CLU基因多态性与非痴呆型血管认知障碍相关性的研究

摘 要

目的：非痴呆型血管性认知障碍(vascular cognitive impairment no dementia with，VCIND)是血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）的早期阶段，VCI一旦进入中晚期则无有效的治疗方法，因此在早期阶段的VCIND是VCI的治疗和预防的最佳阶段。目前尚无明确的发病机制，但研究表明遗传易感性在VCI的发病过程中有着重要的作用。本研究旨在探讨CLU基因多态性与VCIND患者之间的相关性，为早期预测VCI的发生提供依据。

方法：收集2018年10月-2019年10月来牡丹江医学院红旗医院神经内科就诊的患者，VCIND研究组患者44例,认知正常对照组23例，详细记录人口学资料、危险因素、现病史、既往史，进行神经系统查体、神经心理学量表MMSE、MoCA评分，完善结构核磁共振T1WI、T2WI、FLAIR、SWI等检查，检测和分析两组CLU基因rs11136000snp、rs93311888snp位点，应用采用卡方检验进行 HardyWeinberg 平衡定律吻合度，检验采用卡方检验、随机区组设计资料的多因素方差分析等进行比较。比较CLU基因多态性与VCIND患者及其影像学之间的相关性。

结果:（1）VCIND组和认知正常组在视空间及执行功能、命名、注意力、计算力、语言、记忆力、抽象、定向力方面比较，结果P＜0.01，差异有统计学意义。

VCIND组与认知正常组的rs11136000snp位点对比，P＜0.05，差异有统计学意义。rs9331888snp位点的P＞0.05，无显著性差异。VCIND组与对照组SVD总分对比，P＜0.05，存在显著性；在SVD评分亚组中，两组在腔隙性脑梗死、血管间隙扩大、脑白质改变中P值均＜0.05，有显著性差异。CLU基因多态性rs11136000snp位点、rs9331888snp位点与VCIND患者的影像学比较，P＜0.01，存在强显著性。携带CLU基因多态性rs11136000snp位点的VCIND患者在腔隙性脑梗死、脑白质改变中P值均＜0.05，携带CLU基因多态性rs9331888snp位点的VCIND患者在脑白质改变、血管间隙扩大中P值均＜0.05。

      结论：VCIND患者的主要表现在视空间及执行功能、命名、注意力、语言、记忆力、计算力、定向力、抽象力降低，认知的损伤为多领域。CLU基因多态性的rs11136000SNP位点可以作为VCIND出现的生物标志物；VCIND患者头部MRI表现为腔隙性脑梗死、脑白质高信号、脑微出血、血管间隙扩大；携带CLU基因的rs11136000SNP位点、rs9331888位点的VCIND患者更易出现上述表现。且CLU基因多态性与脑白质高信号的关系更明确。

关键词：CLU基因多态性；非痴呆型血管认知障碍；磁共振成像；交互作用

前 言

血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是脑血管病变及其危险因素导致的临床卒中或亚临床血管性脑损伤，涉及至少一个认知域受损的临床综合征，涵盖了从轻度认知障碍到痴呆，也包括合并阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD) 等混合性病理所致的不同程度的认知障碍。根据流行病学研究[1]，我国65岁以上的人群中VCI患病率约为8.7%。VCI包括3种：非痴呆型血管性认知障碍(vascular cognitive impairment no dementia with，VCIND)，血管性痴呆( vascular dementia，VaD) 和混合性痴呆(mixeddementia，MD)。VCIND为血管性痴呆的早期阶段，一些人可能会恢复到“正常”水平的认知功能的健康状态，一些人会进展出现进一步的认知能力下降或血管性痴呆。根据中国认知与老龄化研究[2]，VCIND是中国最常见的轻度认知功能障碍亚型，占总病例的42.0%。中国的一项对VCIND患者随访2年的研究发现其演变为痴呆的比例高达40%[3]。X一项研究追踪VCIND患者3年内转化为VaD的概率为35%[4]。VCIND临床上主要表现以注意力、执行功能的减退，以及运动操作和信息处理速度的减慢为主，病理上主要表现为新近皮质下小梗死、白质高信号、腔隙、血管周围间隙扩大、脑微出血、萎缩。其可能与额叶-皮质下环路的阻断有关。当然，与记忆相关的海马-内侧颞叶-皮层下功能通路被破坏也会导致记忆损害。鉴于血管性痴呆一旦进入中晚期没有治疗药物和手段，因此在早期阶段的VCIND是血管性认知障碍治疗和预防的最佳阶段。因此明确其遗传易感性及危险因素对于早期预防VD具有重要的临床意义。

全基因组关联分析研究鉴定出若干CLU单核苷酸多态性风险基因位点，其中CLU基因的rs11136000、rs2279590、rs9331888、rs933194位点，被认为是目前迟发性阿尔茨海默病（LOAD）显著相关位点。较多的研究证明CLU基因是目前第三大相关基因LOAD的风险基因。CLU基因是单拷贝基因，位于8p21号染色体上，包含9个外显子、8个内含子，含有16580个碱基，编码449个氨基酸组成的多肽链。CLU mRNA表达具有组织特异性，在正常大脑、肝脏和胰腺表达较高，大脑内的表达在膜重构和细胞可塑性方面起到重要的作用。多项研究表明[5]CLU基因也参与了许多严重的生理疾病，如中枢神经系统紊乱、动脉粥样硬化、炎症等。血浆CLU浓度在认知功能障碍、脑萎缩、认知功能快速下降、AD进展中起重要作用。CLU基因编码clusterin，也称为载脂蛋白J，是中枢神经系统中表达最丰富的载脂蛋白之一，可影响Aβ聚集、介导Aβ清除、调节脂质代谢、诱发补体反应以及神经炎症反应。CLU作为高密度脂蛋白的组成部分，参与胆固醇的转运，参与动脉粥样硬化的进展和恶化[6]。而动脉粥样硬化是血管性认知障碍的最重要病因机制，基于以上，我们推测CLU基因可能参与血管性认知障碍的发生和发展。本研究采用病例对照方法探讨基因位点的多态性与VCIND的相关性，明确其在VCI病程进展中可能的作用机制，为VCI的早期预警生物学标志物及干预提供重要的临床依据。

文献综述

非痴呆型血管认知障碍的结构影像学研究进展

血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是脑血管病变及其危险因素导致的临床卒中或亚临床血管性脑损伤，涉及至少一个认知域受损的临床综合征，涵盖了从轻度认知障碍到痴呆，也包括合并阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD) 等混合性病理所致的不同程度的认知障碍。VCI是痴呆的第二常见原因[7]，我国脑血管疾病发病率高。根据流行病学研究[1]，血管性痴呆的发病率约为3.1/1000人/年。我国65岁以上的人群中VCI患病率约为8.7%。除患病率以外，痴呆症对经济、卫生和社会援助的影响也在增加。故能够及早防控VCI成为全球最急需解决的问题。目前，学者认为VCI包括3种：非痴呆型血管性认知障碍(vascular cognitive impairment-no dementia with small vessel disease，VCIND)，血管性痴呆( vascular dementia，VaD) 和混合性痴呆(mixeddementia，MD)。越来越多的证据表明：VCIND为血管性痴呆的早期阶段，具有很高的危险性转化为痴呆。我国有研究通过对VCIND患者2年随访发现其演变为痴呆的比例高达40%[3]。X一项研究发现[4]：VCIND患者3年内发展成VaD的概率为35%。临床上无症状的脑血管疾病足以引起相关的认知功能障碍[8]，大多病情恶化可能是缓慢和渐进的；通常不会观察到渐进性恶化和局灶性认知障碍，小血管疾病是VCID中最常见的损害[9]。一项前瞻性筛查研究显示，包括腔隙性梗死、微梗死、髓鞘丢失、动脉硬化、软脑膜脑淀粉样血管病、血管周围间隙扩张和大面积梗死在内的七种病理疾病可以预测认知损害[10]。VCIND的主要影像学表现可出现腔隙性脑梗死、脑白质疏松、脑微出血、血管周围间隙扩大、脑萎缩等。影像学特征可作为诊断VCIND的特异性标志物，在早期诊断和预测VCI患者认知功能下降的临床实践中扮演着一个重要的角色，要想实现对痴呆症和脑血管病变进行预防和治疗，可以先对VCIND进行防治来实现。

　一、非痴呆型血管认知障碍与结构影像学的研究进展

近年来，神经分子影像学、神经功能影像学等对疾病进行认识、诊断、治疗及预防的依据之一，但是目前临床诊断中的主要标准还要依靠神经结构影像学。结构成像如临床使用的MRI序列包括T1加权磁共振成像（T1WI），T2加权磁共振成像（T2WI），液体衰减反转恢复序列（FLAIR），弥散加权成像（diffusion weighted imaging,DWI），弥散张量成像（diffusion tensor imaging,DTI），敏感加权成像（susceptibility weighted imaging,SWI）等可以准确识别腔隙性脑梗死、脑白质病变、脑微出血、血管周围间隙、脑萎缩等。每一个序列都反映特定的组织特征。

　1、腔隙性脑梗死

腔隙性脑梗死（lacunar infarction，LI）多分布于皮质下直径为3～15mm的圆形或卵圆形、与脑脊液信号相同的病灶。磁共振FLAIR图像显示中央脑脊液样信号,由环形高信号边缘包围，边缘并不总是存在的，当它们穿过白质高信号区域时，高信号的边缘也可以包围血管周围的空间。在T1和T2上出现类似于脑脊液的高信号,弥散加权成像(DWI)上信号无增强。某些情况下，FLAIR不会抑制中央腔液体，尽管MRI在其他序列(如T1加权和T2加权MRI)上有清晰的脑脊液样信号，但病变可能表现为完全高信号。有研究表明腔隙性脑梗死是信息处理速度和执行功能受损的重要标志，是VCI的重要预测因子[11]。腔隙性梗死也是VCI的结构磁共振的标志物[12]。既往研究表明LI导致的认知功能损害与其部位相关。丘脑的LI常表现为全脑认知功能损害，运动能力及执行功能降低，而苍白球或壳核的LI主要表现为记忆功能下降［13］,LI数目越多，多领域认知功能损害越明显[14]。

