梅鱼蛋白酶解产物抗氧化性研究

　　随着经济的发展，近些年我国的海洋渔业也到推进。但是也出现了捕捞强度过大的情况，造成了对海洋资源的严重破坏，一些优质的水产品资源正在不断的衰弱，数量不断地下降，然而低值鱼，比如小杂鱼（包括小梅鱼）的比重处在一个不断上升的阶段[3]。这些低值鱼产量每年可以达到100多万吨，主要的特点是形体比较小，营养价值丰富，蛋白质含量较高，往往因为头和内脏所占的比例过大，而被人们忽略其价值，甚至很少能被直接食用[14]。这些鱼的生长周期不想那些优质的鱼类那样那么长，所以获得率较高。但是由于其脂肪、蛋白质含量高，非常容易腐烂。

　　目前，国际水产市场的发展方向是使水产加工变成综合型、深加工。低值鱼的价值也逐渐的到了一些专家学者的重视[2]。]研究表明，其中所含的脂质多为不饱和脂肪酸，具有降血脂，改善心脑血管疾病的作用，其蛋白又都富含人体所需的必需氨基酸，是一种优秀的蛋白质来源。其肉质的酶解产物具有一定的清除自由基和抗氧化、抗菌作用[17]。

　　小梅鱼是一种我国近海捕捞的低值鱼类，主要分布在我国渤海、黄海和东海，主要出产于江苏、浙江、福建、山东的沿海。以渤海、舟山渔场和江苏吕四渔场出产最为丰富。小黄鱼体长而扁侧，呈柳叶形，嘴尖，头内有耳石，背部灰褐色，腹两侧为黄色，鳞片中等大小，背鳍较长，中间有起伏，尾鳍双截形。其肉中富含蛋白质，能够维持身体中钾钠的平衡，能消除水肿。可以提高人体的免疫能力，并具有一定的降血压能力[13]，还能改善贫血，促进生长发育。含有人体所必需的微量元素铜，对于人体中的血液、中枢神经和免疫系统，头发、皮肤和骨骼组织以及肝、心等内脏的发育和功能有重要影响[5]。同时，其中所含的微量元素硒具有抗氧化的作用，其作用机理是通过阻断身体的过氧化反应而起到抗辐射、延缓衰老的作用。能有效的清除人体代谢过程中产生的自由基，能延缓衰老。还可以延缓和抑制癌细胞生长、扩散使癌细胞退化萎缩，对各种癌症有防止功效。

　　生物活性肽简介

　　肽是一种介于氨基酸和蛋白质之间的物质。氨基酸分子是其基本组成单位，两个或以上的氨基酸脱水缩合形成若干个肽键从而组成一个肽，多个肽进行多级折叠就组成一个蛋白质分子[1]。人体中数以百万计的蛋白质因为有了肽，而具有了生理功能和活性。其本身也有非常强烈的生物活性。所谓的生物活性肽是氨基酸以不同组成和排列的方式构成的线性、环形结构的不同肽的总称。其具有多种人体代谢和生理调节的功能，如抗氧化、促进免疫、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂的功效。是目前食品界非常热门的研究课题和具有发展前景的功能因子[15]。

　　1.2.2生物活性肽的吸收机制

　　一般认为，蛋白质是特异性非常强的大分子，在人体内必需被完全的消化降解成氨基酸才可以被吸收和利用[2]。直接由肽进入上皮细胞，在细胞内部被水解的吸收途径一直出于被忽视的状态。但其实，一百多年前，就已经有人提出了由肽直接转运的观点。1959年Aagar等首先观察到肠道能完整地吸收转运双甘肽，此后Neway和Smith证实了肽可以被完整转喻吸收的观点[4]。研究中表明，蛋白质在人体的肠道中并没有完全地被水解成小分子的氨基酸，非常大的一部分的小肽和多肽，都是在小肠黏膜刷状肽酶水解后，以自由氨基的形式进行吸收和转运[19]。

　　小肽和游离的氨基酸相比较，吸收的机制是不同的。小肽的吸收机制主要是依赖与H+或者Ca2+的转运体系，这种转运的特点是，能耗比较低，转运的速度较快，运载体不容易饱和；游离的氨基酸的转运机制主要是依赖于Na+的转运体系，这种转运体系的特点是吸收比较慢，运载体容易饱和，同时消耗的能量比较大。小肽的直接吸收，能够很好的避免同氨基酸之间的吸收，并且由吸收直接进入血液的小肽，相对于氨基酸能够更快的被人体所利用。同时小肽也具有一些游离氨基所不具备的一些功能。如抗菌，降压，降脂以及抗氧化的功能。

