定液，再次用PBS缓冲液清洗三遍，然后加入配制好的TRAP染液，放到37度温箱中进行孵育染色。染色完毕，弃去TRAP染色液，并用PBS缓冲液轻轻的洗一遍。置于光学显微镜下进行观察并拍照并进行数据分析。

2.2.5骨吸收实验

BMMs细胞计数后以8×103/孔提前接种于96孔板中的牛骨片→24小时后更换为含有30ng/mL M-CSF、50ng/ml RANKL和T007（0、0.15、0.3、0.6 μM）的培养基分别进行分化诱导→隔日更换上述条件培养基→弃掉培养基，用1XPBS缓冲液洗涤三次→取出牛骨片，用软毛刷温柔地擦牛骨片正面，然后用PBS缓冲液洗涤三次→待牛骨片表面干燥后，用显微镜或扫描仪对着色矿化结节进行观察、扫描→采用Image J分析软件（National Institutes of Health，NIH）对矿化结节面积进行分析。

2.2.6体外骨髓间充质细胞与原代成骨细胞分化实验

BMSCs/OB细胞接种于12孔板，24小时后换液：（10%血清+50μg/mL抗坏血酸+10mM β-甘油磷酸钠+不同浓度T007（0、0.075、0.15、0.5 μM）的DMEM培养基），隔日换液。分别于第7天,弃培养基，PBS缓冲液洗三遍，然后用4%多聚甲醛室温固定30分钟，弃上清，用PBS洗三遍，之后用BCIP/NBT试剂盒检测成骨细胞活性指标碱性磷酸酶（ALP）活性；第21天弃上清，用PBS缓冲液洗三遍，然后用4%多聚甲醛溶液室温浸泡30分钟固定细胞。弃上清，用PBS缓冲液洗三遍，后行1.5%茜素红（ARS）染色（PH4.2）以检测成骨细胞矿化沉积能力。

2.2.7RNA提取与实时荧光定量PCR实验

2.2.7.1RNA提取：

1.细胞按照相应处理方式培养结束后，弃掉上清，用预冷PBS缓冲液轻轻洗三遍。每10cm2加入TRIzon Reagent1ml ，反复吹打均匀使样本充分裂解，室温静置3分钟；

2.按照 TRIzon Reagent：氯仿=1：200的比例混合试剂，涡旋震荡仪剧烈震荡10秒，室温放置3分钟；然后将上述实验步骤所得物于4℃离心12,000 rpm10分钟，接着将含有RNA的上层水相转移到一个新的RNase-Free离心管中；

3.向新的RNase-Free离心管中加入同等体积的70%乙醇（RNase-Free Water配制），充分颠倒混匀。之后转移到装有吸附柱的采集管里（吸附柱上含有Resin合成树脂，具有吸附DNA的功能），12,000 rpm15秒，弃采集管中的液体，将吸附柱再次装入至采集管中；

4.继续加入700μl的缓冲液RW1，4°离心12,000 rpm15秒，弃废液，把吸附柱重新放于原采集管中。然后加入缓冲液RW2500μl，4°离心12,000 rpm15秒，弃掉液体，将吸附柱再次装入采集管中。重复上述步骤1次；以12,000 rpm离心3分钟，弃废液，室温静置吸附柱5分钟；

5.把吸附柱放入另外灭菌备好的无酶离心管中，并于吸附柱中间部位加入无酶水40μl，室温放置2分钟，4°离心12,000 rpm1分钟，收集RNA溶液，测定RNA浓度记录OD值。将RNA样本继续逆转录为cDNA为后续实验准备或者放于-80℃长期保存。

2.2.7.2RNA逆转录：采用20μl反应体系，根据试剂盒说明书在冰上配制；反应条件设置为：42℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。完毕之后，取出产物并进行后续的荧光定量PCR实验。

表2.1逆转录体系

2.2.7.3实时荧光定量PCR：根据表2.2配置相应的q-PCR反应体系，各种引物序列见表2.3。反应结束后制作标准曲线，并用2−ΔΔCT法计算相对表达量等。

表2.2实时荧光定量PCR配置体系

表2.3实时荧光定量PCR引物序列

2.2.8免疫印迹实验

1.提取细胞总蛋白：收集待检测的细胞，弃去培养基，用预冷PBS缓冲液清洗三遍后，加入混有PMSF和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰上裂解30分钟。将得到的裂解液体全部移至1.5ml离心管中，4℃ 12000 rpm，离心15分钟，再装到新的1.5ml 离心管中。之后取上清液，按照表2.4完成蛋白浓度的测定：

表2.4BCA测蛋白浓度加样表

备注：BSA：0.5mg/ml（取25mg/ml BSA标准品20μl加入980μl稀释液）；

BCA：（A：B=50：1）

2.SDS-PAGE电泳：取上清加入4×SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀后在95-100℃水浴锅中煮样5-10分钟，-20℃备用。按照表2.5配制PAGE胶。然后将上述蛋白样品进行电泳。上样每孔约10-20μl。开始电泳时保持浓缩胶的电压为70-90V，当蛋白样品移至分离胶时，电压调校为100-150V。当电泳染料抵至胶底部时，关闭电源并准备转膜。

表2.510%分离胶和4%浓缩胶

3. 转膜：裁剪一块与凝胶大小相似的PVDF膜（一般为6厘米×9厘米大小），使用甲醇激活约1分钟。将滤纸放在已经配制好的转膜液中浸泡充分湿润，按照阳极到阴极的顺序依次安装转膜装置。将其置于转膜缓冲液中，盖上电泳仪的盖子，外部用碎冰覆盖以吸收转膜过程中产生的大量的热量。按下电源开关键，参数设置为电流250mA开始转膜约120分钟。