DTI即弥散张量成像，可检测脑内神经纤维束是否完整以及反映脑内水分子的弥散运动。平均扩散率（mean diffusivity，MD）是衡量水在白质中扩散的大小，分数各向异性（fractional anisotropy，FA）提供有关水扩散方向性的信息。有研究提示在LI的急性期，梗死在相位细胞毒性水肿或早期血管源水肿的脑组织，平均弥散率显著减少，脑梗塞、血管内皮细胞受损，细胞通透性增加，细胞间水积累导致血管源脑水肿的发展时，水分子扩散能力进一步下降，MD值进一步降低。与此同时，由于蜂窝结构损伤和组织显微组织的损失，各向异性显著下降和FA降低。LI梗塞的MD值均显著低于这些LA病变由于缺血区域中总的自由水分子扩散的减少。多项研究通过对腔隙数量、体积以及认知功能的分析发现LI是认知障碍患者比较重要的预测因子[15]。Andrew等人[16]在对腔隙性脑梗死患者5年的随访期内，网络整体效率的下降速度预测了转化为痴呆症和认知能力下降的可能性。

　2、脑白质高信号

脑白质高信号（white matter hyperintensity，WMH）在磁共振T2和FLAIR序列中显示高信号，在T2加权MRI上观察到的WMH在老年人中极为常见。主要分布在白质区域，多分布在脑室周围、大脑半球的深部白质、基底神经核区、脑桥，有时是小脑和脑干，但在 T1通常有点低或很难找到，表现为等信号或低信号(不像脑脊液那样低信号)，这取决于序列参数和病变的严重程度。研究显示白质高信号与隐蔽的神经和认知症状以及步态障碍等身体障碍有关[17]。通过影像学研究发现WMH与包括注意力、执行能力、处理速度等的特定认知领域的损害具有很强的关联[18]。区域性WMH负担与衰老相关的脑萎缩之间存在高度相关性以及与认知表现相关的特定脑区皮质厚度减少[19]。

弥散加权成像(DWI)早期研究使用DWI计算的痕迹/表观扩散系数(ADC)，在表征血管性认知损害中异常的WM区域研究显示：纵向研究显示随着WMH严重程度的进展，扩散增加；横断面研究中的主要观察结果是随着WMHs严重程度的增加ADC值增加；两者均有VCI有密切关系[20] 。但是DWI模型在描述神经元组织中各向异性扩散方面的局限性导致了在以后的SVD研究中使用DTI模型。白质的损伤大致伴随着MD的增加和FA的减少。O’Sullivan等[19]观察缺血性脑白质疏松患者侧脑室前角白质FA和半卵圆中心的DA与认知功能的衰退明显相关。既往研究表明，VCI患者与正常人群相比，全脑白质的MD值和FA值均有显著差异，并且MD值、FA值与记忆及注意执行功能评分有显著的相关性，提示DTI反映的白质改变与认知表现存在相关性[21]。DTI全脑直方图特征显示1年内MD增加，FA降低，而丘脑和壳核DTI的显著变化与WMHs的增加有关[22]。研究显示DTI测量的白质完整性与认知障碍的相关性比缺血性病变的负荷更好[23]。

通过研究不同脑白质区域内病变体积与认知障碍之间的关系，发现脑室周围白质缺血性病变与额叶皮层变薄和执行功能障碍有关[24]。但是Delano等人[25]研究发现脑室周围白质损害与年龄相关，但不会影响认知功能，而深部白质损害可导致执行功能和视觉空间功能障碍命名和记忆功能则相对保留。Wright等人[26]大样本研究发现脑白质病变与认知功能整体下降有关，病变范围大小与认知功能损害存在明显正相关性，当白质损害累计体积大于0.75%整颅脑体积时，认知灵活性和感觉运动能力将受损明显。随着大型队列研究的开展，进行手动MRI分割变得越来越困难，对多模式、灵活、可自由使用的分割工具的需求变得更高。相对于以前的基于k-NN的分割方法，[27]脑强度异常分类算法BIANCA 提供了不同的选项来加权空间信息，局部空间强度平均，以及不同的选项来选择训练点的数量和位置。Bianca是多模式的，并且高度灵活，因此可以根据他们的协议和特定的网络环境调整该工具。

在过去的20年中，使用各向同性高分辨率T1加权MR图像对脑体积的定量评估已被大量应用于评估衰老和神经疾病中发生的宏观结构改变。然而，体积评估并没有捕捉到大脑白质(WM)和皮质灰质(GM)固有的结构复杂性。这种复杂性可以用分形几何来研究，分形几何描述了在适当的空间尺度范围内表现出自相似性的对象的复杂性。分形维数(FD)是一种紧凑的、无单位的几何形状特征，它表示对象填满空间的程度[28]，并产生对象结构复杂性的单个量化指标[29]。大脑WM和皮质GM的FD可以使用常用的高分辨率T1加权图像来计算。脑白质和脑灰质FD值已被发现与老年人的认知表现呈正相关[30]。既往研究提示我们观察到脑血管病和轻度认知障碍患者大脑白质的平均FD为2.4650，明显低于健康对照组。众所周知，FD和体积检查和量化不同的结构方面，因此通常是相辅相成的。综上所述，结合大数据建议，在评估大脑皮层和皮质下脑白质时，应该使用不同的神经成像工具来获得显著的结果。

3、脑微出血

脑微出血（cerebral microbleeds，CMBs）定义为对T2加权磁共振序列中的磁化效应敏感，直径为2～5mm的圆形信号丢失，在其周围没有发现水肿，在SWI上的呈现形式为低信号，在MRI上为多发性微小信号丧失，大多位于基底节或皮质下区域。它们不仅是未来脑叶内出血的预测指标，而且与认知能力下降独立相关。微量出血也可能对应于血管周围间隙内含铁血黄素的巨噬细胞的局灶性堆积，并且有证据表明血红素降解活性，周围有激活的小胶质细胞的炎症反应，晚期补体激活和凋亡。偶尔发现微量出血周围有胶质增生和不完全的缺血性改变。既往研究发现头顶枕叶和脑岛中的CMBs 的增加与执行功能缺陷相关[31]。相关脑微出血研究显示[32]运用SWI技术发现VD患者额叶、颞叶皮质下，基底节区及丘脑微出血灶的发生率显著高于无VD患者。高晓嵘等[33]通过应用SWI技术对80例脑微出血组及80例正常对照组研究发现脑微出血组患者的抽象能力、视空间执行能力、注意力、定向力、记忆、语言及MoCA评分与脑微出血的数量呈显著的负相关。Ayaz 等[34]运用SWI对脑微出血的一项纵向研究表明，认知障碍患者病灶数目均随时间延长逐渐增加，且认知障碍程度均进行性加重。在社区人群的鹿特丹研究的基础上Akoudad等[35]同样发现：发生痴呆和认知障碍风险会随着脑微出血数量的增加而增加，他们密切相关；大脑中的微出血尤其是脑叶可导致时间定向力，地点定向力，语言，即刻记忆，注意力及计算力，视空间，延迟记忆等能力降低，若是其它部位发生脑微出血，会造成信息运动和加工速度快速下降。

研究发现多发性微出血(≥5)的存在与MoCA总分较低以及在认知测试的特定领域(如全局认知功能、信息处理速度和运动速度)的表现较差有关[36]。在健康成人中进行的横断面和纵向研究也表明，CMBs与较低的MMSE测试分数、较差的信息处理能力和较差的执行功能有关，特别是大量的CMBs[37]。有研究[38]发现深层或混合CMBs与言语记忆有关，与脑萎缩无关，这个发现可能提示丘脑核的破坏，与存储和短期记忆有关，与记忆障碍一致，其是AD的标志，也存在于血管相关的认知障碍中。一些研究表明脑微出血也受脑白质损伤影响。Akoudad等[39]研究提示脑白质完整性受损越明显，CMB数量越多。在常规MRI上看不到的组织损伤，可以在未来的研究中利用扩散张量成像或静息MRI等新技术进行评估。

4、血管周围间隙

血管间隙扩大（enlarged perivascular spaces,EPVS）是指与血管走行一致的穿过灰质或白质的充满液体的具有一定的生理和免疫功能的间隙。动脉、小动脉、静脉和小静脉周围的脑外液体间隙的延伸。在高分辨率下，偶尔可以在血管周围间隙的中心看到中央血管。血管周围间隙通常在下基底节最为突出，也可见向心性穿过半球白质和中脑，但在小脑中很少见到。腔隙和扩大的血管周围间隙之间的一个区别特征可能是腔隙通常更大(>3 mm)，并可伴有病灶周围信号改变。扩大的血管周围间隙为圆形、椭圆形或线形病变，边缘光滑，无占位效应，信号强度在T1图像上等于脑脊液，FLAIR图像上没有高信号边缘的低信号。如果它们穿过白质高信号区域，在T2加权或FLAIR成像上会有围绕液体间隙的T2高信号边缘。

一些研究已经将更突出的血管周围间隙与较差的认知功能联系在一起。一部分研究[40]显示PVS与认知损害之间存在正相关关系。Maclullich等[41]研究97名65-70岁健康老年人的头颅MRI资料发现，颅内EPVs的严重程度与视空间能力和非语言推理能力等认知能力减退有相关性。Huijts等[42]对189例血管性认知障碍患者研究发现，基底节区EPVs的严重程度与认知障碍程度存在相关性。有趣的是，有人发现PVS并不是认知能力下降的预测指标，Philip Benjamin等人[43]研究得出在5年的随访期内PVS与认知功能下降无关。

优先使用T2加权MRI来评估EPVS,EPVS在中到重度认知障碍患者中很难评级，因为它们经常被WMH掩盖[40、44]。使用T1加权成像测量容积是评估PVS负荷的另一种方法，在小血管疾病和WMH患者中可能更准确。除了混杂因素外，造成这种不一致的一个原因可能是因为Lacunes和EPVS很难区分。有研究者提出了一种基于学习的EPVSs自动分割方法，使用脑解剖结构和血管信息来确定感兴趣区域（region of interest，ROI）,在分割准确性方面超过其他EPVSs分割方法，可以用于EPVSs形态的定量研究[45]。EPVSs的定量研究也十分重要。随着7T MRI扫描仪信噪比的增加，即使在健康受试者扫描的MRI图像中也可以显示 EPVSs[46]。

