非洲猪瘟的诊断与治疗

　摘要

非洲猪瘟(ASFV)是一种猪传染性发热疾病，具有较高的致死率。ASFV对工业养猪作业以及小型养猪场产生了严重的社会经济影响，尽管非洲猪瘟在世界许多地区仍然是地方病，但目前仍对发展中国家的粮食安全和全世界的诊断养猪业构成持续威胁。虽然目前有有效的诊断工具来控制非洲猪瘟，但一直缺乏比较有效的治疗手段，目前主要是通过疫苗进行控制，但在疫苗接种方面仍有较大的改进的余地。本文主要通过研究非洲猪瘟的传播、诊断及治疗，为进一步控制非洲猪瘟传播，减少饲养业经济损失做出贡献。

　　关键词：非洲猪瘟；诊断；治疗；致病性

　前言

非洲猪瘟(ASFV)是一种猪传染性发热疾病，具有较高的致死率。除了高烧，这种疾病的特点是有广泛的临床症状。个体结果取决于受感染动物的年龄和病毒的毒力，范围从致命到亚临床。非洲猪瘟病毒(ASFV)与其他具有兽医重要性的病原体密切相关，例如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和绵羊边境病病毒(BDV)。

ASFV对工业养猪作业以及小型养猪场产生了严重的社会经济影响，特别是后者影响到了许多贫穷国家的社会保障和人民福利。由于家猪的这种社会经济重要性，一旦发生ASFV应及时向世界动物卫生组织(OIE)报告。尽管这种感染在世界许多地区的野生和家养猪群中都是地方性的。控制家猪的主要选择是使用有效的改良活疫苗(MLV)进行扑灭和/或接种。根据种群密度和病毒特征，野猪的疾病要么是自限性的，要么成为地方病。在后一种情况下，可以通过狩猎措施或口服免疫进行控制。一些国家已经成功根除了ASFV，并且没有感染，例如加拿大、X、澳大利亚和欧盟。

尽管非洲猪瘟在世界许多地区仍然是地方病，目前对发展中国家的粮食安全和全世界的养猪业构成持续威胁。而对于无非洲猪瘟的国家来说，患病猪可能的重新引入是一个持续的挑战。虽然目前有有效的诊断工具来控制非洲猪瘟，但一直缺乏比较有效的治疗手段，目前主要是通过疫苗进行控制，但在疫苗接种方面仍有较大的改进的余地。几种高效的MLV被用于家猪和野猪的预防性疫苗接种。然而，MLV的使用干扰了血清学诊断，因为接种疫苗的动物无法与在现场感染后存活的猪区分开来。由此产生的对DIVA(区分受感染动物和接种动物)疫苗的需求促使开发了一系列标记疫苗和相应的血清学检测。DIVA活疫苗是控制ASFV的实用选择，因为它们能诱导快速免疫反应，并且可用于野猪的口服免疫。尽管新型疫苗在诱导保护性免疫方面取得了令人满意的结果，但可靠的血清学DIVA概念的实施仍然存在问题。现有标记疫苗的改进以及定制的DIVA分析是可以实现的，但更重要的是，需要就如何使用现有工具的策略进行积极讨论并达成一致。

　1国内外研究现状

　　1.1非洲猪瘟的流行病学研究

ASFV不仅被认为是非洲经济的重大威胁，也是全球猪肉生产的重大威胁[1]。2018年，该病毒出人意料地出现在俄罗斯、中国、蒙古、越南、韩国等几个国家的猪群中[2]。ASFV目前正在世界上的动物中迅速传播，并且很快，在世界多个国家中通过ASFV监测在野猪、家猪和疣猪等中检测到针对ASFV的抗体[3]。

然而，在ASFV流行国家，越来越多的关于具有不同毒力水平的传播ASFV毒株的报告，在易感动物中引起广泛的临床症状。并且在许多国家分离出新菌株，例如乌干达，波兰，法国和乌克兰[4]。ASFV在某些基因中表现出遗传多样性，导致出现更多的基因型。P54和P72基因可用于ASF流行病学诊断，具有OIE推荐的诊断性PCR[5]。迄今为止，已经描述了24种ASFV基因型。中度毒力菌株导致受感染的动物保持无症状。这使得ASF诊断以及疾病的缓解和控制变得更加困难。在2014年至2018年期间，欧盟大陆有九个国家受到ASF的影响。基于部分p72基因和完整p54(E183L)基因的系统发育分析显示，2015年和2017年坦桑尼亚都存在来自有症状猪的基因型II和来自无症状猪的基因型IX[6]。对2010-2018年北非病猪的p72基因(B646L)和p54蛋白基因(E183L)的ASFVC端末端的分析表明，ASFV基因型I是占主导地位的流行基因型[7]。另外据报道，在韩国非军事区野猪中首次检测到的致病菌株属于基因型II[8]。

