清明草感冒茶提取物抑菌探究

　　目录

摘要

1 引言

1.1 研究现状

1.2 实验目的及意义

2 实验材料与仪器

2.1 材料

2.2 仪器

3 实验方法

3.1 煎煮法

3.2 药材打粉处理

3.3 药粉煎煮浸提

3.4 清明草感冒茶的制备.

4 抑菌实验

4.1 样品溶液配制

4.2 培养基的制备

4.3 菌种的活化

4.4 滤纸片制备

4.5 抑菌操作

5 结果与分析

6 结论

参考文献

致 谢

摘要：清明草感冒茶是项目组前期实践调查中发掘出的少数民族传统用药处方，既具有清热解毒、养生，又具有药用价值（止咳化痰，祛风寒，治疗急性支气管炎），成分为鼠曲草和桔梗。目前清明草感冒茶的相关研究还是较少，尤其是在提取物抑菌活性方面。为进一步了解清明草感冒茶所含的有效成分对细菌是否有抑制作用，本文以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色链株菌、铜绿假单胞菌为供试菌。采用滤纸片法对清明草感冒茶进行抑菌作用研究。结果表明：清明草感冒茶煎煮水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用，对白色链珠菌、铜绿假单胞菌无抑制作用。

关键词：鼠曲草；桔梗；抑菌；清明草感冒茶

Study on bacteriostasis of Qingming Cold Tea Extract

Abstract:Qingming grass cold tea not only has the function of clearing heat and detoxifying, keeping healthy, but also has the medicinal value (relieving cough and phlegm, dispelling wind and cold, treating acute bronchitis). The ingredients are Curdgrass and platycodon. At present, there are few studies on the antibacterial activity of the extracts of Platycodon platycodon. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptomyces albicans and Pseudomonas aeruginosa were selected as test bacteria in order to further understand whether the active ingredients contained in Qingming cold tea have an inhibitory effect on bacteria. The method of decocting and boiling was used to extract Qingming cold tea. The results showed that the extracts of Qingminggrass cold tea decoction had inhibitory effects on Escherichia coli and Staphylococcus aureus, but had no inhibitory effects on Streptomyces albicans and Pseudomonas aeruginosa.

Key words:Curvilinear grass; Platycodon; Bacteriostatic; Qingmingcoldtea

1引言

清明草感冒茶由清明草和桔梗两味中药配制而成。清明草学名鼠曲草（Gnaphlium affine D.Don）别名，佛耳草、清明菜，系菊科鼠曲草属植物[1]。具有化痰止咳、祛风平喘、除湿止痹之功效，主要分布在亚洲地区,以我国和朝鲜、菲律宾等地多见[2]。全草药用。：经过测定，鼠曲草中含有较高含量的黄酮苷。黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、保护心脑血管系统、抗病毒、杀虫等药用效果[1]。桔梗（Platycodongrandiflorus（Jacq.）A.DC.为桔梗科（Campanuaceae）桔梗属植物（Platycodon），性平、味苦、辛、归肺经，有化痰止咳、宣畅肺气、祛痰排脓等功效，可以治疗外感咳嗽、咽喉肿痛、肺痈吐痰等疾病。生长地主要分布在中国、朝鲜半岛、日本和西伯利亚东部[3]，主要药用部位为根部。大量研究表明,桔梗中富含皂苷、多糖、黄酮、多酚、甾体、萜类等成分,并含有十多种氨基酸及镁、铁、锌等多种微量元素[4]。现代药理研究显示,桔梗具有保肝、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、调节免疫等功效[5]。近年来，中药材的开发不断拓展，鼠曲草和桔梗也有一系列的研究，但是在抑菌方面的研究很少。为探索清明草感冒茶是否对细菌具有抑制作用，本文以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色链株菌、铜绿假单胞菌为供试菌，用煎煮法对由鼠曲草、桔梗制成的清明草感冒茶进行浸提，为鼠曲草、桔梗的抑菌实验提供一些相关的参考价值。