5、脑萎缩

脑萎缩（encephalatrophy）是指由各种原因导致脑组织本身发生器质性病变而产生萎缩的一种现象。临床症状多为时间及定向力下降，语言功能障碍等高级智能功能减退。许多影像学研究报告了认知严重程度与脑萎缩之间的关系，包括全局萎缩、胼胝体萎缩、中枢萎缩(脑室大小增加和基底节萎缩)以及中脑萎缩。全局性和局灶性萎缩的进展程度和速度与认知恶化和转化为痴呆症有关。Van等[47]通过观察大量具有轻度认知障碍患者的脑MRI资料发现多数患者大脑内侧颞叶发生器质性病变，萎缩是其特征性改变。研究基于体素的形态测量比较了有一个或多个认知领域损害的缺血性卒中患者的灰质体积[48]，结果提示认知障碍组年龄较大，受教育年限较短，更大的病变体积，以及多个认知领域的缺陷，包括定向、注意力、工作记忆、语言、视觉空间技能、精神运动速度和记忆；与那些丘脑、额叶、颞叶、顶叶和枕叶没有认知功能受损的患者相比，有认知障碍的缺血性中风患者的灰质体积显著减少，且主要部位在丘脑。一项研究发现，在非痴呆老年人中，海马萎缩和WML的组合与认知功能障碍的风险增加有关[49]，而海马萎缩或WML本身与认知功能障碍无关。这些发现表明，大脑中血管病变的存在放大了海马萎缩与认知功能之间的联系。在动脉粥样硬化性疾病患者中，较小的总脑体积、较大的脑室体积和较小的皮质灰质体积与较差的执行能力相关，并且这种关联随着脑血管病变的存在而变得更强[50]。一项多中心横断面及纵向研究显示脑萎缩可增强脑白质疏松及腔隙性脑梗死对认知功能的影响，该研究还指出脑萎缩可能会掩盖脑白质疏松对认知功能的影响[51]。且脑萎缩和WML在认知功能上有协同作用。同时通过结构影像学研究得出腔隙性梗死与不同萎缩程度的脑运动速度纵向下降之间的协同作用。也有研究提示皮质萎缩是步态障碍的一个神经影像学标志，这种相关性也可能由额叶、顶叶和双侧胼胝体白质的FA介导[52]。有研究表明皮层下萎缩显著预测了所有认知指标的变化，而皮层萎缩只与精神运动速度的下降有关。一项在MRI薄层T1成像上进行的对短暂性缺血性卒中患者的特殊评估发现萎缩是显著的，而且影响前循环的TIA患者在TIA后3个月丘脑远端萎缩约10%，这导致3个月内MoCA的认知能力平均下降11%[53]。

　二、小结

在临床中VCIND是一种常见且损害患者脑功能的一种疾病，因此明确该病的高危因素、临床表现及影像学表现，及时诊断并寻找出有效的治疗方法至关重要。目前诊断主要依靠影像检测，由于对VCIND的影像学证据和其诊断标准并不是很统一在临床中，通过MRI技术对VCIND患者进行研究，发现其相应的影像学标志物，从而对预防和及早干预血管性认知障碍，并减少血管性痴呆疾病的发生。

材料与研究方案

　1.1受试者收集

本研究采用临床评估结合神经心理学量表测评的方法在牡丹江医学院红旗医院招募右利手VCIND 42人，认知正常对照组23人。本研究均得到牡丹江医学院伦理委员会的批准，所有被试者均签署知情同意书。

1.1.1 VCIND入组标准：

中国血管性轻度认知损害诊断指南提出的中国血管性轻度认知损害诊断指南（2016）[54]进行收集。

患者或知情者或医生证实认知功能较前有轻度下降≥1个认知功能领域的损害证据低于常模均值1～2个标准差或3％～16％之间；

认知障碍由脑血管病导致，符合以下标准：

A.有心脑血管病危险因素（如高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟等）。认知损伤发生在脑血管事件3个月内或HIS≥7分；或无脑血管事件发生但存在信息处理速度和/或执行功能障碍且具小便、人格异常特征之一；

B.有脑血管病导致的局灶症状或体征，如由白质、基底神经节和／或丘脑损伤所导致，病理改变包括白质损伤、腔隙性梗死和微出血；

C.辅助检查有脑血管病病变的证据：影像学评估涉及脑梗死、白质高信号、出血、血管间隙扩大和其他5个方面，以多发腔隙性脑梗死和广泛融合的白质病变最为常见；

（3）有认知功能障碍主诉或知情人提供的认知功能障碍，低于相同年龄和教育程度均值的1.5倍标准差，各项认知功能评分低于对照组1.5个标准差。

（4）工具性生活能力正常，但需要更多的努力或适应；生活自理能力正常或轻度受损，总体认知功能基本正常，一般认知功能保留，日常生活能力未受损，不符合痴呆诊断标准，排除其他疾病导致的认知功能减退；

（5）患者同意合作，视听力可配合完成测试；

（6）右利手：EHI ≥ +40分；

（7）没有核磁禁忌症（如幽闭恐惧症、固定金属等）；

1.1.2 VCIND排除标准：

（1）可引起认知功能障碍的神经系统其他疾病（如脑肿瘤、帕金森病、脑炎、癫痫等）、脑外伤导致的认知障碍；

（2） 其他可引起认知损害的疾病，如甲状腺功能异常、严重贫血、梅毒、HIV 等；

（3）有精神病史者或先天精神发育迟缓者；

（4）有严重听、视力障碍，不能配合完成检查者。

　1.1.3认知正常对照组入组标准：

选取同期入组年龄、性别、受教育程度相匹配的社会招募的建康受试，均为右利手。

（1）没有认知下降主诉；

（2）校正了年龄、性别、教育程度，在标准化认知功能检测中成绩在正常范围内；

（3）神经系统检查与大内科检查没有阳性症状与体征；

（4）病史包括现病史、既往史、家族史等阴性，查体无阳性所见，既往神经影像学等辅助检查资料无可引起认知损害的阳性所见。

　1.1.4筛选程序：

（1）一般情况调查(包括姓名、性别、年龄、文化程度、职业、利手)和病史调查（包括现病史、既往史、家族史等），并记录查体和既往神经影像学、实验室检查等辅助检查资料。

（2）初步筛选病例，根据排除标准排除不符合条件者。

（3）对初筛获得的病例进行认知功能测评。

　1.2 临床评估

　　1.2.1神经心理测验主要包括：

1.2.1.1简易智能精神状态检查量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)：该测试用于筛查认知功能障碍，由多个认知评估测试组成。MMSE中文版采用张明园修订版。低于以下分数则可诊断为认知障碍：MMSE评分≤19分(文盲），≤22分(小学），≤26分(初中及以上）。

1.2.1.2蒙特利尔认知评估（Montreal Cognitive Assessment，MoCA ）：一个用来对轻度认知功能异常进行快速筛查的评定工具。MoCA中文版采用北京版。MoCA评分≤13分(文盲），≤19分(小学），≤24分(初中及以上）。

　1.2.2影像学评估：

使用荷兰飞利浦公司3.0T TX磁共振仪进行影像学检查。所有受试者均接受T1、T2、弥散加权成像、液体衰减反转恢复序列以及磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging，SWI)，以识别各种标志性影像学改变。获取sMRI数据，对sMRI数据进行分析，拟采用SPM8包完成。其中T1结构像： 选用SPGR 序列， TR=1.9s，TE=2.48ms，FA=9°，FOV=256mm×256mm，MATRIX=256×256，层厚1mm，176 层。

采用总SVD评分项目[55]包括：腔隙性数量≥1个，CMBs数量≥1个，EPVS,WMH脑室周围 Fazekas评分≥3分或深部，上述项目各计1分，各项相加为总SVD评分。(采集入组患者头部磁共振成像例图如下图1、2、3、4)

　1.3 DNA提取方法及检测

　　1.3.1实验仪器

表1主要实验仪器

	仪器名称	型号
1	PCR仪	A-100
2	PCR仪	Gene Amp PCR system 9600
3	电泳仪	JY600+
4	全自动紫外与可见分析装置	FR-200A
5	生物电泳图像分析系统	/

　1.3.2实验试剂

表2主要实验试剂、耗材

	试剂或耗材名称	型号
1	PCR引物	PAGE纯化
2	dNTP	promega
3	Taq酶体系	/
4	ddH2O	/
5	1.5mlEP管	/
6	各型号tips	/
7	PCR96孔板	/

　　1.3.3软件与网络资源

表3主要实验软件与网络资源

		软件	版本	开发商或网址
实验涉及	1	Primer3online	Version0.4.0	http://frodo.wi.mit.edu/
	2	Oligo	Version6.31	MolecularBiologyInsightsInc.,USA
	3	NCBI（NationalCenterforBiotec-hnologyInformation）	/	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

　1.3.4目的基因引物序列

DNA提取收集空腹静脉血5ml并置于-80℃冰箱中，分批进行DNA 的提取。

研究中SNP基因库信息来自公共数据库NCBI GeneBank 数据库，查询基因CLU标准序列。其序列号为 rs11136000 及 rs9331888位点。采用Primer Premier 3.0软件设计 SNPrs11136000 及 rs9331888 位点的 KASP 引物rsl1136000snp位点Primer Allele FAM 引物序列为5′-CCCTGAATCTTACCTTTCTATTGC-3′, Primer Allele HEX 引物序列为 5′-AAACTCCTGACCCCAAGTAATATG-3’，rs9331888snp位点 Primer_Allele FAM 引物序列为5′-CAATTCCCTTCGGAGAGTAGAG-3′, Primer_Allele HEX 引物序列为 5′-GAAAGGGTCCATTGTGTAAGAC-3’。