表2.6电泳以及转膜缓冲液配制

4. 封闭：取出PVDF膜并放入5%脱脂牛奶中（TBS-T配制），室温置于摇床上缓缓摇动，封闭1小时即可。

5. 孵育一抗：封闭结束后，将PVDF膜取出，使用TBS-T缓冲液清洗PVDF膜一遍。随后将膜取出并进行裁剪。然后将裁剪后的PVDF膜放入配制好的一抗中（一抗稀释液或者5%BSA配制），4°C冰箱中的摇床缓慢孵育过夜。

6. 孵育二抗：取出在4°C冰箱孵育过夜的PVDF膜，然后用TBS-T于室温摇床上洗膜三次，每次15分钟。然后将膜浸入配制好的不同种属的二抗中（与一抗相对应），室温摇床缓慢孵育1小时。

7. 显影曝光：完成二抗孵育，将PVDF膜取出，室温摇床上TBS-T缓冲液洗膜三次，每次15分钟。随后用ECL发光液检测蛋白条带，使用Image J软件定量灰度值。

2.2.9免疫荧光实验

1.细胞爬片制作：先将细胞爬片专用圆片置于六孔板中，随后将消化后的细胞经过计数后种植于六孔板中，培养24小时；加入相应的处理，并刺激一定时间；

2.固定与破膜：处理结束，依次弃去培养基溶液，PBS洗3遍，4%多聚甲醛浸没30分钟，再用PBS洗3遍；破膜：将0.1%的Triton溶液加入，室温处理20分钟，之后PBS洗3遍；

3.封闭：加入10%封闭用山羊血清（100μl山羊血清原液+900μlPBS）室温封闭60分钟（不可让细胞干燥，应在弃掉PBS液体后立即加入）；

4.抗体孵育：一抗：封闭结束后，弃封闭液，加入已经按照说明说配制好的一定浓度的一抗，于4℃冰箱孵育过夜；二抗：孵育结束后，弃掉原来的一抗，然后再用PBS液体洗3次，每次10分钟。第三次结束，弃掉PBS，立即加入经过适当稀释的对应二抗，室温避光孵育60分钟（注意：从此步骤开始，后续步骤均注意避光）；

5.鬼笔环肽染色：二抗孵育结束，弃掉原有的二抗液体，并PBS洗3次，每次10分钟。然后加入经过适当稀释后的鬼笔环肽，室温孵育30分钟（用于破骨细胞F-actin环染色）；

6.DAPI染核：上述步骤结束，弃掉上清液，然后用PBS洗3次，每次10分钟。加入经过适当稀释后的DAPI染液，室温染色5分钟。随后起到DAPI染液，用PBS洗1次，10分钟；

7.封片和观察：采用90%甘油封片。避光4℃保存，在荧光显微镜下观测并记录。

2.2.10小鼠骨质疏松模型的建造

本课题中涉及到的所有动物研究都是按照X国立卫生研究院（NIH）的指南和浙江大学医学院附属邵逸夫医院的实验动物护理以及使用规程进行的，实验方案是在经过邵逸夫医院伦理委员会允许下执行。

1.实验动物分组及标本处理：8周龄C57BL/6雌性小鼠20只随机分为4组，假手术组（sham组）；空白对照组（vehicle组）、低药物浓度组（low-dose组）和高药物浓度组（high-dose组）小鼠进行双侧卵巢切除术。术后low-dose组注射0.5mg/kg T007，high-dose组注射2.5mg/kg T007，sham组和vehicle组腹腔注射PBS，隔日注射一次。在处死前第3及7天腹腔注射钙黄绿素染液。6周后，将小鼠处死，分离小鼠子宫并称重以评估卵巢切除术效果。分离小鼠一侧股骨、胫骨，用4%多聚甲醛固定后行micro-CT扫描，之后脱钙、包埋、切片行H&E、TRAP染色以及钙黄绿素荧光检测等组织学观察。取小鼠另一侧胫、股骨，提取RNA及蛋白质进行荧光定量PCR和免疫印迹实验以评估T007对体内PPAR-γ和破骨特异基因表达的影响。

2.小鼠卵巢摘除手术：将小鼠麻醉后，背部朝上体位放置。于小鼠两后肢连线中点于后正中线交点开始，皮肤消毒后，用灭菌后的眼科剪向头端沿着后正中线剪开一个约0.5-1.0厘米的切口，分离皮下组织，并向左右两侧游离，可见菲薄的腹外斜肌以及旗下白色发亮的脂肪团。于腹外斜肌内侧与腰大肌相近处做一小切口，用消毒后的无齿眼科镊经此切口进入腹腔，将此脂肪团轻轻拉出。可见一个桑葚状红色的卵巢，一侧子宫（Y字形）远端与卵巢有一较细的连接，为输卵管。输卵管处血管较少，于此处剪断并摘下卵巢。切除卵巢后将其余组织还纳腹腔，用4-0缝线缝合肌层。同样的方法切除对策卵巢，最后用4-0缝线缝合皮肤切口。手术完成后，将小鼠移入鼠笼，第二天观察小鼠的情况。

2.2.11组织标本的石蜡包埋和切片

室温下使用4%的多聚甲醛中固定组织样本48小时，然后移入60℃的石蜡中1小时，包埋。包埋后的样本在组织切片机上开始切片，切片厚度为5μm，于40℃中展片5分钟。捞片于载玻片上，并室温下干燥24小时，60℃烘箱加热2小时，之后进行染色。骨组织在切片前必须先经过脱钙处理：将固定好的骨组织，浸没在脱钙液中，室温脱钙。当骨组织变软后，即可进行后续相关实验步骤。

2.2.12苏木精-伊红（H&E）染色分析

1. 脱蜡和水化：利用染色夹把组织芯片放置其中，室温等候60分钟。先把组织芯片浸入二甲苯（I）中15分钟，然后更换新的二甲苯（II）后再重复上述操作15分钟；再无水乙醇浸泡3分钟；95%乙醇中浸泡3分钟；85%乙醇中浸泡3分钟；75%乙醇中浸泡3分钟；