1.1研究现状

类黄酮在植物界中是一类较为常见且重要的生物活性物质，各种研究表明，类黄酮和它的金属络合物都具有很强的抑菌活性[6]。类黄酮是鼠曲草中主要的生物活性成分,鼠曲草类黄酮(Gnaphliumaffineflavonoids,GDF)是鼠曲草发挥抑菌和抗氧化功能的重要成分[7]。近几年，绿色食品和医疗保健都在不断的兴起，类黄酮因为其纯天然、活性高、见效快的优点而被当做一类非常有开发价值天然防腐剂来源已经逐步引起人们的关注[8]。类黄酮金属络合物是利用金属离子与类黄酮在一定条件下螯合而成的稳定络合物[9],将类黄酮与人体必需金属元素络合形成类黄酮金属络合物,并发挥其抑菌活性的协同增效作用是较新的研究领域[10],目前国内在该方面的研究还很匮乏。

近年来，国内外学者对桔梗化学成分、药理作用等方面做了大量的研究,尤其在对桔梗皂苷和桔梗多糖方面的研究,取得了很大成就。但是对桔梗提取物抑菌活性方面的研究却鲜有报道[3]。

大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）为人畜共患的重要致病菌，属兼性厌氧革兰氏阴性杆菌，一般存在于人畜肠道内，以及存在于土壤、水环境。大肠杆菌能引起人和动物的感染性疾病，引起人或动物腹泻的致病性大肠杆菌被称为致泻性大肠杆菌[11]。白色念珠菌在免疫缺陷个体中最易感，能引起各种黏膜疾病及全身感染性疾病，发病机理与菌丝形成关系密切[12]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是存在于多种动物体内、体表的条件性致病菌，能够引起多种感染，从轻微的皮肤感染到危及生命的侵袭性感染[13]。铜绿假单胞菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有该菌的存在该菌可以感染多种身体组织或器官，如皮肤和软组织、呼吸系统、血液系统和泌尿系统等[14]。

微生物污染在导致食品腐败变质和直接经济损失的同时，还可能诱发食品中毒对人们的生命安全造成威胁，利用防腐剂抑制微生物生长和有效地预防食品腐败变质是一种简便且行之有效的手段，然而人工合成防腐剂由于其对人有潜在的危害已受到人们的重视，所以在植物中发现高效低毒天然抑菌剂有现实意义[15]。

1.2 实验目的及意义

草感冒茶是项目组前期在实践调查中发掘出的少数民族传统用药处方，具有止咳化痰，疏风散寒的作用，主治风寒表证，咳嗽痰多等证。鼠曲草性味甘、平，具有化痰止咳、祛风平喘、除湿止痹功效，可用于高血压，跌打损伤，风湿等疾病的治疗[16]。桔梗性平、味苦、辛、归肺经，有化痰止咳、宣畅肺气、祛痰排脓等功效，可以治疗外感咳嗽、咽喉肿痛、肺痈吐痰等疾病[3]。近年来,由于抗生素应用的不合理，造成了不少菌种耐药性的增强，同时产生了许多新的临床耐药菌，导致感染性疾病的病死率也在不断增加[16],人们开始关注通过体外抑菌实验筛选出的具有抗菌活性的中药有效成分[17]。国内外也有少数关于鼠曲草和桔梗抑菌活性方面的相关研究，且都有收获，证明了鼠曲草和桔梗具有抑菌活性。因此，作为鼠曲草和桔梗的结合体，清明草感冒茶在抑菌这一方面有很高的研究价值。所以本实验采用滤纸片法[10],对清明草感冒茶进行抑菌实验，为其临床合理应用提供一些数据参考，也为开发利用民族医药提供借鉴。

2 实验材料与仪器

2.1 材料

供试菌种：大肠杆菌、白色链株菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌（由民族医药学院微生物实验室提供）。

药材：鼠曲草、桔梗。

表2-1实验材料

仪器表2-2实验仪器

3 实验方法

3.1 煎煮法

煎煮法就是在药材中加入水，把它煎煮后取汁。该法是应用较早的简易浸出方法之一，也是目前配制浸出制剂中应用最为广泛的工艺。因浸出溶煤一般都要加水，所以有时又叫“水煮法”、“水提法”。适用于有效成分易溶于水，稳定性好的药材。