感染ASFV的野猪尸体通过埋葬处理，被体液污染的土壤样本仍然含有ASF病毒DNA[9,10]。这可能是另一种ASF感染源和野猪感染周期的驱动因素。X在建立减轻ASFV病毒时，发现了三种软蜱物种，显示出ASFV传播的相对风险最高[11]。软蜱O.moubata能够传播非洲和欧亚ASFV菌株，而O.erraticus和O.verrucosus未能传播欧亚ASFV菌株[12]。研究发现，水蛭中的ASFV比无水蛭培养基中的ASFV存活时间要长得多，这表明水蛭可以在没有其主要宿主的情况下作为ASFV的可能宿主[13]。

　1.2ASFV的致病性

自然界中存在高毒力和弱毒力的ASF病毒。非洲猪瘟病毒(ASFV)存在于疣猪和软蜱中，但它不会在这些生物中引起疾病[14]。然而，病毒传播给家猪和野猪会导致出血热。感染高毒力ASF病毒(ASFV)后，在本地家猪和野猪中可见具有高致死性的出血热样疾病。中国田间分离株Pig/Heilongjiang/2018(Pig/HLJ/18)被证明可引起急性疾病伴有发热和出血体征。它可以在实验性感染后6-9天和水平传播感染后13-14天内致命[15]。虽然减毒菌株会诱发不同程度的慢性疾病感染，但一些菌株可导致(即使是低剂量感染)的各种形式的疾病(急性，亚急性和慢性)和80-100%的死亡率，并在内脏器官和血液中发现了最高水平的病毒[16]。如表一所示。非洲猪瘟(ASFV)可以通过大量缺失编码参与调节宿主免疫反应的基因的遗传物质，进而减少毒性，随着毒力降低的ASFV的出现导致对疾病的抵抗力和对ASFV复制的耐受性。

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2非洲猪瘟实例分析

年初，辽宁牧原某繁殖场区猪群突然大面积死亡，症状疑似非洲猪瘟。猪群未接种猪瘟疫苗。

　2.1临床诊断

问诊：通过饲养员得知，病猪死亡前3-5天，出现厌食情况，皮肤出现红紫色小斑点，怀孕母猪发生流产等症状。但并未采集样本送检。

视诊：病猪开始发热、体温高达40-42℃、结膜潮红、充血、皮肤发红、精神萎顿、体表出血、瘀血，下腹、四肢、臀部、会阴等部位尤其严重；病猪出现咳嗽、喘气、呼吸困难，呕吐，食欲减退或废绝，粪便干硬、便秘或排脓性血便，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物等情况。母猪还会伴有不孕、流产、死胎，尤其是母猪、大猪死亡更快。

2.1.1实验室剖检

剖检病死猪时发现脾脏、肝脏、肺脏和淋巴结严重肿大，淋巴结、肾、胃肠粘膜出血，并广泛性出血瘀血。如图一所示：

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　2.1.2PCR试验检测

采集尾根血实验室检测结果：PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：除阳性对照外，有4个样品(20、69、73、86号)PCR结果呈阳性，阳性样品与阳性对照一致，均扩增得到278bp的特异性条带，其中69和73号样品扩增强度较弱；15号样品无扩增片段，检测结果为阴性。如图二所示：

图二

e36bc20a603d03be731a05758e8c7db4 　　2.2诊断

结合临床诊断、PCR荧光检测实验结果判断该猪群死亡原因由非洲猪瘟引起。

3治疗

　　3.1非洲猪瘟的发病机理

(1)非洲猪瘟病毒可以经过猪口和上呼吸道系统进入猪体中，在鼻咽部或者扁桃体内发生感染，感染后病毒首先会迅速蔓延到下颌淋巴结，然后通过淋巴和血液遍布全身。当强毒感染时细胞变化的很快，在出现明显的刺激反应前，细胞都已经死亡了，当弱毒感染时，很容易观察到刺激反应，细胞核会变大，普遍发生有丝分裂。

(2)通常非洲猪瘟的发病率在40-85%之间，具体的死亡率会因为感染的毒株不同而有所差异，比如感染高致病性毒株后，死亡率可高达90-100%；成年动物感染中等致病性毒株后，死亡率在20-40%之间，幼年动物的死亡率在70-80%；当动物感染了低致病性毒株后，死亡率在10-30%之间。

　3.1.1病理变化

(1)第一阶段是潜伏期，一般为4-9天左右，此时猪的活动采食不会受到影响，外观无异常，但病毒会在生猪体内大量繁衍，迅速扩散，从而进入发病期。

(2)第二阶段是发病期，一般为3-5天左右，生猪会开始出现懒惰四肢无力、厌食、体温逐渐增高，皮肤出现小型红紫色斑块，随着病情加重，发绀部位会逐渐扩大，体温会持续到40℃以上。