2.将组织芯片夹放入桶中，然后将芯片夹的远侧一端放置在水龙头的出水口，自来水冲洗10分钟；之后将组织芯片夹放于合适大小的塑料盒中，然后倒入PBS， 浸泡1分钟重复三遍；

3.随后行苏木精染色25分钟，流水冲洗；酒精盐酸分色，插下去迅速拔起，马上将其插入自来水中蓝化，换液5次。继续流水冲洗5-10分钟，镜下观察染色效果；伊红染色2分钟，然后依次经70%、85%、95%、100%乙醇层级脱水各5分钟；然后分别在二甲苯（I）和（II）中透明3-5分钟；

4.封片：用纸巾吸除二甲苯，在玻片上用滴管滴加中性树脂一滴，盖上盖玻片，再用镊子小心的轻轻挤压，放于60℃ 烘箱中0.5小时烘干或者自然晾干。

2.2.13Micro-CT扫描

使用高分辨率micro-CT（扫描参数：电源电压70 kV、源电流300μA、AI 0.5mm滤波器、像素大小9μm、旋转步长0.4°等；重建设置：平滑2、环伪影校正7、束硬化校正40%等）对固定后的小鼠骨骼标本进行扫描并测量松质骨微观结构相关参数指标如松质骨体积分数（BV/TV）、骨小梁宽度（Tb. Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）和骨表面积与骨体积比（BS/BV）等。

2.2.14Von Kossa染色

钙晶体沉积通常用Von Kossa染色检测。用4%多聚甲醛浸泡小鼠股骨标本，样品经脱水、脱钙、石蜡包埋后切成6μm厚的切片。随后一边紫外光线照射，一边将其在2%硝酸银溶液中浸泡1小时，再用5%硫代硫酸钠孵育2分钟，最后观察染色结果。

2.2.15统计学分析

以上数据均来自三次或三次以上独立实验所得到的平均值±SD。结果采用t检验和单或多因素方差分析统计，当P值＜0.05时，可理解为有统计学差异。

3结果

3.1T007以时间和剂量依赖性的方式抑制RANKL介导的破骨细胞分化

为了探索T007对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响，本课题首先是评估多种药物浓度梯度的T007在分别处理48小时和96小时后对骨髓巨噬细胞（BMMs）的细胞毒性作用见图1B所示，T007药物浓度高于2.4μM时，细胞活力受到显著抑制。半数最大抑制浓度（IC50）的测定表明，T007的IC50约为3.558μM（图1C）。因此，在随后的实验中，我们选择了T007浓度为0、0.15、0.3和0.6μM作为剂量标准，连续刺激BMMs 7天。TRAP染色显示当T007浓度是0.15μM时，已经表现出对破骨细胞的形成具有抑制作用。而当浓度为0.6μM时，只能分化出更少量的破骨细胞（图1D）。随着T007浓度剂量增加，破骨细胞TRAP阳性细胞数随之减少，呈负相关趋势。另外，T007在0.6μM浓度下，破骨细胞的TRAP阳性细胞数量以及细胞核的大小较对照组明显减少（图1 E）。进一步了解T007在破骨细胞分化中的抑制作用，本课题采用浓度为0.6μM的T007对RANKL介导的破骨细胞进行了不同时间间隔的处理。图1F和1G显示在分化初期（第1至3天）加入T007后，破骨细胞的形成明显减少。此外，当破骨细胞分化达到中期时（约第3至5天）加入T007药物，与对照组相比，实验组成熟破骨细胞的数目也显著减少。但其作用效果低于分化初期时观察到的程度。在破骨细胞分化晚期（第5至7天）加入T007后，破骨细胞的数量并没有显著下降，但可以观察到体积较小的不成熟破骨细胞（图1F、1G）。因此，这些研究数据提示T007主要在破骨细胞分化的初始阶段发挥作用。

图1.T007以时间和剂量依赖性的方式抑制RANKL介导的破骨细胞发生，并且在体外没有细胞毒性作用。（A）T007的药理学结构；（B）用CCK-8法测定T007在48小时和96小时对BMMs活力的影响；（C）T007影响BMMS活性的IC50值；（D）用不同浓度的T007、M-CSF（25ng/ml）和RANKL（50ng/ml）处理BMMs 7天；（E）TRAP阳性多核细胞的数量、面积和大小；（F）在破骨细胞分化不同时期各加入一次浓度为0.6μM的T007；（G）定量检测TRAP阳性多核细胞、破骨细胞面积、破骨细胞数目和大小。所有实验至少进行三次，标尺为100μm。与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

