蛹虫草双向发酵及抗氧化活性比较

摘 要

本实验选取山药、茯苓、黄芪、姜黄、野菊花、北沙参、鱼腥草和金银花共八种中药作为发酵基质,分别接入蛹虫草菌丝体后进行双向发酵培养,获得发酵菌质。采用超声波法提取发酵菌质中的虫草素,采用水提醇沉法提取发酵菌质中的多糖,并对其多糖含量及抗氧化活性进行比较,结果发现:山药、北沙参、鱼腥草、黄芪、茯苓、姜黄与蛹虫草的双向发酵菌质多糖含量有所增加,且均高于中药以及蛹虫草菌丝体中多糖含量,双向发酵体系中以山药为基质的发酵菌质中多糖含量最高为12.61mg/g;通过进一步的抗氧化活性测定表明,以山药为基质的发酵菌质多糖抗氧化活性最高,DPPH自由基清除能力高达86.11%,羟基自由基清除能力达到63.08%,ABTS自由基清除能力达到78.27%,超氧阴离子自由基的清除能力达到68.82%,均优于蛹虫草多糖。

关键词:蛹虫草;抗氧化;双向发酵

ABSTRACT

In this experiment, eight kinds of traditional Chinese medicines, namely, yam, poria, astragalus, turmeric, wild chrysanthemum, northern ginseng, fishy grass and honeysuckle, were selected as fermentation substrates, and the fermentation mycelia of Cordyceps chrysanthemi were inserted and cultured in both directions to obtain fermentation mycoplasm. The polysaccharide content and antioxidant activity of the fermentation mycelia were compared by using ultrasonic method to extract cordycepin from the fermentation mycelia and aqueous alcoholic precipitation method, and the results showed that the polysaccharide content of the bi-directional fermentation mycelia of yam, northern ginseng, fishoil, astragalus, poria, turmeric and chrysalis increased and were higher than those of the mycelia of Chinese medicine and chrysalis. The polysaccharide content of the fermentation mycelium with yam as the substrate in the two-way fermentation system was 12.61 mg/g, and further antioxidant activity measurement showed that the polysaccharide content of the fermentation mycelium with yam as the substrate had the highest antioxidant activity and was better than that of Chrysanthemum. In this bidirectional fermentation system, the scavenging ability of its mycoplasmic polysaccharide DPPH free radicals reached 86.11%, hydroxyl radicals 63.08%, ABTS free radicals 78.27%, while its scavenging ability of superoxide anion free radicals reached 68.82%.

Key words:Cordycepsmilitaris;Antioxidant;Bidirectionalfermentation

目  录

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料与设备

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 双向发酵菌质的制备

2.2.1.1 菌种活化

2.2.1.2 发酵基质制备

2.2.1.3 接种培养

2.2.2 虫草素含量测定

2.2.2.1 虫草素标准曲线的绘制

2.2.2.2 虫草素的提取

2.2.2.3 虫草素含量的测定

2.2.3 多糖含量测定

2.2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

2.2.3.2 水提醇沉法提取发酵菌质多糖

2.2.3.3 粗多糖含量测定

2.2.4 抗氧化性测定

2.2.4.1 DPPH自由基清除能力测定

2.2.4.2 羟基自由基清除能力测定

2.2.4.3 ABTS自由基(ABTS+)清除能力测定

2.2.4.4 超氧阴离子自由基清除能力测定

第3章 结果与分析

3.1 蛹虫草对不同中药基质的生长适应性

3.2 虫草素标准曲线的绘制

3.3 双向发酵菌质中虫草素含量比较

3.4 葡萄糖标准曲线的绘制

3.5 双向发酵菌质中多糖含量比较

3.6 双向发酵菌质多糖抗氧化性比较

3.6.1 DPPH自由基清除能力测定

3.6.2 羟基自由基清除能力测定

3.6.3 ABTS自由基(ABTS+)清除能力测定

3.6.4 超氧阴离子自由基清除能力测定

结论

参考文献

致谢

第1章 引言

近年来,研究人员颇为关注具有极高的药用价值的虫草类药材。由于对虫草类药材的滥采滥收,导致该类自然资源的限制短缺,造成国内外的市场供不应求。蛹虫草与冬虫夏草同属异种,其在药用价值上与冬虫夏草具有相似的效果,而冬虫夏草的市场价格昂贵,考虑到原材料的成本经济问题,相较之下蛹虫草更适合大量栽培引进,则蛹虫草可以作为冬虫夏草的“替代品”。

蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.Fr.)Link],是一种珍贵的真菌,被誉为北冬虫夏草,其药食两用的特性备受喜爱。它的子实体及菌丝体具有很高的药用价值和保健作用,同时也被作为重要的保健品应用于医药市场上。该物质含有多种生物活性成分,包括但不限于虫草素、多糖、腺苷等,这些成分具有抗肿瘤、抗菌和抗氧化等多种功能[1]。在生物体的代谢过程中,超氧自由基、羟自由基等活性氧的产生导致机体处于低水平的平衡状态[2],然而随着年龄的增长,机体内自由基的清除能力逐渐减弱,从而削弱了对自由基损害的防御能力,如果清除过多或过少的自由基,就会对机体自身组织造成伤害,进而导致各种疾病的发生,并加速机体的衰老[3]。因此,如何增强机体对自由基的抵抗能力已成为当前研究的热门话题之一。由于其具备清除多种自由基的能力,蛹虫草多糖呈现出一定的抗氧化特性和抗衰老特性。

由于蛹虫草的栽培周期较长,且环境条件难以控制,为了满足不断扩大的市场需求,目前研究蛹虫草的最佳生长条件和抗氧化活性已成为热门话题,因此对于蛹虫草的双向发酵培养技术的探究具有重要的现实意义和经济效益。

庄毅[4]等人曾提出将现代微生物转化技术与中药资源有机结合,通过利用药用真菌发酵具有活性成分的中药材,实现菌株发酵过程的“双向性”,即利用微生物所产生的酶以外源性的中药化合物作为底物进行结构转化。这一理论为解决传统发酵生产中存在的问题提供了新思路,同时也推动了生物工程技术的发展。在这一理念的指引下,近年来国内外学者对真菌-中药的双向发酵体系进行了大量的研究,由于其独特的优势而引起了广泛的关注和应用,目前已有许多相关文献报道了多种真菌-中药的双向发酵制备及生物活性方面的研究进展。在对灵芝-巴豆的双向发酵体系进行研究时,陆赛健等人发现菌质提取物的抗氧化活性相较于巴豆显著增强;邓永飞则优化裂褶菌-葛根的双向发酵参数,研究表明该菌质多糖抗氧化活性得到了一定程度的提高。因此,通过菌种的定向选育和发酵工艺参数优化可以实现对天然药物抗氧化活性物质的增效性,从而为开发新型功能保健食品提供依据。

北沙参(Glehniae Radix)是伞形科植物珊瑚菜的干燥根,含有多种活性成分如多糖、香豆素类等[5]。研究人员发现北沙参多糖类成分的含量最高,且具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等生物活性[6]。野菊花为菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L)的头状花序,其具有广谱抗菌、清除活性氧自由基等作用[7]。姜黄主要生长于热带及亚热带地区,其根茎是它主要的药效部位,同时也是主要的天然抗氧化物之一[8]。山药(Dioscorea oppositifolia L.)是传统的药食同源食物,富含淀粉、纤维素等物质[9],山药提取物具有抗氧化活性,可用于清除自由基。茯苓是多孔菌科茯苓属真菌茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥菌核,茯苓多糖具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤及抗氧化[10]等药理作用。鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb)为三白草科植物蕺菜的干燥地上部分,其多糖具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、消炎抑菌及免疫调节等[11]生物活性功能。金银花(Lonicera Japonica)的主要成分为黄酮类、多糖等,而其多糖作为植物重要的活性物质,也具有抗氧化、降血糖及降血脂等作用[12]。黄芪(Radix Astragali)为豆科植物蒙古黄芪的干燥根,具利水消肿,生津养血等功效,还具有明显的抗氧化[13]、抗心血管疾病等药理活性。

基于以上研究,本课题拟选取山药,茯苓,黄芪,姜黄,野菊花,北沙参,鱼腥草,金银花与蛹虫草进行双向发酵实验,并测定双向发酵产物中虫草素含量、多糖含量及其抗氧化活性。通过对蛹虫草和多种中药双向发酵产物的DPPH、羟基、超氧阴离子和ABTS自由基清除能力进行综合分析比较,以此筛选出具有最佳抗氧化活性的组合。近年来,发酵中药已成为备受关注的研究领域,其市场前景广阔,产业化潜力巨大。中药与蛹虫草的双向发酵技术,不仅符合当前绿色环保的发展趋势,而且实现了中药废渣的循环再利用和二次开发,从而提高了经济生产效益。因此,本研究在中药-蛹虫草双向发酵体系相关研究上具有一定的可鉴性。