(3)第三阶段是死亡期，一般在发热后的第7天就会死亡，严重的1-2天便会死亡，在死亡的前期生猪体温下降是其和其它疫情最大的区别。

　　3.2治疗方法

目前没有能够治疗非洲猪瘟的有效药物，只能靠做预防工作来抵御这种病。非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性的动物传染病。世界动物卫生组织(OIE)已将其列为法定报告动物疫病，我国也将非洲猪瘟列为一类动物疫病，是我国重点防范的外来动物的疫病之一。ASF威胁着猪的健康、食品安全、国民经济和环境。考虑到没有疫苗或合理的治疗方法，ASF控制基于实施严格的卫生措施。这些措施包括减少受感染的接触动物种群和出口限制，这可能导致巨大的经济损失。ASFV目前是全球养猪业面临的最大威胁。数以万计的研究人员进行了ASF研究，寻找有效的药物，疫苗和生物安全措施，以防止养猪业中的ASFV。

间接抗病毒药物的开发为ASF的治疗带来了新的希望。一些药物对目前在欧洲和中国流行的高毒力ASFV分离株表现出有效的抗病毒活性，强调了它们作为抗病毒药物开发候选药物的价值。细胞靶向抗病毒丙戊酸(VPA)和蔚蓝素(CRL)在针对ASFV感染进行测试时显示出协同作用[17]。对Vero细胞中芹菜素抑制ASFVBa71V菌株的研究表明，可以在进入和出口阶段抑制ASFV感染[18]。杨梅素和肉豆蔻酸也被认为抑制ASFV蛋白酶活性[36]。在受影响地区设计共同控制措施并为农民提供补偿计划将有助于减少这种疾病的发病率和传播。最近在欧盟国家和中国爆发的疫情凸显了抗病毒研究在抗击ASFV方面的关键作用。

　4预防

　　4.1ASFV疫苗开发

ASF在非洲，欧洲和亚洲的持续传播威胁着全球养猪业。感染高毒力ASFV的猪会发展为出血热样疾病，致死率达到100%。缺乏疫苗限制了疾病控制，从而威胁到养猪业。目前的大多数研究都集中在减毒病毒模型上，但收效甚微。各种新战略正在制定之中。部分研究试图产生一种缺乏A104R基因和辅助细胞系的ASFV-DISC突变体，这些细胞系表达病毒pA104R蛋白，用于产生安全有效的DISC候选疫苗。转基因ASFV，ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK-其中包含毒力相关基因NL(DP71L)和UK(DP96R)的缺失-未能诱导保护免受在猪巨噬细胞原代细胞培养物中复制的亲本ASFV-G的攻击[19]。在猪中接种了两种含有ASFV抗原的腺病毒载体混合物，尽管具有前所未有的强大抗体和T细胞反应，但没有一种免疫原具有统计学意义的保护[20]。

ASFV重组蛋白和表达pcDNAAs的ASFV基因的组合用于对猪进行ASFV免疫[21]。这导致抗体的诱导和特定的细胞介导的免疫反应。然而，免疫猪血清中的抗原特异性抗体缺乏中和ASFV的能力：它们甚至在体外增强了ASFV感染[22]。最近，一个中国研究小组获得了来自ASFVHLJ/18的七种基因删除病毒HLJ/18-7GD。他们发现HLJ/18-7GD可以为猪提供针对致命ASFV挑战的完全保护，但不能恢复毒力。减毒的ASFV血清免疫型IV仅提供对持续至少四个月的同源血清免疫型毒力菌株的保护[23]。联邦病毒学和微生物学研究中心的研究人员开发了针对ASFV血清免疫型IV的疫苗，以保护猪免受同源血清免疫型的毒力ASFV菌株的侵害。这些活疫苗可以在疫情爆发地区提供临时保护。对ASFV基因组遗传多样性的分析表明，广泛的基因组插入和/或删除(indels)在很大程度上归因于同源重组[24]。据认为，ASFV基因组相邻位置中数十个核苷酸的重复元件可能有助于同源重组的发生。许多这些蛋白质的功能和抗原特性仍然未知，这阻碍了疫苗的开发。最近表征的早期蛋白p285L和晚期蛋白pK145R被证明不会显著影响野猪肺细胞系或原代巨噬细胞培养物中的扩散和生产性生长[25]。总之，需要更多的探索和研究来努力开发一种安全有效的疫苗。

　4.1.1预防接种

有条件的地区、养猪小区和猪场可采用猪瘟免疫监测手段，根据猪瘟抗体水平的消长规律进行适时免疫，通常可以采用猪瘟间接血凝试验或者酶联免疫吸附试验来完成免疫效价监测工作。若没有条件进行抗体监测，可根据本地区有无发生猪瘟，采取两种免疫程序。