3.2T007在体外抑制破骨细胞骨吸收功能及其相关基因的表达

为测定T007对破骨细胞骨吸收能力的影响，在96孔板牛骨片上放置BMMs后，随后向培养基中添加T007。随着T007的浓度增加，骨吸收面积明显减少，尤其是T007浓度为0.6μM（图2A、2B）。进一步探究T007对破骨细胞发生的影响，我们测定了与破骨细胞有关的基因DC-STAMP、CTSK、c-Fos和NFATc1的转录水平。与对照组相比，T007的加入，破骨细胞特征性基因的表达明显减弱（图2C）。仅有RANKL诱导的实验组，其相关c-Fos、NFATc1、Acp5、DC-STAMP、CTSK和Atp6v0d2基因表达增强；相反，同时应用T007和RANKL则显著下调了这6个基因（图2D）。免疫印迹（Western blotting）还表明，不同浓度T007对PPAR-γ、NFATc 1和c-Fos蛋白水平均有抑制作用。特别是0.6μM浓度的T007显著而强烈地下调了PPAR-γ、NFATc 1和c-Fos的表达（图2E）。因此，我们使用0.6μM浓度的T007进行后续的Western blotting实验。仅使用RANKL处理BMMs的情况下，PPAR-γ、NFATc1和c-Fos蛋白表达水平呈现出一定的时间相关性；同时加入T007和RANKL则抑制了上述特征蛋白水平的表达（图2F、2G）。此外，我们还发现，1μM浓度的蛋白酶抑制剂MG132显著增加了PPAR-γ（图2H）的表达和TRAP阳性细胞的数量（图2I），这表明MG132可以减弱T007对破骨细胞的抑制作用。同时，我们还对PPAR-γ和c-Fos进行了免疫荧光分析，发现与对照组相比，PPAR-γ和c-Fos蛋白表达水平显著降低在加入0.6μM浓度的T007刺激之后，这与上述结果一致（图3A）。为了研究T007是否引起破骨细胞凋亡，我们进行了流式细胞术实验，发现当加入T007刺激时，破骨细胞中的活性细胞数有所下降而凋亡细胞和死亡细胞的数量显著增加（图3B）。为了揭示蛋白质和基因之间的相互作用，我们进行了染色质免疫共沉淀（ChIP）实验，发现T007可以阻断RANKL与c-Fos基因的结合，下调c-Fos表达，从而抑制RANKL诱导的体外破骨分化效果（图3C）。与对照组相比，0.6μM浓度的T007也显著减少了破骨细胞F-actin环的形成（图3D、3E）。此外，我们发现PPAR-γ在成熟破骨细胞中与F-actin环密切相关（图3F），这也就能证明PPAR-γ确实是参与到破骨细胞骨吸收过程中的(24)。免疫沉淀（IP）实验还证实T007能降低RANKL诱导的PPAR-γ的表达水平（图3G）。

图2. T007在体外抑制破骨细胞骨吸收功能及其相关基因的表达。（A）将BMMs种植在牛骨片上，按照图1D中的处理方式刺激细胞，之后用SEM观察；（B）Image J分析骨片吸收面积；（C）连续5天用0.6μM浓度的T007刺激BMMs后， NFATc1、c-Fos、DC-STAMP、Acp5、Atp6v0d2和CTSK的表达情况；（D）T007（0.6μM）处理0、1、3或5天的BMMs中NFATc1、c-Fos、DC-STAMP、Acp5、Atp6v0d2和CTSK的表达；（E）用T007处理BMMs，采用Western blotting检测PPAR-γ、NFATc 1和c-Fos的蛋白表达情况；（F、G）仅用RANKL和同时加RANKL、T007分别按照0、1、3、5天以及6、12、24、48小时刺激BMMs，采用Western blotting分析检测PPAR-γ、NFATc 1和c-Fos的蛋白水平；（H）用1μM浓度的MG132作用于BMMs，观察其对PPAR-γ表达的影响情况；（I）按照不同条件加入RANKL、T007（0.6μM）或（和）MG132（1μM）处理BMMs 7天，统计破骨细胞TRAP染色后的阳性细胞数目。所有实验至少进行三次，标尺为100μm。与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

图3. T007在体外可调节PPAR-γ、c-Fos和F-actin的表达，促进细胞凋亡，阻断c-Fos与RANKL的相互作用。（A）免疫荧光法观测PPAR-γ和c-Fos蛋白表达量；（B）流式实验分析T007对破骨细胞发生凋亡过程中的影响；（C）ChIP实验检测T007是否能阻断RANKL与c-Fos基因的结合；（D-F）免疫荧光法观测F-actin环和PPAR-γ的蛋白表达量；（G）IP实验检测PPAR-γ的表达。所有实验至少进行三次，标尺为100μm。与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

3.3沉默PPAR-γ基因可降低RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达及促使破骨细胞体外分化的功能丧失

接下来，我们用PPAR-γsiRNA转染RAW264.7细胞，研究c-Fos、NFATc1、Acp5、DC-STAMP、CTSK、Atp6v0d2基因表达的影响。与对照组相比，这些破骨细胞特异性基因的水平明显降低（图4A）。这表明PPAR-γ能促使c-Fos、NFATc1和Acp5的表达，有助于破骨细胞的分化成熟。随后继续用PPAR-γsiRNA转染BMMs，观察骨片吸收情况。PPAR-γsiRNA与对照组相比，骨吸收面积明显减少（图4B、4C）。TRAP染色显示，仅加入RANKL的情况下，空白对照组和阴性对照组中TRAP阳性细胞和破骨细胞的面积变化不明显，但实验组与前两组比较下降明显且有显著性差异。此外，同时加入RANKL和T007可使上述三组TRAP染色细胞和破骨细胞面积减少，并且与RANKL单独治疗组相比，差异有显着性（P<0.05）（图4D、4E）。同样地，Western blotting实验显示，在空白对照组和阴性对照组中PPAR-γ、NFATc1和c-Fos的蛋白表达量明显不同，但均较实验组明显减少（图4F）。此外，与对照组相比，siPPAR-γ显著抑制了F-actin环的形成（图4G），这与T007的效果相似。

图4. 沉默PPAR-γ基因可降低破骨细胞特异性基因表达及及促使破骨细胞体外分化的功能丧失。（A）使用PPAR-γsiRNA转染RAW264.7细胞，NFATc1、c-Fos、DC-STAMP、Acp5、Atp6v0d2、CTSK基因在RAW264.7细胞中的表达变化；（B、C）通过SEM镜下观测siRNA转染BMMs后的骨片吸收坑，用Image J定量检测吸收面积；（D、E）同时转染siRNA和T007（0.6μM）处理后，TRAP染色阳性破骨细胞的数目和面积；（F）使用siRNA继续转染BMMs。采用Western blotting分析检测PPAR-γ、NFATc1和c-Fos的表达；（G）siPPAR-γ对F-actin形成的影响。所有实验至少进行三次，标尺分别为100μm、200μm。与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01；与RANKL组比较，##P＜0.01。