第2章 材料与方法

2.1 材料与设备

2.1.1 实验材料

蛹虫草(保定学院细胞培养室保存);山药(产地河南);茯苓(产地云南);黄芪(产地内蒙);姜黄(产地四川);野菊花(产地福建);北沙参(产地内蒙);鱼腥草(产地云南);金银花(产地山东)

表2.1 实验药品

材料名称 生产厂家
Tris 上海蓝季生物
水杨酸 福晨化学试剂有限公司

续表2.1 实验药品

材料名称 生产厂家
硫酸亚铁 天津市大茂化学试剂厂
30%过氧化氢 天津市大茂化学试剂厂
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海麦克林生化科技有限公司
蒽酮 天津市科密欧化学试剂有限公司
无水乙醇 天津市汇航化工科技有限公司
焦性没食子酸 天津市光复精细化工研究所

2.1.2 实验仪器

表2.2 实验仪器

仪器名称 型号 生产厂家
超净工作台 SW-CJ-2F 苏州安泰空气技术有限公司
电子天平 CP124 奥豪斯仪器(上海)有限公司
超声波细胞粉碎机 JYQ2-2D 宁波新芝生物科技股份有限公司
紫外可见分光光度计 UV-1601 北分瑞利分析仪器有限责任公司
立式高压蒸汽灭菌器 GR60DF 致微(厦门)仪器有限公司
电热鼓风干燥箱 DHG-9203A 上海-恒科学仪器有限公司
台式大容量低速离心机 DD5 湖南赫西仪器装备有限公司
电热恒温培养箱 DHP-781 湖北省黄石市医疗器械厂
可见分光光度计 TU-1800S 北京普析通用仪器有限责任公司
振荡培养箱 HZQ-F160 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司
电热恒温水浴锅 DK-8D 上海一恒科技有限公司

2.2 实验方法

2.2.1 双向发酵菌质的制备

2.2.1.1 菌种活化

基础培养基:土豆200g/L、麦麸20g/L、玉米15 g/L、葡萄糖20 g/L,水1000mL。准确称取上述材料,将土豆切成小块,加入麦麸、玉米粒,煮沸20min,四层纱布过滤得培养基原液。将培养基分装于锥形瓶中,每瓶100mL,121℃,高压蒸汽灭菌20min。从保存的斜面挑取适量菌丝接种,置于26℃,以150rpm进行振荡培养5-7天。

2.2.1.2 发酵基质制备

准确称取黄芪、山药等8种中药粉末5g于试管中,按料水比1:1、2:1分别吸取蒸馏水于粉末中,搅拌均匀,灭菌备用。依据试验结果确定最佳料水比1:1,用于双向发酵培养。

2.2.1.3 接种培养

用移液管准确量取蛹虫草菌种3mL于中药固体基质中,将接种好的样品放置于培养箱中26℃下,恒温培养二十天。

2.2.2 虫草素含量测定

2.2.2.1 虫草素标准曲线的绘制

将0.5mg虫草素标准品精密称量于电子天平中,加蒸馏水和适量无水乙醇。通过不断搅拌玻璃棒,使虫草素标准品充分溶解,并将虫草素标准溶液的体积定容至100mL,从而制备出母液,其浓度为5mg/L。然后再用移液管将2mL、4mL、6mL、8mL、10mL的上述虫草素母液分别吸取至试管中,再用蒸馏水依次加至10mL,则制备成浓度分别为1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L的虫草素标准溶液,另可准备10mL的蒸馏水作为空白对照。利用紫外分光光度计测定不同稀释倍数下所配制出的虫草素标准溶液的吸收度。在259nm处进行吸光度(A)的测量,并以虫草素浓度(C)为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标,绘制出符合标准的曲线[14]。

2.2.2.2 虫草素的提取

将干燥至恒重的蛹虫草发酵菌丝体用研钵研磨至粉末状,用电子天平准确称取0.5g加入10mL蒸馏水,将超声功率调至400w,超声破碎时间20min后,再于4000r/min离心15min,弃沉淀取上清液待测[14]。