1.3.5文库制备

　　1.3.6多重PCR的引物调整

1.3.6.1一轮PCR

以多重引物工作液对质控品及NTC进行首轮扩增。扩增体系及反应条件如下所示。

扩增体系：

	ddH2O	Buffer	Primer	dNTP	酶	Sample	Mg2+	石蜡油
		10X	50nM	2.5mM	5U/ul		100mM
10ul	3.2ul	1ul	2ul	0.8ul	0.1ul	2ul	1ul	10ul

PCR 程序：

	温度	时间	循环数
1	95℃	15min	1 cycles
2	94℃	30s	4 cycles
3	60℃	10min
4	72℃	30s
5	94℃	30s	20cycles
6	60℃	1min
7	72℃	30s

1.3.6.2二轮PCR

一轮产物每孔加ddH2O 100ul，瞬时离心，室温静置10min。以稀释液作为二轮扩增模板，扩增体系及反应条件如下：

扩增体系：

	ddH2O	Buffer	Barcode	dNTP	酶	Sample	Mg2+	石蜡油
		10X	2uM	2.5mM	5U/ul		100mM
20ul	3.6ul	2ul	3.6ul	0.8ul	0.1ul	10ul	1ul	20ul

PCR 程序：

	温度	时间	循环数
1	95℃	15min	1 cycles
2	94℃	30s	5 cycles
3	60℃	4min
4	72℃	30s
5	94℃	30s	10 cycles
6	65℃	1min
7	72℃	30s

1.3.7扩增结束后，将PCR产物进行电泳检测，3%琼脂糖凝胶，PCR产物上样5ul，观察电泳条带是否均一，是否有杂带等。

　　图5琼脂糖凝胶电泳质控结果

1.3.8根据多重PCR的重数确定稀释小试样本数(一次384板检测极限)。将小试样本稀释至10-4进行qPCR检测。实验结束后，根据Ct值调整初始的多重引物mix。qPCR扩增体系及反应条件如下。

扩增体系：

	ddH2O	Mix	Primer(1uM)	Sample	ROX
12ul	2ul	6ul	2ul	1.8ul	0.24ul

QPCR 程序：

	温度	时间	循环数
1	95℃	2min	1 cycles
2	94℃	30s	35 cycles
3	60℃	30s
4	72℃	30s

1.3.9产物生产

1.3.9.1 一轮PCR

取调整好的多重引物工作液配制PCR mix，分装于与所需数量相对应的96孔板中。取样本板充分解冻、震荡，1000rpm离心1s后进行加样。加样时每板预留2个孔，分别加入阳性及阴性对照。一轮扩增体系及反应条件如下。

扩增体系：

	ddH2O	Buffer	Primer	dNTP	酶	Sample	Mg2+	石蜡油
		10X	50nM	2.5mM	5U/ul		100mM
10ul	3.2ul	1ul	2ul	0.8ul	0.1ul	2ul	1ul	10ul

PCR 程序：

	温度	时间	循环数
1	95℃	15min	1 cycles
2	94℃	30s	4 cycles
3	60℃	10min
4	72℃	30s
5	94℃	30s	20cycles
6	60℃	1min
7	72℃	30s

1.3.9.2二轮PCR

一轮产物每孔加ddH2O 100ul，瞬时离心，室温静置10min。以稀释液作为二轮扩增模板，扩增体系及反应条件如下：

扩增体系：

	ddH2O	Buffer	Barcode	dNTP	酶	Sample	Mg2+	石蜡油
		10X	2uM	2.5mM	5U/ul		100mM
20ul	3.6ul	2ul	3.6ul	0.8ul	0.1ul	10ul	1ul	20ul

PCR 程序：

	温度	时间	循环数
1	95℃	15min	1 cycles
2	94℃	30s	5 cycles
3	60℃	4min
4	72℃	30s
5	94℃	30s	10 cycles
6	65℃	1min
7	72℃	30s

1.3.10扩增结束后，将PCR产物进行电泳检测，3%琼脂糖凝胶，PCR产物上样5ul，观察电泳条带是否均一，是否有杂带等。

1.3.11文库混样

取96孔板1块。调排枪至5ul，插取Axygen 10ul枪头，PCR板每孔吸取5ul产物转移至U型槽中，转移产物时应慢速吸取，保证无漏吸枪头。取圆底离心管1支，将管盖拧下，以封口膜缠绕圆底离心管的螺旋口2周备用，注意缠绕时为顺时针方向。3. 取200ul移液枪，插取Axygen枪头将U型槽中的产物mix转移至圆底离心管中。

4. 拧紧管盖，涡旋震荡30秒。

5. 将离心管平行固定在摇床上，启动摇床，观察管中液体移动状态，调整摇床至适合的速度，以管中液体振幅最大为宜，将产物mix震荡过夜。

　1.2.12纯化

1. 将混样后的文库上样电泳，电泳完毕后，割取目标片段，将片段切碎，分为4份置于4个1.5ml低吸附EP管中。将内置凝胶的EP管称重，减去管重，计算凝胶质量并记录于管盖。向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul，则加入100ul PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解。

2. 凝胶溶解时，取4个吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500ul平衡液BL，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

3. 将融化好的凝胶溶解降至室温，加入4个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2 min，12000 rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CA2放入收集管中。(吸附柱容积为800ul，若样品体积大于800ul可分批加入)

4. 向吸附柱CA2中加入600ul漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，静置2min，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。此步骤重复2次。

5. 将吸附柱12000rpm离心2 min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2开盖置于室温放置10min。

6. 将吸附柱CA2放到1.5ml低吸附EP管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。4个收集管震荡离心，将其中3个收集管中的溶液以低吸附枪头转移到另一个收集管中，震荡30s并瞬时离心，于4℃暂存。

1.3.13稀释

纯化产物精确定量并稀释至测序所需浓度。

1.3.14高通量测序

1.3.15桥式PCR

1. 使用NaOH将双链DNA文库变性为单链。

2. 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上。

3. 以Flow Cell 表面上的oligos为引物合成第一链。

4. 冲走单链DNA模板，以合成的第一链为模板进行35循环的桥式PCR。

5. 将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除。

6. 阻断3’-OH防止在后续测序过程中继续延伸DNA链。

7. 杂交测序引物。

1.3.16测序反应

1.桥式PCR产物于Illumina X-10测序平台上机测序，操作流程按照标准SOP进行。

2. 试剂配制，加样上机，进行Read1测序。

3.杂交Index测序引物，进行Index测序。

4. Paired End Turnround，合成Read1互补链。

5. 杂交Read 2测序引物，进行Read 2 测序。

rs11136000snp位点散点图rs9331888snp位点散点图

1.4统计分析：

使用社会科学统计软件包（SPSS，21.0）进行统计分析。使用卡方检验、独立样本T检验评估人口统计学变量的分类。采用卡方检验进行 HardyWeinberg 平衡定律吻合度，检验采用卡方检验、随机区组设计资料的多因素方差分析进行比较。所有的统计检验都是双侧概率检验，检验水准以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1. 人口学资料及血管性危险因素的比较

VCIND组和对照组在年龄、性别、种族方面，P＞0.05；两组在吸烟、饮酒史、糖尿病、心脏病、高脂血症等方面，P＞0.05，无统计学无差异，在高血压方面有统计学差异(P <0.05)，高同型半胱氨酸(P =0.071，＜0.1)，其存在较弱显著性(见表4)。

表4 人口学资料及血管性危险因素分析

组别项目	认知正常（23例）	VCIND（44例 ）	t或卡方值	p值
性别（男/女）	11/12	26/16	1.201	0.273
年龄	61.91±10.10	64.36±8.13	-1.063	0.292
民族（朝鲜/民族/蒙古）	2/21/0	3/38/1	0.595	0.743
糖尿病 (无/有)	19/4	32/10	0.362	0.547
高血压(无/有)	14/9	14/28	4.596	0.032
心脏病(无/有)	19/4	37/5	0.375	0.54
吸烟(无/有)	15/8	27/15	0.006	0.94
饮酒(无/有)	16/7	28/14	0.057	0.811
空腹血糖（mmolL）	6.06±2.31	6.37±3.46	-0.393	0.696
总胆固醇（mmolL）	4.33±1.00	4.57±0.92	-0.947	0.347
甘油三酯（mmolL）	1.62±0.93	1.57±0.89	0.194	0.846
高密度脂蛋白（mmolL)	1.29±0.32	1.31±0.29	-0.289	0.774
低密度脂蛋白 （mmolL）	2.36±0.86	2.55±0.78	0.911	0.366
同型半胱氨酸 （umolL）	14.46±9.58	20.18±15.17	-1.841	0.071

2.VCIND与MMSE、MoCA量表比较

VCIND组和认知正常组在简易智力状态检查量表（MMSE）（表5）和蒙特利尔认知量表（MoCA）（表6）组内比较，结果P＜0.01，存在显著性差异。

表5 两组MMSE量表比较

组别	VCIND	认知正常	P值
定向力	9.21±1.00	10.00±0.00	P＜0.001
即刻记忆力	3.98±0.98	4.91±0.29	P＜0.001
注意力与计算力	1.40±0.94	2.87±0.34	P＜0.001
回忆力	0.21±0.52	1.17±0.83	P＜0.001
语言能力	4.43±1.40	7.13±0.63	P＜0.001

表6 两组MoCA量表比较

组别	VCIND	认知正常	P值
视空间及执行功能	2.12±0.86	3.91±0.79	P＜0.001
连线	0.00	0.22±0.42	P＝0.022
立方体	0.55±0.50	0.96±0.21	P＜0.001
画钟	1.57±0.86	2.74±0.45	P＜0.001
命名	2.60±0.50	2.91±0.29	P＝0.002
注意力	4.02±1.02	5.13±0.81	P＜0.001
语言	0.76±0.53	1.74±0.86	P＜0.001
抽象力	0.05±0.22	0.65±0.78	P＝0.001
延迟记忆	0.21±0.47	1.00±1.00	P＝0.001
定向力	4.55±0.97	5.74±0.45	P＜0.001

3.基因型和等位基因频率分布

电泳结果提示,CLU基因认识rs11136000snp位点共3种基因型:TT型、TC型、CC型(见表7 )。 两组TT基因型和T等位基因频率分布相比,VCIND组(23.8%、36.9%)明显高于对照组(4.3%、10.9%),差异有统计学意义。且CLU基因rs11136000位点Ｃ基因携带者（CC＋CT）罹患VCIND的风险是非Ｃ基因携带者（TT）的6.875倍（95％CI为0.820-57.626，P＜0.05）。Rs9331888snp位点共3种基因型:GG型、GC型、CC型(见表8),两组基因型与等位基因对比，P＞0.05，无显著性差异。