3.4PPAR-γ基因过表达能有效促进破骨细胞基因的表达和体外破骨细胞分化

为了提高说服力，我们进行了一个反向验证实验，在RAW264.7细胞中过表达PPAR-γ。其结果如图5A所示，用pcDNA-PPAR-γ转染的实验组与转染空载体的对照组相比，破骨细胞特异性基因表达量明显提高。此外，与对照组相比，PPAR-γ过度表达显著增加骨吸收面积（图5B、5C)。TRAP染色实验表明，空白组和对照组的TRAP阳性细胞或破骨细胞的分化率低于实验组且有显著差异（P<0.05），而空白组和对照组之间没有明显差异（图5D、5E）。在Western blotting实验中，实验组PPAR-γ、NFATc1和c-Fos蛋白合成显著上调（图5F）。此外，相对于对照组，PPAR-γ过表达明显促进F-actin的形成（图5G）。

图5. PPAR-γ基因过表达能有效促进破骨细胞基因的表达以及体外破骨细胞分化。（A）经pcDNA-PPAR-γ或空白载体转染后，NFATc1、c-Fos、DC-STAMP、Acp5、Atp6v0d2和CTSK在RAW264.7细胞中的表达情况；（B、C）利用扫描电镜（SEM）图像检测了pcDNA-PPAR-γ或空载体对骨吸收坑的影响，并通过Image J测量骨吸收面积；（D、E）pcDNA-PPAR-γ或空载体转染后，TRAP阳性破骨细胞的数目和面积，以未处理细胞作为对照；（F）将pcDNA-PPAR-γ或空载体转染RAW264.7细胞，以未处理细胞为对照。采用Western blotting分析检测PPAR-γ、NFATc1和c-Fos蛋白的表达量；（G）PPAR-γ过表达对F-actin形成的影响。所有实验至少进行三次，标尺分别为100μm、200μm。与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

3.5T007促进成骨细胞发生及其相关特异性基因的表达

为探讨T007对成骨细胞形成和特异基因表达的影响，我们进行了以下实验。首先，我们用不同剂量的T007处理成骨细胞（Osteoblast，OB）。可以看到当浓度低于3μM时，T007对成骨细胞活性无影响。当浓度高于3μM时，细胞毒性的增加与T007浓度的增高表现为正相关性，IC50的值为3.705μM（图6A、6B）。然后选择0.12μM、0.24μM和0.48μM的T007浓度对处理成骨细胞，在第7天和21天分别用ALP和ARS对处理后的成骨细胞染色。结果，经T007处理的成骨细胞具有较深染色效果，并在0.48μM时最为明显，进一步分析这两种染色的相应定量指标（ALP阳性细胞数及OD值），也可以看出呈明显升高趋势，这表明T007对成骨细胞有促进分化作用（图6C、6D）。接着用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测用上述不同浓度的T007处理后的成骨细胞特异性标记物的表达变化。我们发现成骨细胞特异性基因（Runx2、OCN、ALP、OSX、Col1a等）表达明显增加，尤其是当T007浓度为0.48μM时较对照组变化更为显著。这表明T007能够促使成骨细胞发生的有关基因表达（图6E）。此外，我们还检测了T007对RANKL和OPG表达水平的影响，结果显示T007抑制RANKL的表达，促进OPG的表达，降低RANKL/OPG的比值，呈剂量和时间依赖性（图6F、6G）。下一步采用Westernblotting检测有关的特异性蛋白表达。我们发现经不同浓度T007处理的成骨细胞，其相关蛋白如PPAR-γ、RANKL水平及RANKL/OPG比值显著降低，而Runx2、β-catenin和OPG则显著上调（图7A-7D），这意味着T007可以下调破骨细胞相关蛋白和上调成骨细胞相关蛋白。然后，使用T007（0.48μM）在不同培养天数分别刺激成骨细胞之后，进一步检测PPAR-γ，Runx2，β-catenin，RANKL，OPG等蛋白的表达水平。与对照组相比，T007（0.48μM）诱导Runx2、β-catenin和OPG的表达，而抑制PPAR-γ和RANKL的表达及降低了RANKL/OPG比值（图7E-7L）。同时，我们对PPAR-γ和Runx2进行了免疫荧光分析，发现与对照组相比，T007（0.48μM）组中PPAR-γ蛋白在成骨细胞中的表达明显降低而Runx2蛋白表达增加（图7M）。此外，我们还发现，MG132（1μM）显著上调了PPAR-γ（图7N）的表达，提示MG132可减弱T007对成骨细胞的促进作用。

图6.T007促使成骨细胞发生的相关基因表达。（A、B）CCK-8测定T007处理成骨细胞48小时和96小时毒性范围以IC50值；（C）使用T007处理成骨细胞，在第7天和21天分别用ALP和ARS对成骨细胞染色；（D）成骨细胞经T007处理后，ALP阳性细胞数及矿化基质OD值；（E）成骨细胞相关的基因Runx2、ALP、OCN、Col1a和OSX在不同浓度的T007处理的表达；（F、G）不同浓度T007刺激0、1、3、5天的成骨细胞后，RANKL、OPG和RANKL/OPG的表达情况。所有实验至少进行三次，与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

图7.T007通过抑制PPAR-γ基因促进Runx2的表达。（A-D）用不同浓度的T007处理成骨细胞细胞，Western blotting检测相关蛋白的表达情况；（E-L）使用T007（0.48μM）在不同培养天数分别刺激成骨细胞之后，进一步检测PPAR-γ，Runx2，β-catenin，RANKL，OPG等蛋白的表达情况；（M）用T007（0.48μM）处理成骨细胞一段时间后，免疫荧光法观测PPARγ和Runx2的表达情况；（N）T007（0.48μM）或（和）MG132（1μM）作用成骨细胞7天，Western blotting检测PPAR-γ的表达。所有实验至少进行三次，标尺为100μm。与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