2.2.2.3 虫草素含量的测定

取上述虫草素提取液1mL稀释100倍后,在259nm波长下测量吸光度(A),代入标准方程求出浓度(C),样品中虫草素含量为S=C×V*稀释倍数/m,其中V表示样品体积,m表示蛹虫草质量[14]。

2.2.3 多糖含量测定

2.2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

制备0.1mg/mL浓度的标准葡萄糖溶液。再用吸量管分别吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL葡萄糖标准品母液,试管内加蒸馏水到2.0mL时,其浓度分别为10mg/L,20mg/L,30mg/L,40mg/L和50mg/L。将6.0mL蒽酮硫酸溶液加入不同浓度的葡萄糖标准溶液中,沸水浴中加热15min,冷却至室温。将所配制的不同浓度的样品用可见分光光度法进行分析检测。在625nm处进行吸光度(A)的测定,以葡萄糖溶液浓度(C)为横坐标,并以吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,以蒸馏水作为空白对照[15]。

2.2.3.2 水提醇沉法提取发酵菌质多糖

精确称取0.5g发酵菌丝体,用研钵将其磨成粉末状,溶于20mL蒸馏水中,放入80°C水浴锅内水浴中加热2小时,3000rmp/min离心15min后弃沉淀取上清液,加入无水乙醇四倍体积,静置于冰箱24h。然后以4000rmp/min离心10min后取沉淀,干燥称重,溶解沉淀,静置于冰箱24h,使离心后溶液充分沉淀,取上清液1mL吸收稀释至100倍待用[16]。

2.2.3.3 粗多糖含量测定

吸取以上稀释的粗多糖提取物试样各2.0mL,加入蒽酮硫酸溶液6.0mL,沸水浴15min,冷却至室温。通过在625nm处测量吸光度并代入标准方程,以蒸馏水作为空白对照,得出样品中粗多糖含量S=C×V*稀释倍数/m,其中V表示样品体积,m表示粗多糖质量[15]。

2.2.4 抗氧化性测定

2.2.4.1 DPPH自由基清除能力测定

取2mL各类双向发酵样液与2mL0.2mmol/LDPPH溶液混合,避光反应0.5h后,用蒸馏水及DPPH试剂为对照组,用样品及无水乙醇为空白组。对517nm处吸光度值进行了测定,采用蒸馏水标零[17]。

清除能力W(%)公式:W=[1-(A1-A2)/A0]×100%

A0:对照吸光度值;A1:样品的吸光度数值;A2:空白吸光度值

2.2.4.2 羟基自由基清除能力测定

取1mL各类双向发酵样液在试管内,加入1mL4mmol/L硫酸亚铁溶液,1mL4mmol/L水杨酸乙醇溶液及1mL4mmol/L30%双氧水振荡摇匀生成颜色反应。37°C水浴0.5h,5000r/min离心10min后弃沉淀取上清液待检测。将上述结果利用可见分光光度法,在波长510nm条件下测定吸光度值,测定A0时,使用硫酸亚铁溶液、水杨酸乙醇溶液、蒸馏水混合溶液作为空白,测A1,A2时以蒸馏水为空白[18]。

清除能力W(%)公式:W=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

A0:空白吸光度值;A1:样品的吸光度数值;A2:无水乙醇和样品即对照吸光度值

2.2.4.3 ABTS自由基(ABTS+)清除能力测定

将浓度为7mmol/LABTS等体积的溶液与浓度为2.45mmol/L过硫酸钾混合后,将其储存在阴暗的环境中静置16小时,随后使用无水乙醇进行30倍的稀释。通过可见分光光度法测量吸光度来计算其抗氧化活性。取0.25 mL浓度范围在0.1 mg/mL~2 mg/mL内的样品溶液加入到5 mL ABTS自由基体系中,避光反应0.5h后,在734 nm处测定吸光值。空白对照为无水乙醇[19]。

清除能力W(%)公式:W=[1-(A2-A1)/A0]×100%

A0:空白对照吸光值;A1:乙醇和样品的吸光值;A2:ABTS自由基溶液与样品的吸光度值

2.2.4.4 超氧阴离子自由基清除能力测定

准备0.1mol/L的Tris溶液,以0.05mol/L的HCL溶液调pH至8.2,用10mmol/L的HCL制备3mmol/L邻苯三酚溶液。在温度为25°C的水浴中放置以升温预热4.5mLTris-HCL缓冲液,计时为二十分钟。继续加入各类中药粗多糖提取溶液1mL以及配制好的邻苯三酚溶液0.4mL。经4min后,以0.1mL 8mol/L HCL终止反应,在299nm波长下进行测定吸光度值,用蒸馏水调零,对照组以等体积蒸馏水替代样品[20]。