3.2药材打粉处理

称取110g鼠曲草、30g桔梗置高速粉碎机中进行粉碎取出备用。

3.3 药粉煎煮浸提

称取已经粉碎好的鼠曲草粉100g、桔梗粉25g置1000ml烧杯中，加入500ml水浸泡24h。然后将药渣与溶液一并倒入不锈钢锅中，再加入700ml水煎煮至沸腾30min后过滤，取滤液备用。

3.4 清明草感冒茶的制备.

将滤液用旋转蒸发仪浓缩，得浓缩液，置于水浴锅上蒸干，即得清明草感冒茶提取物。

4 抑菌实验

4.1样品溶液配制

称取由本文3.4纯化所得清明草感冒茶提取物0.2g，倒入10mL烧杯中，加入2mL水，于恒温水浴锅中搅拌溶解，用针筒吸取溶液过微孔滤膜，将所得滤液装于EP管中，备用。

4.2培养基的制备

称取营养肉汤4.5g和琼脂粉3.75g倒进250mL锥形瓶内，加入蒸馏水直至刻度混合溶解，置于立式压力蒸汽灭菌锅内灭菌（121°C,20min），向无菌净化台上的无菌培养皿内倾入培养基，每皿15∽20mL,放平至培养基凝固，即可。

4.3菌种的活化

将配制好的液体培养基（琼脂除外情况下），将移液管从试管内取出2mL,放入立式压力蒸汽灭菌锅（121°C,20min）内进行灭菌，在无菌净化台内用0.5∽10μL移液枪吸取20μL菌种于试管中，再将试管放于37℃气浴恒温振荡器中震荡18∽24h，放于4℃冰箱中保存，备用。

4.4 滤纸片制备

本试验采用的是滤纸片法，用6mm打孔器把滤纸加工成小圆片后，装进清洁干燥的培养皿里面，用报纸包裹严实后，置立式压力蒸汽灭菌锅中灭菌（121°C,20min）。随后放入70°C的烘箱中烘干，备用。

4.5 抑菌操作

4.5.1 涂菌

在无菌净化台内严格操作，采用20∽200μL移液枪将活化后的菌液50μL吸出，注射到营养肉汤培养皿内，涂布均匀，备用。

4.5.2 贴滤纸片

每个染菌培养皿贴3个滤纸片，以青霉素V钾片为阳性对照，无菌水为阴性对照，用无菌镊子取纸片蘸样品溶液，然后贴放于培养皿中，各滤纸片之间对称放置，并将贴好滤纸片的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养18∽24h(培养30∽60min时，倒置培养皿继续培养，以防水珠滴落到培养基上造成菌种的污染，影响实验结果）。测量抑菌圈时，为保证所测数据准确性，每个菌做3次重复实验。

5 结果与分析

表 5-1清明草感冒茶提取物抑菌效果

注：++：表示有抑菌圈且较大；+：表示有抑菌圈；—：表示无抑菌圈.

图5-1大肠杆菌   图5-2金黄色葡萄球菌

　　图5-3白色连珠菌 图5-4铜绿假单胞菌

　　由表5-1可知，清明草感冒茶提取物具有抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用，但不抑制白色链珠菌和铜绿假单胞菌。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用是比较明显的，抑菌圈大小基本上差不多，分别是12.1mm和11.7mm。对白色链珠菌、铜绿假单胞菌无明显的抑制作用，基本没有观察到抑菌圈的存在。作为阳性对照的青霉素V钾片对四种菌的抑制效果都非常强，抑菌圈相对于清明草感冒茶提取物的抑菌圈要大出不少，大小普遍在30mm。作为阴性对照的无菌水则对四种菌完全无任何的抑菌效果，没有观察到丝毫抑菌圈存在的迹象。