　　1.2.3生物活性肽作用概述

　　1.2.3.1抑菌作用

　　抗菌肽，又称抗微生物活性肽，在自然界中广泛分布，原核生物和真核生物中都存在。比较为人所知的是乳酸链球菌素。大部分是50个以下的氨基酸构成的[6]。有亲水性和亲脂性。作用机理是亲脂性的与细菌细胞膜结合，亲水性的与其体液融合，能使细菌的细胞膜被破坏形成小圆孔，是细胞泄漏，导致生长受阻或者直接死亡。

　　1.2.3.2抗氧化及清除自由基的作用

　　近些年来的大量对低值鱼的研究表明，鱼肉中的蛋白酶解肽是具有抗氧化性作用的，其抗氧化的能力强度与分子量的大小、氨基酸的组成有着密切的关系[9]。有报道称非常多的氨基酸机器衍生物都具有抗氧化的能力，比如半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、5-羟色氨酸等。有一些研究者认为肽的抗氧化能力与它的肽片段中所含的疏水氨基酸有一定关系，其指出N-端为疏水性氨基酸缬氨酸或者是亮氨酸的时候，抗氧化的能力较强[20]。这很可能是因为疏水性的氨基酸可以使抗氧化肽与脂肪酸的互相作用增强，同时提高了其脂质自由基的捕捉能力[15]。另外，氧化的强弱还与肽中所含的一些可以于自由基反应的特殊基团有关系，即所谓的供氢基团，只有当这些肽具有适当分子量的时候，这些特殊的供氢基团才可以得到最大程度的暴露，并与自由基作用，这时候才具有比较强的抗氧化活性[18]。运用天然抗氧化剂取代合成的抗氧化剂是未来食品行业的发展趋势。在实验中发现，鱼蛋白酶解液中分离所得到的一些多肽、短肽，在不同的抗氧化体系中表现出不同的抗氧化能力。肽是一种具有巨大潜力的天然的抗氧化剂资源，从动物蛋白酶解液中去找寻新型的清除体内自由基的抗氧化剂也将是现代医药、保健行业、食品行业的一个发展方向。

　　自由基是体内氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，主要有一下几个危害：第一：可以损伤集体的组织和细胞，削弱细胞的抵抗能力，是身体容易收到细菌和病菌的感染；第二：会产生破坏细胞的化学物质，形成致癌物质[12]；第三：改变细胞内的遗传信息，干扰细胞生长和分化；第四：破坏细胞膜干扰细胞的新陈代谢，是细胞膜丧失保护细胞的能力；第五：侵袭细胞组织及荷尔蒙所必需的氨基酸，干扰体内系统的运作，导致恶性循环，以至产生更多的自由基危害全身[19]；第六：破坏蛋白质破坏体内的酶，导致炎症和衰老[16]。

　　在人体内，96-99%的O2产生超氧化阴离子、羟自由基和过氧化氢，可以使成膜结构丧失其原有的生物学功能，导致线粒体、DNA、RNA、生物膜等广泛损伤，从而引起各种疾病。

　　2实验材料、试剂、与器材

　　2.1原料

　　小梅鱼：购于市场

　　2.2试剂

　　试剂规格厂家

　　邻二氮菲

　　中性蛋白酶250G

　　250G上海生工生物工程有限公司

　　上海生工生物工程有限公司

　　硫酸亚铁2mol/L，50mL上海生工生物工程有限公司

　　无水乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司

　　双氧水分析纯国药集团化学试剂有限公司

　　邻苯三酚分析纯国药集团化学试剂有限公司

　　多肽冻干粉分析纯国药集团化学试剂有限公司

　　DPPH分析纯国药集团化学试剂有限公司

　　氢氧化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司

　　邻苯二甲酸氢钾分析纯国药集团化学试剂有限公司

　　2.3主要仪器

　　仪器名称厂家

　　电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂

　　分析天平北京赛多利斯天平有限公司

　　电热恒温箱余姚市金诺天平仪器有限公司

　　UV-2100可见紫外分光光度计上海益恒实验仪器有限公司

　　电子pH仪

　　磁力搅拌器

　　RC-6 Plus高速冷冻离心机

　　微量移液器杭州永洁达净科技有限公司

　　上海雷磁新泾仪器有限公司

　　X热电仪器有限公司

　　北京金辉盛业科技有限公司

　　将小梅鱼用水洗净，去掉头、内脏、鱼骨，集中起来剁碎，放入烧杯中，加入去离子水，用匀浆机搅拌，搅拌过后用pH仪调节pH值到7.0，并以2500U/g加入中性蛋白酶，在水浴锅中酶解1~12h。酶解结束后，在100℃下加热10min灭酶，用冷冻离心机在4℃（10000/min），之后放入-20℃下保藏备用。