表7 Rs11136000与VCIND的关系

分组	例数	基因型			等位基因
		TT	TC	CC	T	C
VCIND	42	10(23.8%)	11(26.2%)	21(50.0%)	31（36.9%）	53（63.1%）
认知正常	23	1(4.3%)	3(13.0%)	19(82.6%)	5（10.9%）	4（89.1%）
X2值	7.087 10.062
P值	0.029 0.002

表8 Rs9331888与VCIND的关系

分组	例数	基因型			等位基因
		CC	CG	GG	C	G
VCIND	42	9(21.4%)	21(50.0%)	12(28.6%)	39（46.4%）	45（53.6%）
认知正常	23	4(17.4%)	9(39.1%)	10(43.5%)	17（37.0%）	29（63.0%）
X2值	1.477 1.088
P值	0.478 0.297

4.VCIND与SVD评分的相关性

VCIND组与认知正常组相比,有显著差异(P <0. 001)（表9），提示在VCIND患者中多表现为腔隙性脑梗死、颅内微出血、血管间隙、脑白质改变等颅内结构性变化。

表9 VCIND与影像学评分之间的关系

	例数	SVD总评分
VCIND组	42	2.12±0.80
认知正常组	23	1.04±0.825
T值		5.117
P值		P＜0.001

在SVD评分亚组中，腔隙性脑梗死、血管间隙、脑白质改变中P值均＜0.05，有显著性差异（表10），故提示有腔隙性脑梗死、血管间隙、脑白质改变的患者更容易产生认知障碍。

表10 VCIND与影像学评分之间的关系

分组	例数	影像学分型
		腔隙性	CMBs	EPVS	WMH
VCIND	42	38(90.5%)	9(21.4%)	18(42.9%)	21(50.0%)
认知 正常	23	16(69.6%)	1(4.3%)	4(17.4%)	3(13.0%)
X2值		4.622	3.331	4.304	8.715
P值		0.032	0.068	0.038	0.003

5.CLU基因snp位点与VCIND影像学交互作用

rs11136000snp位点实验组与对照组SVD总分对比，F＝12.869，P＜0.001，总SVD评分存在显著性，提示CLU基因rs11136000位点与VCIND影像学存在交互作用（表11）；携带rs11136000snp位点的两组比较，在腔隙性脑梗死、脑白质高信号中，P＜0.05（表12）。rs9331888snp位点实验组与对照组SVD总分对比，F＝11.288，P＜0.001，总SVD评分存在显著性，提示CLU基因 rs9331888位点与VCIND影像学存在交互作用（表13）；携带9331888snp位点的两组比较，在脑白质高信号、血管间隙扩大中，P＜0.05（表14）

表11 rs11136000snp位点VCIND患者与影像学的交互作用

分组	Rs11136000	例数	总SVD评分
VCIND	CC	21	1.81±0.784
	TC	11	1.64±0.929
	TT	10	2.90±0.738
认知正常组	CC	19	1.21±0.787
	TC	3	0.33±0.577
	TT	1	0.00
F值 12.869
P值 ＜0.001

表12 rs11136000snp位点VCIND患者与影像学亚型的交互作用

分组	Rs11136000	腔隙性脑梗死	脑微出血	血管间 隙扩大	脑白质高信号
VCIND	CC	0.86±0.36	0.10±0.30	0.29±0.46	0.43±0.51
	TC	0.91±0.30	0.27±0.47	0.45±0.52	0.36±0.51
	TT	1.00±0.0	0.40±0.52	0.70±0.48	0.80±0.42
认知正常组	CC	0.79±0.42	0.05±0.23	0.21±0.42	0.16±0.38
	TC	0.33±0.58	0.00	0.00	0.00
	TT	0.00	0.00	0.00	0.00
F值		4.751	1.255	2.174	7.016
P值		0.03	0.27	0.15	0.01

表13 rs9331888snp位点VCIND患者与影像学的交互作用

分组	Rs9331888	例数	总SVD评分
VCIND	CC	9	2.00±0.707
	CG	21	1.95±0.740
	GG	12	2.50±0.905
认知正常组	CC	4	0.50±0.577
	CG	9	1.00±1.118
	GG	10	1.30±0.483
F值 11.288
P值 ＜0.001

表14 rs9331888snp位点VCIND患者与影像学亚型的交互作用

分组	Rs9331888	腔隙性 脑梗死	脑微出血	血管间 隙扩大	脑白质高信号
VCIND	CC	1.00±0.0	0.22±0.44	0.33±0.50	0.44±0.53
	CG	0.86±0.36	0.14±0.36	0.38±0.50	0.48±0.51
	GG	0.92±0.29	0.33±0.49	0.43±0.50	0.58±0.512
认知正常组	CC	0.50±0.58	0.00	0.00	0.22±0.44
	CG	0.44±0.53	0.11±0.33	0.22±0.44	0.10±0.32
	GG	1.00±0.0	0.00	0.20±0.42	0.44±0.53
F值		6.837	3.662	5.133	9.655
P值		0.11	0.06	0.027	0.003

讨 论

血管性认知障碍是指导致任何程度的认知损害的各种血管性脑部病变，范围从主观认知能力下降到痴呆。典型的VCI患者经常出现心理迟缓和执行功能等问题，包括高级认知功能，如记忆力问题、行为症状和心理症状，以及冷漠、焦虑和抑郁。其他神经体征和症状也经常会发生，包括反射不对称、构音障碍、肌强直、尿失禁或帕金森综合征。痴呆症影响着全世界4750万人，这个数字预计每20年翻一番。痴呆症人群给全世界的医疗保健系统带来了巨大的压力[56]。除了使负担过重的医疗系统不堪重负之外，患者的生活质量以及包括死亡在内的不良后果风险增加。血管性痴呆患者从确诊开始的中位生存期为3至5年。VCIND为血管性痴呆的早期阶段，具有很高的危险性转化为痴呆。我国的一项对VCIND患者随访2年的研究发现其演变为痴呆的比例高达40%[3]。因此，及早进行对VCIND的干预至关重要。对于VCIND，目前还没有明确的遗传危险因素，如果能够寻找简单的遗传和生物诱发因素将会预测VCI疾病的发生并及早干预，将会大大降低血管性痴呆的发生率。

预防VCI的大多数危险因素是可以改变的，因此，针对这些危险因素可能会降低VCI的发生率。根据对大型数据集和计算机模型的分析，导致血管性痴呆的七个最常见的可干预的危险因素：肥胖、高血压、糖尿病、高胆固醇、吸烟、低教育水平和心血管疾病，消除这些危险因素估计将减少痴呆症病例的三分之一[57、58]。本研究结果提示高血压与认知障碍具有相关性，高同型半胱氨酸血症与其具有弱相关性，而吸烟、饮酒史、糖尿病、心脏病、高脂血症等P值＜0.05，不具有统计学意义。高血压促进认知功能下降的机制可能是多方面的，有强有力的证据表明瞬时改变血流影响血管运动能力的功能变化，高血压还会促进微血管稀疏、内皮功能障碍、血脑屏障破坏、神经血管耦合减少、神经炎症反应等，从而导致脑部缺氧引起神经功能障碍[59]。一项前瞻性、以社区为基础的檀香山亚洲老龄化研究发现中年期血压升高而未降压治疗者VaD的风险增加[60]。Tzourio等[61]通过4年的随访发现有高血压病史的老年人认知功能下降的比例是无高血压病史的2.8倍。同型半胱氨酸转化成的半胱氨酸减少，则谷胱甘肽水平下降，导致活性氧增加、氧化应激，从而导致脑部缺氧。既往研究[62]证实了同型半胱氨酸水平的升高与执行功能障碍表现的降低之间的正相关关系。以上结果均支持我们的研究。然而在本次研究中不具有统计学意义的危险因素考虑可能受本次样本量影响。

MMSE和MoCA均能敏感地检测出语言和视觉建构领域的损害以及注意力、言语和视觉记忆、视觉运动速度和执行功能领域的损害等功能缺陷。MMSE是目前被最广泛应用的敏感性和特异性高且简便的认知功能评估量表。本研究结果显示VCIND患者与认知正常患者在视空间及执行功能、语言、即刻和延迟记忆力、定向力、抽象等方面均存在显著差异。记忆可能与海马-颞叶内侧-皮层下功能通路有关，或血管性病变导致海马和皮质萎缩；额叶-眶面外侧环路及前扣带回环路、前额叶-丘脑背内侧核环路参与情绪及抽象思维的控制、颞叶与记忆环路、基底节区参与皮质－纹状体-苍白球-黑质-丘脑-皮质环路系统等通路受损，则会出现相应的执行功能障碍、精神障碍等。一项研究[63]提示视觉运动处理速度障碍是VCI患者中最常见的认知域损害，可高达61.4%。研究表明视觉执行功能的认知障碍可以预测卒中后的不良生存率[64]，而VCI的严重程度与痴呆相关，通过MoCA筛查VCI的严重程度可以帮助临床医生进行干预和改善预后[65]。 MoCA量表评价的认知领域更多并且更加复杂，更加强调了对执行功能和注意力方面的认知功能的评估，可能在执行功能和注意力方面更有优势，但也有研究[66]提示可能因为执行功能的测试非常简短，MoCA在中重度的认知障碍中差异并不明显。Gluhm等人[67]研究得出结论：在40岁以上的患者中，MoCA在记忆、语言和视觉空间能力领域检测到的百分比高于MMSE。本研究结果在MMSE与MoCA的亚项方面均有统计学差异，未表现出明显的不同，第一有可能与样本量较少有关，第二可能是入组患者来源于病房，曾多次发生脑血管疾病，整体认知障碍水平中、重型较多，本研究有超过50%的患者多个领域受损。第三VCIND患者可能也有潜在的AD[68]；因此，执行功能障碍可能不是最显著的特征。