清除能力W(%)公式:W=(A0-Ax)/A0×100%。

A0:空白对照液吸光值;Ax:样品溶液吸光值

第3章 结果与分析

3.1 蛹虫草对不同中药基质的生长适应性

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图1 蛹虫草在不同中药基质中的生长适应性

  备注:A:山药;B:茯苓;C:鱼腥草;D:姜黄;E:野菊花;F:北沙参;G:金银花;H:黄芪

由图1可知:山药和蛹虫草协同生长状况表现最佳,其菌丝生长速度快,经20天培养后菌丝基本布满基质,且接触紧密;茯苓和蛹虫草之间呈现出协同生长的良好状态,呈现出相对松散的分布状态;黄芪和蛹虫草协同生长状况较好,经20天培养后,中药固体基质并未完全被菌丝体所覆盖;鱼腥草和蛹虫草协同生长状况尚佳,菌丝体量相对较多,但生长状况与山药-蛹虫草双向发酵体系相比较差,鱼腥草与蛹虫草协同生长后的菌丝体生长不完全,约占原中药固体基质体积的1/2;北沙参和蛹虫草协同生长状况尚可,试管底部出现白色菌丝,但菌丝体量较少;野菊花和蛹虫草协同生长状况不佳,仅有个别中药基质表面局部出现少量菌丝;金银花和蛹虫草协同生长状况最差,试管内无菌丝体生长。根据文献查阅,金银花作为一种重要的药用植物,具有较好的抑菌效果。依此可合理推测因金银花自身的抑菌性较强,能够有效地抑制蛹虫草的发酵生长,导致未出现白色菌丝体的生长迹象。

3.2 虫草素标准曲线的绘制

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  图2 虫草素标准曲线

  3.3 双向发酵菌质中虫草素含量比较

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  图3 不同中药-蛹虫草双向发酵菌质中的虫草素含量比较

  根据图3所示,由于八种中药中野菊花和金银花没有获得双向发酵菌质,因此只选取山药、北沙参、鱼腥草、黄芪、茯苓、姜黄六种中药进行虫草素含量的测定。经过超声波细胞破碎后,可得上述中药-蛹虫草的双向发酵菌质的水提物。在各上清液中可检测到虫草素的存在,经对比分析表明,在山药和姜黄的双向发酵产物水提物中,前者的虫草素含量最高,可达1.55mg/g;而后者的含量最低,仅为1.10mg/g。而鱼腥草与蛹虫草双向发酵产物水提物的虫草素含量同上述山药-蛹虫草双向发酵体系中的虫草素含量差异不明显。并且该项数据显示,采用中药-蛹虫草双向发酵技术,发酵菌质中虫草素的含量相较于蛹虫草菌丝体有所提高,说明以合适的中药作为固体基质进行蛹虫草的发酵有利于虫草素的积累。结合蛹虫草在中药基质中的生长状况来看,山药、鱼腥草、北沙参、茯苓、黄芪五种中药均能够与蛹虫草进行双向发酵,并可获得较高含量的虫草素。

3.4 葡萄糖标准曲线的绘制

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  图4 葡萄糖标准曲线

  3.5 双向发酵菌质中多糖含量比较

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  图5 不同中药-蛹虫草双向发酵菌质中多糖含量比较

  根据图5可见,由于八种中药中野菊花和金银花没有获得双向发酵菌质,因此只选取山药、北沙参、鱼腥草、黄芪、茯苓、姜黄六种中药进行多糖含量的测定。上述中药与蛹虫草双向发酵的菌质多糖含量均高于蛹虫草菌丝体以及中药基质中的多糖含量。经对比分析表明,在山药-蛹虫草和姜黄-蛹虫草双向发酵菌质中,前者的多糖含量最高,可达12.61mg/g,约为蛹虫草多糖含量的2倍;而后者的含量最低,仅为7.29mg/g。并且该项数据显示,中药-蛹虫草双向发酵技术能够提高中药基质的多糖含量,另一方面也使蛹虫草的多糖含量有所增加。说明双向发酵过程对中药固体基质的多糖成分产生了显著的影响,即蛹虫草发酵可以促进中药基质中多糖的积累。结合蛹虫草在中药基质中的生长状况来看,山药、鱼腥草、北沙参、茯苓、黄芪五种中药均能够与蛹虫草进行双向发酵,并可获得较高含量的多糖。