　　采用邻二氮菲法，取0.75mmol/L邻二氮菲1.0mL，pH7.4的PBS 2.0mL，蒸馏水1.0mL，混合均匀，加入0.75mmol/L硫酸亚铁1.0mL，0.12%双氧水1.0mL(新鲜配制)，振荡混匀，记作AP；以1.0mL蒸馏水代替1.0mL的0.12%的双氧水，其余条件同AP处理记作Ab；以1.0mL酶解液代替1.0mL蒸馏水，其余条件同AP处理记作As。AP、Ab、As均在37℃水浴锅中保温60min，然后蒸馏水调零，测定536nm处吸光度，并计算羟自由基清除率：

　　As－AP

　　羟自由基清除率/%＝——————×100

　　Ab－AP

　　取多肽溶液备用。取邻苯三酚0.1mL并加入Tris-HCl（pH 8.2）缓冲溶液5 mL于试管中，加入不同浓度的水解液0.25 mL，迅速混匀，25℃水浴保温15 min后使用1cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320nm处时测吸光度Ai，并测定本底扣除水解自身的干扰，水解液对超氧阴离子自由基清除率按式计算[14]。

　　清除率S=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100%

　　式中，A0———试剂空白的吸光度值；Ai———样液的吸光度值；Aj———样液本底的吸光度值。

　　称取适量多肽冻干粉溶于10mL蒸馏水，溶解后分别取1mL至反应体系，其中样品组为1mL DPPH+1mL样品；对照组1为1mL 95%乙醇＋1mL样品；对照组2为1mL蒸馏水＋1mL DPPH；调零组为95%乙醇。混合均匀，避光反应30min。检测各组在波长535nm处的吸光度，依次记为A1、A2、A3，计算清除率。

　　A3－(A1－A2)

　　DPPH自由基清除率/%＝————————×100

　　A3

　　采用电位滴定法。吸取约20mL含氨基酸的样品溶液转移至100 mL容量瓶中，加水至标线定容，混匀后吸取20.0mL定容液置于200mL烧杯中，加入去离子水60mL，开动磁力搅拌器，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH值8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数；加入10.0mLpH值8.2、40%中性甲醛溶液，混匀，再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH值9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数[7]。同时取20mL去离子水置于另一200mL洁净烧杯中，先用氢氧化钠标准溶液调至酸度计指示pH值8.2(此时不计碱消耗量)，再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH值9.2，作为试剂空白，滴定用氢氧化钠溶液要提前用邻苯二甲酸氢钾进行浓度标定。采用下列公式计算氨基氮：

　　氨基氮(%)=((Vl—V2)×c×0.014/(m×20／100))×100

　　公式中：

　　V1=样品稀释再加入甲醛后滴定至终点(pH值9.2)所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；

　　V2=空白实验加入甲醛后滴定至终点(pH值9.2)所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；

　　c=氢氧化钠标准溶液浓度(mol/L)；

　　0.014=氮的毫摩尔质量(g/mm01)；

　　m=测定用样品溶液相当于样品的质量(g)；

　　水解度(DH)的测定

　　DH(%)=(已水解的肽键数/原料中总肽键数)×100=((B—C)/(A—C))×100

　　公式中：

　　A=原料中总氨基氮数；

　　B=水解液中的氨基氮数；

　　C=原料游离的氨基氮数；

　　B和C通过氨基氮的测定方法测定，C也由上述方法测定完成，用10mL非酶解样品替代。

　　将的到的蛋白液与中性蛋白酶混合，放入恒温水浴锅中，恒温水浴。从1~12个小时不等。得到的不同水解程度的酶解液，来研究其抗氧化性。水解程度随着时间的增加，逐渐增加，5小时以后水解程度不再有太大的变化，如图1。基本维持在27.12%左右。

　　图1水解时间与水解度关系曲线解度关系曲线

　　氨基氮所指的是以氨基酸形式存在的氮元素含量，该指标可以反应出被测物质的鲜度。该指标越高，说明被测物质中的氨基酸含量越高，鲜味越好。在本实验中，通过测量中性梅鱼蛋白酶解液中的氨基氮含量来作为一个水解程度的判断。测定的结果如图1。

　　羟自由基的清除作用

　　用不同水解程度的蛋白酶水解液对羟基自由基的清除率进行测定。本实验中采用邻二氮菲-Fe2+作为氧化还原指示剂，其原理是其在反应过程中会出现颜色的变化，从而反映出液体中氧化还原状态的改变。在这个体系中通过Fenton反应产生HO•，可以使邻二氮菲-Fe2+水溶液被氧化成为邻二氮菲-Fe3+，使得邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，通过这个来计算体系中HO•的变化[10]。