本研究在VCIND组与认知正常组的比较中发现CLU基因的rs11136000snp位点携带者更容易出现认知障碍。考虑CLU基因多态性从以下方面影响血管性认知障碍的发展。

一、CLU基因多态性的表达可使颅内Aβ的沉积增加，破坏血脑屏障，造成大脑功能障碍和损害。CLU编码的糖蛋白在淀粉样蛋白斑中沉积，结合可溶性Aβ肽，与Aβ相互作用影响其构象和毒性，也参与血脑屏障Aβ的清除[69]。一项小鼠模型证明没有Clu的情况下，Aβ的清除转移到更多的血管周围引流[70]。相关研究[71]提示CLU聚集素不仅存在于斑块，而且还存在于大脑内的小动脉和毛细血管。Aβ可能通过降低脑灌注、减少血管储备和增加缺血性损伤而导致血管调节失调。Hee小组[72]研究表明：大约30%的皮质下血管认知障碍，其特征是广泛的脑小血管疾病，在正电子发射断层扫描上有显著的Aβ负荷。Huang等人[73]的研究招募了5名因一侧颈动脉狭窄而患有脑低灌注的痴呆症患者，他们接受了18F-AV1451PET的检查，结果显示痴呆症和单侧颈动脉狭窄的患者与正常对照组相比，整体淀粉样蛋白沉积明显增加。动物研究[74]也表明，急性缺血增加了缺血损伤后不久Aβ前体蛋白的表达和Aβ的产生，从而增强了Aβ在脑中的沉积和清除。Ye等人[75]的研究使用了纵向的队列设计，结果表明淀粉样蛋白负荷独立地导致了小血管疾病患者的认知能力下降。一项相关研究[76]结果显示脑卒中患者血浆Aβ、β-42和tau水平虽低于AD患者，但均高于认知正常组，最重要的是，有痴呆症的卒中患者的Aβ-42血浆水平明显高于非痴呆症患者。一项对72例卒中后认知受损的患者的研究与随访发现[77]，与非AD患者的Aβ沉积的病人比较，有Aβ沉积的病人在卒中后3年内认知功能下降显著。近期有研究发现，WML患者血浆Aβ水平升高与脑白质损伤严重程度及记忆力下降程度相关[78]。综上，CLU基因多态性的表达可使Aβ增加，从而改变大脑的血流调节，消耗血管储备，破坏血脑屏障，降低大脑的修复潜力，造成大脑功能障碍和损害。故CLU基因的多态性可能与血管性认知障碍的发病有关。本研究得出的数据如预期的证实了这一观点。

二、CLU基因多态性可能通过血脂代谢途径影响血管性认知障碍。血管内膜脂质集聚，脑血管内皮功能减弱,损害大脑的新陈代谢,继而出现认知功能障碍。相关研究[79]发现高脂血症患者的血清载脂蛋白J水平高于血脂正常的受试者。Anna Rull团队的研究[79]发现在致密高密度脂蛋白颗粒的子集中存在CLU表达的蛋白，它可以抑制脂质过氧化或降解生物活性的低密度脂蛋白氧化。一项研究是在日本人群中525名无症状的高血脂患者中检测CLU多态性，得出CLU基因多态性可提高女性胆固醇、低密度脂蛋白的水平，增加颈动脉内膜中层厚度，是斑块发生的独立预测因子[80]。既往研究表明血脂可增加血管内皮功能的损伤和血流动力学的改变，容易造成卒中及认知障碍的发生[81]。在曼哈顿北部卒中研究[82]—以人群为基础的病例对照研究中，高密度脂蛋白水平的升高与老年人以及不同种族和民族之间卒中风险的降低有关，增加了与卒中相关的脂质证据；在一项关于颈动脉斑块形态相关危险因素的基于人群的横断面的病例对照研究中[83]，发现有回声斑块的受试者未来发生缺血性脑血管事件的风险更高。在动物研究中也观察到，喂食富含饱和脂肪和胆固醇饮食的大鼠，血脑屏障通透性增加，伴随着认知障碍［84］。结合上述结果，CLU基因多态性可能通过加剧脂质沉积造成血管性认知功能障碍。

我们还发现VCIND在核磁共振上表现为腔隙性脑梗死、脑微出血、脑白质高信号、血管周围间隙扩大。且在腔隙性脑梗死、脑白质高信号、血管周围间隙扩大中P值均＜0.05，腔隙性脑梗死占90.5%，脑白质高信号次之，占50.0%，血管间隙扩大占42.9%。小血管疾病是血管性认知障碍中最常见的损害；小血管疾病以动脉硬化和腔隙性梗死为特征，可引起皮质和皮质下微梗死，并对白质造成弥漫性缺血性损害[85]。Hanna Jokinen等人[86]在3年的随访中发现：在MRI测量的多变量模型中，总的WMH、腔隙仍然是认知功能的独立预测因子。上述结论与本研究的结果相同。其机制可能是阻断了脑内传导通路从而导致认知功能障碍。既往Reitz等人通过对LI对VCIND患者的影响的研究发现：额叶与运动性活动和判断、记忆、抽象思维、情绪、心境等精神活动有关；颞叶与行为、精神、记忆有关；内囊前肢、膝部参与投射到额叶或颞叶的路径；丘脑受损后易产生记忆、言语、定向障碍，故上述部位的腔隙性脑梗死也会引起明显的认知功能障碍[87]。脑白质联系着联合纤维、联络纤维、投射纤维，脑白质的损伤可导致各个脑区的信息传递中断，同时也会导致广泛的胆碱能系统受损，从而导致认知障碍。Chua等人[88]证明VCIND患者有更广泛的脑白质改变所有幕上白质，包括额叶、顶叶、颞叶、枕叶和胼胝体。Wright等人[26]大样本研究发现脑白质病变范围大小与认知功能损害存在明显正相关性，当白质损害累计体积大于0.75% 整颅脑体积时，认知和感觉运动能力将受损明显。Huijts等[42]对189例血管性认知障碍患者研究发现，基底节区EPVs的严重程度与认知障碍程度存在相关性。但是有人发现EPVS并不是认知能力下降的预测指标，Philip Benjamin等人[43]研究得出在5年的随访期内EPVS与认知功能下降无关。这点与本研究结果不同，可能存在EPVs与Lacunes难以区分，或者被WMH掩盖。

CLU基因多态性与VCIND相关的影像学存在交互作用P＜0.01，具有较强的相关性，因此携带CLU基因rs11136000位点、rs9331888位点的VCIND患者颅内更易表现出腔隙性脑梗死、脑白质疏松、血管间隙等影像学变化，导致认知障碍。更加证实了CLU基因多态性通过使颅内Aβ的沉积增加，破坏血脑屏障，造成大脑功能障碍和损害；通过影响血脂代谢途径，使血管内膜脂质集聚，脑血管内皮功能减弱,损害大脑的新陈代谢,继而出现认知功能障碍的可能。在亚组分析中，携带CLU基因rs11136000位点的VCIND患者中，腔隙性脑梗死、脑白质高信号更显著，携带CLU基因rs9331888位点的VCIND患者中，血管间隙扩大、脑白质高信号更显著，综上考虑CLU基因多态性的VCIND可能更多表现出脑白质高信号。深部白质是一个分水岭区域，容易受到血流量和氧气供应减少的影响。脂代谢异常可加重其缺血。Aβ的沉积可导致血脑屏障破坏，从而导致脱髓鞘改变，最终形成WMH，导致血管认知障碍。[89]。有在脑淀粉样血管病患者的研究中，淀粉样蛋白摄取与WMH相关，这表明WMH与淀粉样蛋白之间的相关性可能更强[90]。故CLU基因多态性通过使颅内Aβ的沉积增加，破坏血脑屏障，或脂代谢异常，造成WMH从而导致大脑功能障碍和损害的可能性大。上述结果仍需扩大样本量进一步证实。本研究以一家医院为基础，样本量相对较小。今后应推广以人群为基础的多中心研究和大样本量相结合的研究。另外，CLU基因最初被认为与AD有关的认知障碍密切相关，对于其与血管性认知障碍的研究较少，可加强纵向随访、增加相关研究。

结论

高血压、高同型半胱氨酸血症是VCIND的独立危险因素。VCIND患者的主要表现在视空间及执行功能、命名、注意力、语言、记忆力、定向力，认知的损伤为多领域。CLU基因多态性的rs11136000SNP位点可以作为VCIND出现的生物标志物。VCIND患者头部MRI表现为腔隙性脑梗死、脑白质高信号、脑微出血、血管间隙扩大；携带CLU基因的rs11136000SNP位点、rs9331888位点的VCIND患者更易出现上述表现。且CLU基因多态性与脑白质高信号的关系更明确。

参考文献

[1]YueHana,AihongZhoua,FangyuLiab,etal,Apolipoprotein E ε4 allele is associated with vascular cognitive impairment no dementia in Chinese population[J],J. Neurol. Sci.2020 Feb 15;409

[2]Jia, J., Zhou, A., Wei, C.,et al. The prevalence of mild cognitive impairment and its etiological subtypes in elderly Chinese. Alzheimers Dement[J],2014，10(4), 439–447.

[3]冯学敏，刘晓冰，张仁生，等，血清脑源性神经营养因子水平与血管性痴呆的相关性研究[J]，中风与神经疾病杂志，2013（9）：821-823.

[4]Zanetti M,Ballabio C,Abbate C,et al.Mild cognitive impairment subtypes and vascular dementia in community-dwelling eldly people:a 3-year follow-up study[J].J Am Geriatr Soc.2006.54(4):580-6.

[5]Jin-TaiYu,LanTan,The Role of Clusterin in Alzheimer’s Disease: Pathways, Pathogenesis, and Therapy,Molecular Neurobiology[J],April 2012,45(2),314–326.

[6] Park S, Mathis K, Lee I.The physiological roles of apolipoprotein J/clusterin in metabolic and cardiovascular diseases.Rev Endocr Metab Disord,2014,15(1):45–53.

[7]LiuQ,ZhuZ,Teipel SJ,etal,White Matter Damage in the Cholinergic System Contributes to Cognitive Impairment in Subcortical Vascular Cognitive Impairment, No Dementia[J],Front Aging Neurosci2017;9.