3.6 双向发酵菌质多糖抗氧化性比较

3.6.1 DPPH自由基清除能力测定

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  图6 不同中药-蛹虫草双向发酵菌质多糖DPPH自由基清除能力比较

  由图6可见,通过双向发酵技术,山药、北沙参、鱼腥草、黄芪、茯苓、姜黄的菌质多糖具有更强的DPPH自由基清除能力,相较于未添加蛹虫草的中药固体粉末,其DPPH自由基清除能力得到了显著提高。而蛹虫草自身多糖成分的DPPH自由基清除能力不及上述的菌质多糖,后者更表现出明显的优势。通过横向以及纵向数据对比,结果表明:添加蛹虫草有助于提高山药、北沙参、鱼腥草等上述多种发酵菌质多糖的DPPH自由基清除能力,同时中药的添加也增强了蛹虫草自身含有的多糖成分的DPPH自由基清除活性。其中,山药-蛹虫草双向发酵菌质多糖DPPH自由基清除能力最强,清除率达86.11%,远远高于姜黄-蛹虫草双向发酵体系的抗氧化活性,仅为56.79%。说明山药-蛹虫草双向发酵体系表现出良好的抗氧化活性效果。

3.6.2 羟基自由基清除能力测定

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  图7 不同中药-蛹虫草双向发酵菌质多糖羟基自由基清除能力比较

  由图7可见,通过双向发酵技术,山药、北沙参、鱼腥草、黄芪、茯苓、姜黄的菌质多糖具有更强的羟基自由基清除能力,相较于未添加蛹虫草的中药固体粉末,其羟基自由基清除能力得到了显著提高。蛹虫草自身多糖成分的羟基自由基清除能力不及上述双向发酵菌质多糖,后者的羟基自由基清除能力显著优于前者。通过横向以及纵向数据对比,结果表明:蛹虫草的添加有利于山药、北沙参、鱼腥草等上述多种双向发酵菌质多糖的羟基自由基清除能力的提高,同时中药的添加也增强了蛹虫草自身含有的多糖成分的羟基自由基清除活性,且山药与蛹虫草双向发酵菌质多糖的羟基自由基清除能力最高,达到63.08%,姜黄与蛹虫草双向发酵菌质多糖的羟基自由基清除能力最低,仅为43.08%。

3.6.3 ABTS自由基(ABTS+)清除能力测定

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  图8 不同中药-蛹虫草双向发酵菌质多糖ABTS自由基清除能力比较

  由图8可见,通过双向发酵技术,山药、北沙参、鱼腥草、黄芪、茯苓、姜黄的菌质多糖具有更强的ABTS自由基清除能力,相较于未添加蛹虫草的中药固体粉末,其ABTS自由基清除能力得到了显著提高。蛹虫草自身多糖成分的ABTS自由基清除能力不及上述双向发酵菌质多糖,后者的ABTS自由基清除能力优于前者。通过横向以及纵向数据对比,结果表明:蛹虫草的添加有利于山药、北沙参、鱼腥草等上述多种双向发酵菌质多糖的ABTS自由基清除能力的提高,同时中药的添加也增强了蛹虫草自身含有的多糖成分的ABTS自由基清除作用,且山药与蛹虫草双向发酵菌质多糖的ABTS自由基清除能力最高达到78.27%。远远高于姜黄-蛹虫草双向发酵体系的抗氧化活性,仅为57.41%。

3.6.4 超氧阴离子自由基清除能力测定

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  图9 不同中药-蛹虫草双向发酵菌质多糖超氧阴离子自由基清除能力比较