在有仔猪猪瘟发生的地区或者养殖场里常用乳前免疫方法，在仔猪在吃初乳前就进行猪瘟疫苗免疫，每只猪注射1头份疫苗。

在防治猪瘟工作做的较好(或者无散发仔猪猪瘟)的地区以及养殖场，可在猪20日龄以及60日龄时分别免疫一次猪瘟疫苗；留种用的后备猪，在6月龄时再注射一次；种猪群每年注射2次猪瘟疫苗。

在免疫接种过程中，疫苗剂量要足，针头长短要合适，不打飞针，才能确保免疫效果。

在发病频发的地区或者养殖场要紧急接种，并适当的加大疫苗剂量(可加大1-3倍)能减少发病率和控制疫情蔓延的速度。

　4.2检疫净化

定期对繁殖猪群做采血监测，淘汰带有猪瘟强毒抗体的猪和多次抑制免疫的猪，净化猪群，消除发生猪瘟的几率。做好免疫时用的针头、针管以及注射部位的消毒工作，降低人为疫病传播的几率。

　4.3加强疫苗管理

从正规渠道购入疫苗，严禁使用过期疫苗和失真空疫苗。

稀释好的疫苗要立即用完，在注射时要做好疫苗不离冰桶，桶不离冰，保证疫苗的有效性。

4.4环境控制

每隔一个月或者半个月就要把场内的环境全部消毒1次；每周消毒猪舍1次；饲养工具每2-3天消毒一次；经常更换场门口、各栋舍门口消毒池中的药液，保持消毒药液的有效性。

隔离可疑病猪，对死猪以及污染物必须做好无害化处理工作，严禁出售和食用。

　4.5注意事项

①加强对猪群的管理工作，提高猪群的抗病能力。

②提高猪群的生活条件，冬季御寒，夏季防暑，保持猪舍内有新鲜的空气。

③坚持自繁自养原则，严禁外购商品猪。

④要从无疫情地区引进猪种，引进后还需要将猪隔离检疫观察1个月以上，若猪没有任何发病症状，在注射猪瘟疫苗后才能和其它猪群共同饲养。

5讨论与总结

ASFV仍然是养猪业的一个主要健康和贸易问题，尤其是在有地方性ASFV情况或有野猪养殖的国家。监测以及根除和/或接种疫苗是预防和控制的主要工具。欧洲和世界各地都有疫苗和诊断测试，但仍有改进的余地。然而，在大多数有地方病情况的国家，有更实际或结构性的POSTEL等257(非科学)原因导致疫苗接种失败，无法实施足够的配套措施来控制CSF。由于欧洲大部分地区的流行病学状况较为宽松，因此没有重要的脑脊液研究网络，也没有持续的资金用于开发改进的脑脊液疫苗和诊断(例如，允许可靠地区分受感染的动物和接种疫苗的动物)。需要更多地关注DIVA概念，这些概念有可能减少对反刍动物瘟疫病毒诱导的抗体的干扰。未来的疫苗开发应该更加专注于定制的DIVA分析。

尽管近年来在疫苗和诊断两个领域都取得了技术进步，但在包括欧盟在内的许多国家，通过使用现有的疫苗和诊断分析工具箱，实施从严格的淘汰到疫苗接种到存活战略的转变，缺乏普遍接受的概念来节省资源。应就(i)应使用ASFVDIVA疫苗的情况，(ii)血清学检测和结果解释的标准程序(例如，如何处理接种但无ASFV的群体中预期的假阳性结果数量，以及如何组合不同的检测)达成普遍共识，(iii)假定额外应用PCR技术，以证明不存在病毒基因组；(iv)最重要的是，寻找可能性，提高对从DIVA疫苗接种猪获得的肉类和其他猪产品的接受度，并确定接受紧急情况下获得的产品的市场，这是活疫苗接种策略的先决条件。

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致谢

本文的立题、撰写和修改均得到了指导老师的倾心指导、多次反复修正和细致辅导，谨此表示衷心感谢。感谢指导老师在论文写作时提出的修改意见和建议。导师严谨、精益求精的工作作风，深深感染和激励我。在此谨向指导老师致以诚挚的感谢和崇高的谢意。经过几个月来广泛地搜集资料，参考大量文献，归纳整理写出了该篇论文。在论文写作的过程中，深感自己学识肤浅，在分析问题与提出解决问题时不免有疏漏与不当之处，恳请老师的批评指正。在此我还要感谢学院的诸多老师，他们在传道授业的过程中，让我奠定了良好的理论功底。不但给了我学业上的指导，而且也给了我生活上的启发，这会使我终身受益。