6 结论

本论文以清明草感冒茶为原料，通过煎煮法得到提取物，对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、白色链珠菌和铜绿假单胞菌进行抑菌效果探究。通过一步步摸索和改进并重复实验，最终得到并确认了最后的实验结果：

（1）结果分析

清明草感冒茶提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出不同程度的抑制效果，抑菌圈大小分别是12.1mm和11.7mm，对白色链珠菌、铜绿假单胞菌没有明显抑制效果。由清明草感冒茶提取物在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基中有抑菌圈，说明清明草感冒茶提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌活性。清明草感冒茶提取物在白色链珠菌和铜绿假单胞菌的培养基中没有抑菌圈，则有可能是清明草感冒茶对这两种菌没有抑菌活性，或者是煎煮法提取不出清明草感冒茶中对这两种菌有抑菌活性的活性物质。

作为阳性对照的青霉素V钾片对四种供试菌表现出强烈的抑制作用，甚至在探究实验初期由于抑菌效果太强，导致抑菌圈太大而不能得出较好的的实验效果，只能通过一步步稀释其溶液的浓度从而得到大小适合的抑菌圈，但是抑菌效果仍然是非常的明显，为实验结果提供了一部分依据以及鲜明的阳性对照效果。

在探究实验初期所使用的阴性对照本来是生理盐水，但是在实验过程中发现用生理盐水作为阴性对照会有一些抑菌效果，会间接的影响实验效果。所以就换成了无菌水，而作为阴性对照的无菌水则没有抑菌效果，周围的细菌生长较密，通过对比，也更能体现出清明草感冒茶的抑菌效果，为实验结果提供一部分依据。

由此证明清明草感冒茶在与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌相关疾病方面的治疗应该是具有一定的效果的，对于白色链珠菌和铜绿假单胞菌的抑制效果研究还有待考究。

（2）问题及解决方法

此次探究实验遇到了一些问题与困难：1、刚开始时，培养基中会出现阳性对照抑菌圈过大，造成阳性对照抑菌区域与清明草感冒茶抑菌区域互相连通而无法确定清明草感冒茶抑菌活性的真实性，以及在培养基上没有形成完整的抑菌圈；2、前期阴性对照滤纸片区域也会存在抑菌圈，影响到清明草感冒茶已经活性的真实性，造成实验结果模糊；3、实验重复进行一段时间后，会出现培养基中细菌生长情况不佳甚至直接不生长的情况。

分析解决方法：上述第1种情况，是由于青霉素V钾片的抑菌效果太强而造成，用稀释青霉素V钾片溶液的方法，通过多次试验得到的阳性对照抑菌圈来确定阳性对照青霉素V钾片溶液的最佳实验浓度；第2种情况与阴性对照生理盐水可能存在抑菌效果以及贴阴性滤纸片时沾到另外两种液体有关，通过将阴性对照换成无菌水，以及按照先阴性对照，再到清明草感冒茶，最后阳性对照的顺序贴滤纸片；对于第3种情况，与菌种的活性以及涂布细菌的情况有关，通过重新活化新的菌种以及涂菌时涂抹得更均匀一些来解决。

（3）实验存在的不足

此次探究所使用的供试菌较少，提取方法也比较单一。今后还可对其他菌进行抑菌相关的研究，还可通过其他提取方法，继续研究清明草感冒茶的抑菌效果，逐步开发清明草感冒茶的应用价值。

参考文献

1. 林华婷. 鼠曲草类黄酮制备及其抗氧化抑菌活性研究[D].福建农林大学,2016.
2. 何明,张永跟.中药抑菌作用研究现状[J].北京中医药大学学报(中医临床版),2007，14(06):44-46.
3. 王红霞.抗真菌中药研发新进展[J].黑龙江医药,2006(04):310-311.
4. 林伟青,林飞,王海东.鼠曲草对大鼠肺癌形成的抑制作用研究[J].实用中西医结合临床,2020,20(17):1-4.
5. 白丽明,高鸿悦,马玉坤,张文治,张树军.鼠曲草化学成分及其抗氧化活性研究[J].中草药,2016,47(04):549-553.

致 谢

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