　　羟基自由基产生方程：

　　Fe2++H2O2→Fe3++OH—+HO•

　　图2酶解时间与羟基自由基清除关系曲线

　　通过图2，可以看到中性的梅鱼蛋白酶解液，对于羟自由基没有表现出良好的清除能力。其中在九小时前表现出上升的趋势，说明在九小时内，水解程度越大，清除羟自由基的能力越强。过了九小时之后，清除羟自由基的能力逐渐下降。由图二可以看出对羟基自由基的清除作用并不理想

　　对DPPH体系中的自由基清除作用

　　本实验中用分光光度法来测定中性梅鱼蛋白酶解液的DPPH清除能力。DPPH自由基有机溶液呈现出紫色，通过测量在535nm处的吸光度，来计算其清除能力[9]。这种方法主要是利用自由基清除剂提供的一个电子与DPPH自由基中的孤对电子配对，使得自身溶液从紫色变成黄色[10]。

　　通过测量，得到各组在535处的吸光度，通过计算得到其DPPH自由基清除率。如图3

　　通过观察图3，可以知道，酶解时间为横坐标，清除率为纵坐标。水解时间越长的中性梅鱼蛋白酶解液，清除的效果越好。当酶解的时间为10h时，清除效果最佳，溶液中所剩的DPPH自由基含量最少。但是DPPH自由基的含量总体水平均在85%以上，所以说，中性梅鱼蛋白酶解液对DPPH自由基的清除率的效果并不是特别的理想。

　　图3酶解时间与DPPH自由基清除率关系曲线

　　超氧阴离子自由基清除活性的测定

　　超氧阴离子自由基（O-2）是一中活性的氧粒子，是在新陈代谢的过程中不断产生的一中中间产物。过量的超氧阴离子的存在会对机体产生一定的毒害作用，生物体的衰老和病变的发生，都与这种离子有着直接或间接的关系。

　　在碱性的条件下，邻苯三酚会发生自身氧化反应，会生成中间产物超氧阴离子自由基以及有色的中间产物[13]。超氧阴离子又可以促进邻苯三酚的自身氧化，本实验通过测定中性梅鱼蛋白酶解液对邻苯三酚自身氧化的抑制作用[11]，也就是比较在320nm处的吸光度，经过计算可以得到清除率。

　　图4酶解时间与超氧阴离子清除率的关系曲线

　　结果表明中性梅鱼蛋白酶解液对超氧阴离子的清除作用并不是特别的理想，如图4。基本维持在20%上下。从相关的理论上分析，有可能是中性梅鱼蛋白酶解液中含有与邻苯三酚相似，其分子结构中都存在羟基，超氧阴离子自由基在加速邻苯三酚自氧化的同时，也加速了相似物质的氧化，从而导致清除的作用不明显[20]。

　　酶解时间（h）羟基自由基清除率DPPH清除率超氧阴离子清除率

　　1 7.8965%1.1561%16.2777%

　　2 7.8990%4.8702%22.3344%

　　3 7.9124%7.9611%13.7554%

　　4 7.9159%8.0776%17.5395%

　　5 7.9458%9.8631%19.1799%

　　6 8.3654%8.7134%12.9969%

　　7 8.5783%11.3101%20.6941%

　　8 8.7159%9.4828%17.9243%

　　9 9.0045%12.4502%24.4795%

　　10 9.1025%14.6497%16.9086%

　　11 9.1000%14.2106%23.0915%

　　12 9.0025%13.8205%21.0835%

　　表一酶解时间与三种自由基清除率的关系

　　本实验采用DPPH自由基体系、羟基自由基体系、超氧阴离子自由体系来评价梅鱼蛋白酶及产物的抗氧化能力。根据实验数据表明，梅鱼蛋白酶解产物具没有良好的抗氧化能力，对DPPH，羟基自由基、超氧阴离子并没有表现出良好的清除能力。同时也发现，不同水解程度的梅鱼蛋白酶解产物的自由基清除能力也是不同的。在DPPH自由基体系中，随着水解时间的增加，清除能力稍微减弱了；在羟基自由基的体系中，水解时间为9h时，自由基的清除能力达到最强；在超氧阴离子自由基体系中，在9h表现出最强的清楚效果。从理论上分析的原因之一为可能是由于不同水解度所产生的活性肽产物的同时，可能也产生了一些其他具有氧化性的一些物质，导致与其本身的抗氧化因子反应，从而减弱了其抗氧化能力；或者梅鱼蛋白酶解产物的抗氧化能力本身就不具备很强的抗氧化性，或许通过螯合或者进一步处理，能具备较好的抗氧化性[17]。

　　图5酶解时间与三种自由基清除率的关系

　　从图5可以看出，中性梅鱼蛋白酶解液对超氧阴离子自由基的清除率是最好的，对羟基自由基的清除率并不是特别好。

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