[8]Sachdev P , Kalaria R, O’Brien J, et al.Diagnostic criteria for vascular cognitive disorders: a V ASCOG statement[J].Alzheimer Dis Assoc Disord ,2014,28, 206-218.

[9]Kalaria RN,Neuropathological diagnosis of vascular cognitive impairment and vascular dementia with implications for Alzheimer’s disease. Acta Neuropathol, 2016,131, 659-685.

[10] Skrobot,O.A. etal. Vascular cognitive impairment neuropathology guidelines (VCING): the contribution of cerebrovascular pathology to cognitive impairment. Brain 2016,139, 2957–2969 .

[11] BENJAMIN P，LAWRENCE A J，LAMBERT C，et al. Strategic lacunes and their relationship to cognitive impairment in cerebral small vessel disease[J]. Neuroimage Clin，2014，4（C）:828837.

[12]WARDLAW J M，SMITH E E，BIESSELS G J，et al. Neuroimaging standards for research into small vessel disease and its contribution to ageing and neurodegeneration[J]. Lancet Neurology，2013，12（8）:822-838.

[13]BENISTYS，GOUWAA，PORCHERR，etal. Locationof lacunar infarcts correlates with cognition in a sampleofnon-disabled subjetswithage-relatedwhite-matterchanges：the LADIS study[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry，2009，80（5）：478-483.

[14]WARRENMW，WEINERMF，ROSSETTIHC，etal. Cognitive impact of lacunar infarcts and white matter hyperintensity volume[J]. Dement Geriatr Cogn Dis Extra，2015，5（1）：170-175.

[15]Benjamin P,Trippier S,Lawrence AJ,et al.Lacunar infarcts, but not perivascular spaces, are predictors of cognitive decline in cerebral small-vessel disease[J],Stroke. 2018,49(3):586-593.

[16]Andrew J. Lawrence, Eva A. Zeestraten, Philip Benjamin,et al,Longitudinal decline in structural networks predicts dementia in cerebral small vessel disease[J],Neurology,2018;0:e1-e13.

[17]Gouw AA, Seewann A, van der Flier WM, et al. Heterogeneity of small vessel disease: a systematic review of MRI and histopathology correlations. J Neurol Neurosurg Psychiatry[J],2011; 82: 126–35.

[18]van den Berg E, Geerlings MI, Biessels GJ, et al.White matter hyperintensities and cognition in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease: a domainspecific meta-analysis[J], J Alzheimers Dis ,2018,63(2):515–527.

[19]Wang J，Shan Y，et al.Cerebral small vessel disease: neuroimaging markers and clinical implication[J],Neurol. 2018,doi:10,1007/soo415-018-9077-3.

[20] H. Jokinen, R. Schmidt, S. Ropele, et al, Diffusion changes predict cognitive and functional outcome: the LADIS study[J], Ann. Neurol.2013,73,576–583.

[21]Xu Q，Zhou Y，Li YS，et al. Diffusion tensor imaging changes correlate with cognition better than conventional MRI findings in patients with subcortical ischemic vascular disease[J]. Dement Geriatr Cogn Disord，2010，30：317-326.

[22]Rajikha Rajaa,Gary Rosenbergb,Arvind Caprihan，Review of diffusion MRI studies in chronic white matter diseases[J],Neur oscienceLetters,2019,694,198–207.

[23]Kim SH, Park JS, Ahn HJ, et al. Voxel-based analysis of diffusion tensor imaging in patients with subcortical vascular cognitive impairment: correlates with cognitive and motor deficits[J]. J Neuroimaging 2011;21:317–24.

[24]SANG W S，LEE J M，IM K，et al. Cortical thinning related to periventricular and deep white matter hyperintensities[J]. Neurobio Aging，2012，33 （7）:1156-1167

[25]Delano -WoodL Abelesn SaccoJM etal.Regional White matter pathologyin mild cognitive impairment: differential influence of lesion type on neuropsychological functioning[ J].Stroke, 2008 39(3):794-799.

[26]WrightCB,FestaJR,PaikMC,etal.White matter hyperintensities and subclinical infarction:associations psychomotor speed and cognitive flexibility[J].Stroke 2008 39(3):800-805.

[27]Ludovica Griffantia, Giovanna Zamboni,Aamira Khana,et al,BIANCA (Brain Intensity AbNormality Classification Algorithm): A new tool for automated segmentation of white matter hyperintensities[J],NeuroImage,2016,141,191–205.

[28]Tolle, C.R., McJunkin, T.R., Rohrbaugh, D.T.,et al. Lacunarity definition for ramified data sets based on optimal cover[J]. Physica D,2003,179, 129–152.

[29]Zhao, G., Denisova, K., Sehatpour, P.,et al. Fractal dimension analysis of subcortical gray matter structures in schizophrenia. PLoS One,2016,11, e0155415.

[30]Mustafa, N., Ahearn, T.S., Waiter, G.D., Murray, A.D., Whalley, L.J., Staff, R.T.Brain structural complexity and life course cognitive change. Neuroimage[J],2012,61,694–701.

[31]GREGOIRE S M，SCHEFFLER G，JÄGER H R，et al. Strictly lobar microbleeds are associated with executive impairment in patients with ischemic stroke or transient ischemic attack[J]. Stroke，2013，44（5）:1267-1272.

[32]冯 晓 强 ，夏 从 羊 ，张 峰 ，等,出血性血管性痴呆患者磁敏感成像[J]. 中国老年学杂志，2015，5：2833-2834. 14

[33]高 晓 嵘 ，高 亚 军 ，高 慧 ，等 . 磁敏感加权成像对脑微出血的检测及脑微出血与认知功能障碍关系的研究[J]. 广西医科大学学报，2016，33：745-76.

[34]Ayaz M，Boikov AS，Haacke EM，et al. Imaging cerebral microbleeds using susceptibility weighted imaging：one step toward detecting vascular dementia[J]. J Magn Reson Imaging，2010，31：142148.

[35]Akoudad S，Wolters FJ，Viswanathan A，et a1．Association of cerebral microbleeds with cognitive decline and dementia[J],JAMA Norol，2016,73(8)：934-943．

[36]Greenberg SM, Vernooij MW, Cordonnier C, et al, Microbleed Study Group. Cerebral microbleeds: a guide to detection and interpretation. Lancet Neurol. 2009;8:165–174.

[37]Akoudad S, Wolters FJ, Viswanathan A, et al,Association of Cerebral Microbleeds With Cognitive Decline and Dementia. JAMA Neurol. 2016;73:934–943.

[38]Ding J,Sigurðsson S,Jónsson PV, et al.Space and location of cerebral microbleeds, cognitive decline, and dementia in the community[J], Neurology,2017, 88(22), 2089–2097.

[39]koudad S，de Groot M，Koudstaal PJ，et a1．Cerebral microbleeds are related to loss of white matter structural integrity[J]．Neurology，2013，81：1930—1937．

[40]Huijts M, Duits A, Staals J, et al. Basal ganglia enlarged perivascular spaces are linked to cognitive function in patients with cerebral small vessel disease[J]. Curr Neurovasc Res. 2014;11:136–141.

[41]Maclullich AM，wardlaw JM，Ferguson KJ，et a1．Enlarged perivascular spaces are associated with cognitive function in healthy elderly men[J]．J Neuml Neurosug Psychiatry，2004，75：1519．

[42] Huijts M，Duits A，van Oostenbrugge RJ，et a1．Accumulation ofMRI markers of cerebral small vessel disease is associated with de．creased cognitive function.A study in first-ever lacunar stroke and hypertensive patients[J]．Front Aging Neurosci，2013，5：1．

[43]Philip Benjamin,Sarah Trippier,Andrew J. Lawrence,et al.Lacunar Infarcts, but Not Perivascular Spaces, Are Predictors of Cognitive Decline in Cerebral Small-Vessel Disease[J].Stroke. 2018;49:00-00.

[44]Potter GM, Chappell FM, Morris Z, Wardlaw JM. Cerebral perivascular spaces visible on magnetic resonance imaging: development of a qualitative rating scale and its observer reliability[J]. Cerebrovasc Dis. 2015;39:224–231.

[45]PARK S H，ZONG X，GAO Y，et al. Segmentation of perivascular spaces in 7T MR image using auto-context model with orientation-normalized features[J]. Neuroimage，2016，134:223-235

[46]BOUVY W H，BIESSELS G J，KUIJF H J，et al. Visualization of perivascular spaces and perforating arteries with 7 T magnetic resonance imaging[J]. Invest Radiol,2014,49（5）:307-313.

[47]Van de Pol LA, Korf ES, van der Flier WM et al.Magnetic resonance imaging predictors of cognition in mild cognitive impairment[ J].Arch neurol,2007 ,6499(7): 1023-1028

[48]Glenn T. Stebbins,David L. Nyenhuis,Changsheng Wang,et al,Gray Matter Atrophy in Patients With Ischemic Stroke With Cognitive Impairment[J],Stroke. 2008;39:785-793.

[49]van der Flier, W.M., van Straaten, E.C., Barkhof, F.,et al, Medial temporallobe atrophy and white matter hyperintensities are associated with mildcognitive deficits in non-disabled elderly people: the LADIS study[J]. J. Neurol.Neurosurg. Psychiatry ,2005,76, 1497–1500.

[50]Majon Mullera,Auke P .A. Appelmanb,c,olanda van der Graaf,et al,Brain atrophy and cognition: Interaction with cerebrovascular pathology?[J],Neurobiology of Aging,2011,32,885–893.

[51]Jokinen H，Lipsanen J，Schmidt R，et a1．Brain atrophy accelerates cognitive decline in cerebral small vessel disease：the LADIS study[J]．Neurology，2012，78(22)：1785—1792.

[52]Kim YJ, Kwon HK, Lee JM, et al.Gray and white matter changes linking cerebral small vessel disease to gait disturbances[J]. Neurology ,2016,86:1199–1207.

[53]Andrew Bivard,Thomas Lillicrap,Bénédicte Maréchal,et al,Transient Ischemic Attack Results in Delayed Brain Atrophy and Cognitive Decline[J],Stroke. 2018;49:00-00.