3.6沉默和过表达PPAR-γ基因分别促进及抑制成骨细胞发生和相关特殊基因表达

接下来，我们开始对成骨细胞转染两种siRNA（siRNA1356，siRNA918）和阴性对照空白载体。可以发现转染siRNA 1356和siRNA 918能够抑制PPAR-γ的表达。qPCR结果表明在Runx2，OCN、ALP、COL1a和OSX基因在两组中均显著上调（图8A-8E）。ALP和ARS染色结果表明，与阴性对照组相比siRNA沉默PPAR-γ基因可以一定程度上促进成骨细胞分化（图8F），统计结果与这些观测结果一致（图8G）。继续用Western blotting检测PPAR-γ、Runx2和β-catenin蛋白水平。结果如图8H所示，实验组中细胞的PPAR-γ蛋白表达下调，而Runx2和β-catenin的合成增加。

相反，PPAR-γ基因的过表达显示Runx2，OCN，ALP，Col1a和OSX的水平显著下降（图9A-9E）。在PPAR-γ基因过表达处理成骨细胞后，随后进行的ALP和ARS染色及其相关统计分析（ALP染色细胞数及405 nm处OD值）均较阴性对照组显著减弱（图9F、9G）。Western blotting实验表明，PPAR-γ、β-catenin和Runx2的蛋白表达量出现上调的情况。

图8.沉默PPAR-γ促进成骨细胞发生和相关特殊基因表达。（A-E）转染两种siRNA或阴性对照后Runx2、OCN、OSX、ALP、Col1a和OSX基因在成骨细胞中的水平；（F、G）转染两种siRNA 后，在培养细胞7天和21天时分别进行ALP和ARS染色以及统计分析ALP阳性细胞数和矿化基质OD值；（H）成骨细胞转染siRNA或阴性对照后，Western blotting检测PPAR-γ、Runx2和β-catenin的表达。所有实验至少进行三次，与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

图9.过表达PPAR-γ抑制成骨细胞发生和相关特殊基因表达。（A-E）转染PPAR-γ质粒或空白对照载体后Runx2、OCN、OSX、ALP、Col1a和OSX在成骨细胞中的表达情况；（F、G）转染PPAR-γ质粒后，在培养细胞7天和21天时分别进行ALP和ARS染色以及统计分析ALP阳性细胞数和矿化基质OD值；（H）成骨细胞PPAR-γ质粒或空白对照载体后，Western blotting检测PPAR-γ、Runx2和β-catenin的表达。所有实验至少进行三次，与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

3.7T007促使BMSCs分化为成骨细胞和相关特殊基因表达

然后，本课题继续研究了T007能否促使骨髓间充质细胞（BMSCs）向成骨细胞生长方向分化。图10A为不同浓度T007（0、0.12、0.24和0.48μM）处理BMSCs一段时间后（7天和21天）分别进行ALP和ARS染色。可以看到随着T007浓度的增加，两种细胞染色程度均呈正相关趋势增加并且相应的定量指标（ALP阳性细胞数及矿化基质OD值也与上述结果相符（图10B）。此外，Runx2、OCN和ALP在 mRNA表达层面也明显上升，Col1a 基因表达有上升的趋势，但差异无统计学意义（图10C）。Western blotting结果表明，T007（0.48μM）可以下调PPAR-γ蛋白以及增加Runx2的蛋白表达量（图10D、10E）。将pcDNA-PPARγ过表达质粒转染到BMSCs后，ALP和ARS染色显示实验组ALP阳性细胞数及矿化基质OD值低于对照组（图10F、10H），Western blotting表明PPAR-γ蛋白表达增加，Runx2表达下调（图10I、10J）；qPCR提示成骨细胞特异性基因（Runx2、OCN、ALP等）表达水平同样出现降低（图10K）。有趣的是，当我们用siR918和siR1356这两种小干扰RNA成功沉默PPAR-γ基因后，ALP阳性细胞数及OD值相较于对照组出现了升高趋势，且有明显差异（图10L、10M）；在蛋白水平上则是降低PPAR-γ表达而促进了Runx2蛋白表达（图10N、10O）；mRNA层面上的成骨细胞发生中的相关基因亦是如此（图10P、10S）。此外，T007（0.48μM）以时间依赖性的方式显著的抑制PPAR-γ在BMSCs中的表达（图10T），这种抑制作用在会被MG132（1μM）减弱（图10U）。

图10.T007促使BMSCs分化为成骨细胞和相关特殊基因表达。（A）不同浓度的T007作用细胞7天和21天后，进行ALP及ARS染色；（B）使用T007处理细胞后ALP染色后阳性细胞的数目及矿化基质的OD值；（C）成骨细胞相关特殊基因Runx2、OCN、ALP和Col1a在T007处理7天的表达情况；（D、E）使用T007处理BMSCs后，Western blotting观测上述蛋白的表达情况；（F-H）pcDNA-PPAR-γ或空白对照质粒转染7天和21天后分别进行ALP及ARS染色及相关统计分析；（I、J）Western blotting检测PPAR-γ基因过表达后上述蛋白表达情况；（K）qPCR检测成骨细胞有关基因在mRNA层面上的变化情况；（L、M）转染两种小干扰RNA后，培养到7天和21天分别进行ALP及ARS染色及相关统计分析；（N-S）Western blotting及qPCR分别检测沉默PPAR-γ基因后，相关指标变化情况；（T）用T007（0.48μM）处理BMSCs不同天数后，采用Western blotting检测PPAR-γ的表达情况；（U）用T007（0.48μM）或（和）MG 132（1μM）处理BMSCs，Western blotting检测PPAR-γ的表达变化情况。所有实验至少进行三次，与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