  由图9可见,通过双向发酵技术,山药、北沙参、鱼腥草、黄芪、茯苓、姜黄的菌质多糖具有更强的超氧阴离子自由基清除能力,相较于未添加蛹虫草的中药固体粉末,其超氧阴离子自由基清除能力得到了显著提高;蛹虫草自身多糖成分的超氧阴离子自由基清除能力不及上述双向发酵菌质多糖,后者更表现出明显的优势。通过横向以及纵向数据对比,结果表明:蛹虫草的添加有利于山药、北沙参、鱼腥草等上述多种双向发酵菌质多糖的超氧阴离子自由基清除能力的提高,同时中药的添加也增强了蛹虫草自身含有的多糖成分的超氧阴离子自由基清除活性,且山药与蛹虫草双向发酵菌质多糖的超氧阴离子自由基清除能力最高,达到68.82%,姜黄与蛹虫草双向发酵菌质多糖的超氧阴离子自由基清除能力最低,仅为46.42%。

结论

通过对多种中药-蛹虫草双向发酵过程的研究及抗氧化活性结果分析,可得出以下结论:

1.本课题设计利用山药,茯苓,黄芪,姜黄,野菊花,北沙参,鱼腥草,金银花作为中药固体发酵基质,以蛹虫草为出发菌株,经发酵生长观察整体全貌可知:山药与蛹虫草协同生长的状况最好,菌丝基本布满山药固体发酵基质;最差的是金银花与蛹虫草的协同生长状况,并未观察到菌丝体的生长迹象。

2.双向发酵菌质多糖含量显著优于中药固体粉末以及蛹虫草自身含有的多糖含量。经多糖含量比较分析可得,其中山药与蛹虫草双向发酵体系的菌质多糖含量达到最大值为12.61mg/g,而姜黄与蛹虫草双向发酵体系的菌质多糖提升较少,仅为7.29mg/g,但仍高于姜黄自身多糖含量。

3.在各双向发酵产物水提物中检测得虫草素含量的差异。经虫草素含量比较分析可得,山药与蛹虫草双向发酵产物水提物的虫草素含量达到最大,达到1.55mg/g;姜黄与蛹虫草双向发酵产物水提物的虫草素含量达到最小,仅为1.10mg/g。说明合适的中药作为发酵基质能够促进蛹虫草菌丝体中虫草素含量的积累。

4.各类中药-蛹虫草双向发酵菌质多糖具有显著的多种自由基清除效果,远胜于蛹虫草和中药本身所含的多糖成分的抗氧化活性。其中山药-蛹虫草发酵菌质多糖的DPPH、羟基、ABTS和超氧阴离子自由基的清除效率为最高,分别达到86.11%、63.08%、78.27%、68.82%;而姜黄-蛹虫草的发酵菌质多糖的DPPH、羟基、ABTS和超氧阴离子自由基清除能力最低,分别达到56.79%、43.08%、57.41%、46.42%。

综上所述,在山药,茯苓,黄芪,姜黄,野菊花,北沙参,鱼腥草,金银花这八种中药-蛹虫草双向发酵体系中,最佳双向发酵体系为山药-蛹虫草。这与李慧星[21]等人关于山药-蛹虫草双向发酵提高抗氧化性的研究成果相一致。说明用蛹虫草菌丝体不仅能够在适宜的中药基质上生长,同时也能提高中药中多糖含量并有利于抗氧化活性的增强;产生抗氧化活性增效性的主要因素可能在于菌质成分的种类、含量的变化以及菌质结构的变化,这将为中药-真菌双向发酵体系提供重要的理论支撑和实验基础,同时为多糖抗氧化的进一步利用提供理论支撑。

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致谢

总觉得毕业遥遥可及,终于也到我执笔于此处。我很感谢我的大学四年,或许人生有很多个重要的四年,但这四年一定是我人生中最快乐的四年。

我想真诚的感谢我的导师苗晓燕老师,她温柔坚定、治学严谨,不仅让我学到了专业的知识,更在潜移默化中影响着我。从开题到论文的最终完成,给予我悉心指导,帮助我攻克难关,她的谆谆教诲让我受益匪浅。希望她身体健康,工作顺利。

感谢一直关心陪伴着我的朋友,希想我们的友谊长存,愿我们前程似锦。

最值得感谢的是我的父母,他们没有太高的文化水平,却一直支持让我再努力往上走一走,默默支持着我的每一个选择,他们是我坚定向前的动力。

行文至此,最后向所有关心我的亲人、师长和朋友们表示深深的谢意。向百忙之中抽出时间参加论文评阅和答辩的诸位老师,向你们致以诚挚的谢意。

蛹虫草双向发酵及抗氧化活性比较

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