[54]田金洲, 解恒革, 秦斌, 樊东升, 时晶, 王鲁宁. 中国血管性轻度认知损害诊断指南. 中华内科杂志. 2016; 55(3):249-256.

[55]顾雨铖，刘任远，秦若梦等，总MRI脑小血管病评分与认知功能的相关性[J]，国际脑血管病杂志，2018年7月第26卷第7期。

[56]Claire Godard-Sebillotte,Mélanie Le Berre,Tibor Schuster,et al,Impact of health service interventions on acute hospital use in community-dwelling persons with dementia: A systematic literature review and meta-analysis[J],PLoS One. 2019; 14(6): e0218426.

[57]de Bruijn,R.F .A.G. etal. The potential for prevention of dementia across two decades: the prospective, population-based Rotterdam Study[J]. BMC Med.2015,13, 132.

[58] Norton,S., Matthews,F .E., Barnes,D.E., Y affe,K. &Brayne,C. Potential for primary prevention of Alzheimer’s disease: an analysis of population-based data[J]. Lancet Neurol. 2014,13, 788–794.

[59]Zsuzsanna Tucsek M，Hypertension-induced synapse loss and impairment in synaptic plasticity in the mouse hippocampus mimics the aging phenotype: implications for the pathogenesis of vascular cognitive impairment[J],GeroScience ,2017,39:385–406.

[60]Petrovitch H, White LR, Izmirilian G, et al. Midlife blood pressure and neuritic plaques, neurofibrillary tangles, and brain weight at death:the HAAS. Honolulu-Asia aging study[J]. Neurobiol Aging, 2000, 21:57-62

[61]Tzourio C, Dufouil C, Ducimetiere P, et al. Cognitive decline in individuals with high blood pressure:a longitudinal study in the elderly. EVA Study Group. Epidemiology of Vascular Aging[J]. Neurology, 1999, 53:1948-1952.

[62]Michelle M.Y . Laia, Matthew J. Sharmand, David J. Amesa，et al,Relationship of Established Cardiovascular Risk Factors and Peripheral Biomarkers on Cognitive Function in Adults at Risk of Cognitive Deterioration[J],J. Alzheimers Dis.2020;74(1).

[63]YanHong Dong,Melissa Jane Slavin,Bernard Poon-Lap Chan,et al.Improving screening for vascular cognitive impairment at three to six months after mild ischemic stroke and transient ischemic attack[J].International Psychogeriatrics 2014, 26:5, 787–793.

[64]Oksala NK, Jokinen H, Melkas S, et al.Cognitive impairment predicts poststroke death in long-term follow-up[J]. J NeurolNeurosurg Psychiatry 2009;80:1230–5.

[65]Narasimhalu K, Ang S, De Silva DA,et al. Severity of CIND and MCI predict incidence of dementia in an ischemic strokecohort[J]. Neurology 2009;73:1866-72.

[66]YanHong Dong,Vijay Kumar Sharmaa,Bernard Poon-Lap Chan et al.The Montreal Cognitive Assessment (MoCA) is superior to the Mini-Mental State Examination (MMSE) for the detection of vascular cognitive impairment after acute stroke[J].Journal of the Neurological Sciences ,2010,299,15–18.

[67]Gluhm, S., Goldstein, J., Brown, D.,et al. Usefulness of the montreal cognitive assessment (MoCA) in Huntington’s disease[J]. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society,2013,28, 1744–1747.

[68] Chui HC, Zarow C, Mack WJ, et al. Cognitive impact of subcortical vascular andAlzheimer’s disease pathology[J]. Ann Neurol 2006;60:677e87.

[69]Bell RD，Sagare AP，Friedman AE，et a1．Transport pathways for clearance of human Alzheimer’S amyloid beta—peptide and ap01 ipoproteins E and J in the mouse central nervous system[J]．Cereb．Blood Flow Metab，2007，27：909—918．

[70]Aleksandra M. Wojtas, Silvia S. Kang , Benjamin M. Olleyc ,et al.Loss of clusterin shifts amyloid deposition to the cerebrovasculature via disruption of perivascular drainage pathways[J],PNAS，2017（12）E6962–E6971.

[71] J. Scott Miners; Polly Clarke; Seth Love,Clusterin levels are increased in Alzheimer’s disease and influence the regional distribution of Aβ[J],Brain Pathol.2017 05;27(3)

[72]Hee Jin Kim, Seongbeom Park, Hanna Cho, et al.Assessment of Extent and Role of Tau in Subcortical Vascular Cognitive Impairment Using18F-AV1451 Positron Emission Tomography Imaging[J].JAMA Neurology，2018.0975.

[73]Huang, K. L., Lin, K. J., Ho, M. Y., et al. Amyloid deposition after cerebral hypoperfusion: Evidenced on [(18)F]AV-45 positron emission tomography[J]. Journal of the Neurological Sciences,2012,319(1–2), 124–129.

[74]Van Nostrand, W. E., Davis, J., Previti, M. L., et al. Clearance of amyloid-beta protein deposits in transgenic mice following focal cerebral ischemia. Neurodegenerative Diseases,2012,10(1–4), 108–111.

[75]Ye, B. S., Seo, S. W., Kim, J. H., et al.Effects of amyloid and vascular markers on cognitive decline in subcortical vascular dementia[J]. Neurology, 2015,85(19), 1687–1693.

[76]Sung‑ChunTang,Kai‑ChienYang, Chih‑HaoChen,Plasma β-Amyloids andTau Proteins inPatients withVascular Cognitive Impairment[J],NeuroMolecular Medicine,2018,20:498–503.

[77]Liu W，Wong A，Au L，et al．Influence of Amyloid-β on Cognitive Decline Afterr Stroke/Transient Ischemic Attack：Three-Year Longitudinal Study[J].Stroke，2015，46(11)：3074-3080．

[78]Hilal S，Akoudad S，van Duijn CM,et al．Plasma Amyloid-β Levels， Cerebral Small Vessel Disease，and Cognition：The Rotterdam Study[J]．Journal of Alzheimers Disease,2017，60(3)：977—987．

[79]Anna Rull, Maria Martínez-Bujidos, Montserrat Perez-Cuellar,et al.Increased concentration of clusterin/apolipoprotein J (apoJ) in hyperlipemic serum is paradoxically associated with decreased apoJ content in lipoproteins[J],Atherosclerosis,2015,241,463-470.

[80]Van Nostrand, W. E., Davis, J., Previti, M. L., et al. Clearance of amyloid-beta protein deposits in transgenic mice following focal cerebral ischemia. Neurodegenerative Diseases,2012,10(1–4), 108–111.

[81]G.C. Roma ´na, R.E. Jacksonb, R. Gadhia，et al.Mediterranean diet: The role of long-chain v-3 fattyacids in fish; polyphenols in fruits, vegetables,cereals, coffee, tea, cacao and wine; probiotics and vitamins in prevention of stroke, age-related cognitive decline, and Alzheimer disease[J].Rev. Neurol. (Paris)2019,12;175(10)

[82] Sacco RL, Benson RT, Kargman DE, et al. High-density lipoprotein cholesterol and ischemic stroke in the elderly: the Northern Manhattan Stroke Study[J]. JAMA 2001;285(21):2729–35.

[83]Mathiesen EB, Bønaa KH, Joakimsen O. Echolucent plaques are associated with high risk of ischemic cerebrovascular events in carotid stenosis: the Tromsø Study[J]. Circulation 2001;103:2171–5.

[84]Freeman L R，Granholm AC .Vascular changes in rat hippo- campus following a high saturated fat and cholesterol diet[J]． J Cereb Blood Flow Metab，2012，32 (4):643-653．

[85]Skrobot OA, Attems J, Esiri M,Vascular cognitive impairment neuropathology guidelines (VCING):the contribution of cerebrovascular pathology to cognitive impairment[J]. Brain,2016,139, 2957-2969.

[86]Hanna Jokinen, Juha Koikkalainen,Hanna M. et al.Burden of Small Vessel Disease–Related Brain Changes on MRI Predicts Cognitive and Functional Decline[J],Stroke. 2020;51:00-00.

[87]Reitz C，Luchsinger J，Tang MX，et a1．Impact ofplasma l ipidsand time on memory performance in healthy elderly without dementia[J]．Neurology，2005,64(8):1378-1383.

[88]Chua, T. C., Wen, W., Slavin, M. J., & Sachdev, P. S.Diffusion tensor imaging in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease: a review[J]. Current Opinion in Neurology, 2008,21(1), 83–92.

[89]Nidhi Gupta, Alexis N. Simpkins,Emi Hitomi,White Matter Hyperintensity-Associated Blood-Brain Barrier Disruption and V ascular Risk Factors[J]Journal of Stroke and Cerebrovascular Disease,2017.09.026

[90]Gurol ME, Viswanathan A, Gidicsin C, et al. Cerebral amyloid angiopathy burden associated with leukoaraiosis: a positron emission tomography/magneticresonance imaging study[J]. Ann Neurol 2013;73:529–36.

致 谢

时光荏苒，转眼间三年研究生生活接近尾声，在这收获的季节，我们沉浸在丰收的喜悦中，然而，回顾自己三年的求学历程，老师的谆谆教导，朋友的无私帮助，家人的殷切希望，历历在目，我的内心充满了无限的感激和谢意。

我要衷心的感谢我的导师对我的辛勤培养。两位老师总是以高度的责任感对我的临床工作和实验研究提出很多建设性的意见和建议，使我的学习和工作有了明确的方向；他们用心指导我奋力前行，教会我如何成为一名优秀的神经内科医生；他们学识渊博，治学严谨；他们的为人让我折服，完美地诠释了师者，人之模范也；是我今后学习的榜样。在此向他们表示最诚挚的感谢！

我要感谢我的各位老师和同学，他们总是在我最需要帮助的时候给我关怀，给我温暖，给我帮助，在此向他们表示深深的感谢！

我要感谢我的家人，感谢他们在我的学习和生活中总是无私奉献，感谢他们的帮助、支持和包容，我将铭记在心。

最后向参加论文评审、答辩的专家及研究生院的各位老师致以最诚挚的谢意！

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