3.8T007有效拮抗小鼠卵巢切除诱导骨量丢失

为了验证T007对骨质疏松症的潜在治疗作用，我们建立了小鼠的骨质疏松模型。与假手术组（sham）对照，卵巢切除（OVX）后的小鼠体重增加和子宫重量明显降低，表明骨质疏松症模型顺利建立（图11A、11B）。在OVX术后4周开始腹腔注射T007，随后进行的qPCR实验表明，与空白治疗组（vehicle）相比，药物治疗组（low dose和high dose）中的NFATc1、c-Fos、DC-STAMP、Acp5、Atp6v0d2、CTSK以及RANKL基因表达水平较为显著的下降而OPG基因则是有所升高（图11C、11D）。通过Western blotting分析RANKL及OPG蛋白表达变化，我们可以看到与sham组相比，vehicle组的RANKL蛋白水平明显上升而OPG出现了下降，相应的RANKL/OPG值表现为升高趋势且有统计学差异（图11E、11F）。之后采用高分辨Micro-CT分析股骨近端骨量丢失情况（图11G、11H），与sham组相比，相关的显微结构考虑指标：骨体积比值（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb. Th）和骨小梁数（Tb. N）明显降低，骨表面/骨体积（BS/BV）和骨小梁分离（Tb. Sp）明显增加。药物T007处理组（low dose和high dose）与vehicle组相比，BV/TV、Tb. Th和Tb. N增加，但BS/BV和Tb. Sp下降，其中high dose组中上述指标变化较low dose组更为明显。另外苏木-伊红（H&E）染色验证了T007对OVX模型小鼠骨量的保护作用见图11I。此外TRAP染色结果表明（图11J），与sham组相比，vehicle组的多核破骨细胞数量明显增加（Oc.N/BS），破骨细胞表面积和骨面积百分比（Oc.S/BS）也显著升高，而且在使用T007治疗后，Oc.N/BS、Oc.N/BS的下降，可以进一步证实T007可以有效减少骨量的丢失（图11K、L）。通过钙盐染色（Von Kossa）法，我们也可以看出，与sham组相比，vehicle组的矿化面积与骨表面积百分比（MS/BS）有所减少且有统计学差异，而治疗组则有效的阻碍了这种下降趋势（图11M、11N）。另外钙黄绿素荧光双标结果显示，T007治疗OVX诱导的小鼠骨质疏松模型时，同样会影响矿化沉积率（MAR/μM.d），表现为T007治疗组有效挽救OVX小鼠出现的矿化沉积率损伤趋势（图11O、11P）。

图11.T007有效预防小鼠双侧卵巢切除引起体内的骨丢失。（A）OVX术后小鼠体重随周数不断变化；（B）OVX术后小鼠子宫重量的改变；（C、D）T007对小鼠体内特征性基因NFATc1、c-Fos、DC-STAMP、Acp5、Atp6v0d2、CTSK以及RANKL、OPG的影响；（E、F）Western blotting分析T007对小鼠体内RANKL及OPG蛋白表达变化的影响；（G）用Micro-CT扫描小鼠胫骨；（H）Micro-CT扫描数据进行统计分析，常见显微结构指标包括骨体积比值（BV/TV）、骨表面/骨体积（BS/BV）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、和骨小梁数量（Tb.N）；（I）分别对小鼠股骨H&E染色、（J-L）小鼠胫骨TRAP染色以及对TRAP染色统计分析，相关指标包括破骨细胞数（Oc.N/BS）、破骨细胞面积（Oc.S/BS）；（M、N）小鼠胫骨Von Kossa染色以及矿化面积与骨表面积百分比（MS/BS）统计；（O、P）小鼠股骨钙黄绿素荧光双标图像和小鼠矿化沉积率（MAR/μM.d）统计。n=5，所有实验至少进行三次，与对照组比较，*P＜0.05和**P＜0.01。

图12. 关于T007抑制破骨细胞分化和促使成骨细胞生成机制的简化描述模型。T007能够有效地抑制PPAR-γ基因表达，阻止破骨祖细胞向破骨细胞的分化，从而减少骨吸收。在破骨细胞祖细胞中，T007抑制c-Fos的表达继而有助于破骨细胞的分化。相反地，T007抑制PPAR-γ的激活，促使前体成骨细胞向成骨细胞分化，并通过增加Runx2的表达，使骨髓间充质干细胞向着成骨细胞分化形成。因此，T007通过抑制相关骨吸收和刺激骨形成来平衡骨重塑。

4讨论

骨质疏松即骨质疏松症，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。骨质疏松病症的发生是一个复杂的过程。以往的研究证实，多种刺激和调节因子相互作用，最终会引发骨质疏松病症(25,26)。虽然已经针对破骨细胞进行了许多临床治疗的研究，如雌激素替代疗法和双膦酸盐疗法(27)，但由于现有的治疗方法存在多种副作用，还需要进一步的替代疗法。相关的一些研究表明，双膦酸盐对下颌骨坏死有严重的副作用(28)。在此，我们探讨了PPAR-γ拮抗剂T007对多核破骨细胞分化和吸收的影响。在本课题研究中，我们证明T007可以通过抑制PPAR-γ和促进OPG在体外介导成骨细胞生成来阻止RANKL诱导破骨的发生。此外，我们的结果还表明，T007可以防止OVX引起的体内骨量丢失。因此，我们的研究发现T007是治疗骨质疏松的候选药物，可以帮助探究T007的作用机制，这对于进一步的研究和临床应用是有益的。

OPG/RANKL/RANK复合物是一个与骨质疏松发生密切相关的调节系统，可影响破骨细胞的功能，尤其是OPG/RANKL比值的变化可以直接影响影响破骨细胞的增殖和分化，从而影响骨代谢(29,30)。OPG延缓破骨细胞的分化，降低骨吸收时是通过竞争性地与RANKL结合，阻断RANKL与前体细胞膜上RANK的结合途径。而OPG/RANKL比值的变化是破骨细胞活化和增殖的最直接指标，其降低会促使破骨细胞的分化，引发骨质疏松病症(31)。研究表明，云南白药等中药能提高成骨细胞中OPG的表达，减少RANKL的表达，从而阻碍破骨细胞的分化和细胞活化(32)。为了研究T007是否间接控制破骨细胞分化，我们检测了RANKL和OPG在其分化过程中的表达水平，并分析了RANKL/OPG的相对比率。我们发现T007，一个PPAR-γ抑制剂，能够显著增加OPG的表达，降低RANKL表达和RANKL/OPG比值。Lee等人研究发现(33)发现，罗格列酮是PPAR-γ的激动剂，通过下调成骨细胞RANKL的表达和上调OPG的表达，抑制破骨细胞的发生。然而，最近的一项研究表明，PPAR激动剂在短期内(1周)减少了牙槽骨的丢失，同时通过下调OPG的表达和上调RANKL来促进破骨细胞的形成（8周）(34)，这与我们的结果相似。因此，这一发现提示T007对破骨和成骨细胞发生的影响可能是由OPG/RANKL/RANK调控模块参与的调控机制驱动的。

PPAR-γ是配体依赖性核受体，调节多种生理和疾病过程，例如抑制炎症反应和调节骨细胞分化(35,36)。以前有研究团队报道，PPAR-γ能诱发破骨细胞的分化，并且可以阻碍成骨细胞的生成(37,38)，Rzonca等人提出噻唑烷二酮激活的PPAR-γ对成骨细胞的生成具有抑制作用(39)。此外，PPAR-γ过度表达增加了RANKL/OPG的相对比率，导致骨形成减少，从而加速OVX诱导雌性小鼠的骨质流失(40)。Jeon(41)表明，PPAR-γ基因的激活可以下调Runx2基因的表达，抑制成骨细胞的生成。小鼠体内实验表明，PPAR-γ通过调节c-Fos的表达，促使破骨细胞分化(42)。在本课题研究中，我们观察到PPAR-γ在RANKL介导的破骨细胞分化中表达增加。此外，PPAR-γ过表达明显降低了Runx2的表达水平，同时上调了破骨调节因子(如NFATc1和c-Fos)的水平，这表明PPAR-γ是一种阻碍成骨细胞发生、促进破骨发生的关键因素。

此外，我们还观察并探究了PPAR-γ对RANKL诱导的破骨细胞的作用及其机制，PPAR-γ与T007的拮抗作用促进了ALP表达(43)。有趣的是，这与先前对PPAR-γ激动剂研究中的结果是相反的(44,45)。先前的研究提示，II类HDAC-9通过抑制PPAR-γ的活性而阻碍破骨细胞分化和骨吸收(46)，在RANKL诱导的破骨细胞因子表达水平方面也发现了类似的结果。T007降低了PPAR-γ和破骨细胞相关特殊基因NFATc1、c-Fos和DC-STAMP的表达水平，促进了β-catenin和Runx2的表达。NFATc1和Runx2这两个细胞因子在破骨和成骨分化中起调控的作用(47,48)。最近有报道称Runx2可以促进MSCs的成骨细胞发生(49)。在此，Runx2的表达增加，表明T007促使成骨细胞的发生。NFATc1是RANKL介导的破骨细胞分化的主要调节细胞因子，另外包括CTSK、c-Fos、Atp6v0d2和DC-STAMP等基因(50,51)。此外，DC-STAMP基因的沉默对破骨细胞样多核细胞的分化有明显的抑制作用(52)。我们的发现表明T007在蛋白和mRNA水平上都显著降低了NFATc1的表达。同时，T007也下调了CTSK，c-Fos，DC-STAMP，Acp5和Atp6v0d2的水平，这表明T007能抑制RANKL诱导的破骨细胞活性。之后，我们继续研究了T007是否能影响OVX引起的体内骨量丢失。通过qPCR、高分辨率Micro-CT、H&E染色和Von Kossa染色等实验分析，表明T007阻碍破骨细胞过度活动引起的骨质流失通过上调OPG和下调RANKL的表达。上述实验结果与已有的文献报道结论相符（二甲双胍可以显著增加胫骨骨密度并且减少OVX模型大鼠中TRAP阳性细胞数通过增加OPG、降低RANKL表达达到预防骨良丢失的目的）(53)。总之，本课题的研究表明，在体外细胞培养和体内动物模型研究中，T007抑制RANKL介导的破骨细胞分化，并促使成骨细胞发生。这些实验结果可能对骨病的处理和骨组织工程都有一定的帮助。

骨稳态研究是一个热门话题，如在骨组织工程学中的研究，医学上防治骨质疏松症的研究等。但是也存在着很多问题，许多研究还只是初步探索阶段，还需要系统、深入的研究，相信骨稳态、成骨细胞会有非常好的应用前景。本实验设计也存在一定不足与局限性。在PPAR-γ影响破骨细胞骨吸收以及成骨细胞发生的潜在机制具体通路的研究未能进一步进行，它在骨稳态环境中的作用影响也未能通过实验验证，未能结合临床病例分析等。并且本实验仅是从小鼠模型验证，并未能从细胞、基因水平验证。

5结论

如图12所示，T007可以有效抑制PPAR-γ基因的表达，阻碍破骨细胞祖细胞向破骨细胞的分化进程，进而降低骨吸收。在破骨细胞祖细胞中，T007有效地抑制c-Fos基因的表达而加快破骨细胞的分化成熟进程。相反，T007也会促使Runx2基因表达来抑制PPAR-γ基因活化，令前体成骨细胞转向成骨细胞形成，并加速骨髓间充质干细胞的生长，继而有助于成骨细胞的生成。因此，T007通过抑制相关骨吸收和刺激骨形成来平衡骨重塑。

PPAR-γ抑制剂T0070907抑制破骨细胞生成及拮抗小鼠卵巢切除诱导骨量丢失

价格 ¥9.90 发布时间 2023年5月9日

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