摘要：随着分子生物学等现代生物学技术的发展和应用对胚胎发育模式的研究逐渐发展到分子水平，原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）作为一种有用的测定基因表达模式的方法被广泛应用，本文综述了原位杂交实验原理（3 部分内容）；原位杂交实验技术的分类；地高辛标记RNA探针检测胚胎中SHH基因表达方法技术分析；对照实验的设置；原位杂交注意事项；原位杂交技术的应用等问题。
关键词：原位杂交；分子杂交；核酸探针；疾病检测
1 原位杂交
原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）：又称原位杂交组织化学（in situ hybridization histochemistry），是一项分子杂交与组织化学相结合的技术。该技术应用特定标记已知序列的核酸探针（DNA探针或RNA探针）与组织细胞中（组织切片、细胞涂片或印片）的靶核酸以碱基互补配对原则特异性结合形成杂交体，再通过与该杂交体相应的检测系统将靶核酸在原有的位置上检测出来。原位杂交技术的主要操作为四步：首先制作样品将要检测的mRNA暴露出来，然后标记已知特定序列探针，并把待测样品与标记探针杂交，最后用组织化学方法将目的杂交双链检出。此方法完整的保留了组织细胞形态且有很高的敏感性和特异性，可获得并研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达定位和相对定量的信息，及各种因素对它的影响，有利于进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。
2 原位杂交实验原理
2.1 分子杂交原理
分子杂交依赖于核酸间碱基互补配对原则（A与T,A与U,G与C）具有特异性，在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）配对的碱基对之间非共价键结合（主要是氢键），形成稳定的双链区。分子杂交可在DNA与DNA、DNA与RNA以及RNA与RNA的两条单链之间进行。分子杂交操作中将待测核酸分子高温变性成为单链与特定标记已知序列的核酸探针低温复性杂交，最后通过组织化学等方法检测，不同来源的核酸单链与探针有不同程度的互补从而形成不同稳定性的杂交双链，由于目的序列与探针特异性匹配程度最高，理论上结合最牢固，杂交体最稳定。在分子杂交时通过控制杂交温度等杂交条件保证特异性结合的同时减少非特异性结合，温度较低时信号强背景信号干扰也强，同时非特异性杂交较多；温度高时信号弱非特异性杂交较少，最后经组织化学检测后获得清晰准确的原位杂交结果，从而研究目的基因的表达调控等。
2.2 核酸探针标记原理
分子杂交所用的探针是含有与目的序列互补顺序的外源性被标记的核酸片段，探针的碱基序列已知，在原位杂交过程中，通过碱基互补配对与目的序列结合，通过检测标记对目的序列定位分析。根据核酸探针的来源和性质不同可分为DNA探针（单链DNA探针或双链DNA探针），cDNA探针，RNA探针及寡核苷酸探针四类。其中DNA探针多为某一基因的全部或部分序列，该类探针制备简便，不易降解，有多种标记方法；cDNA探针依赖于逆转录酶经RT-PCR获得不含有内含子的DNA探针，广泛用于基因表达检测等研究；RNA探针（同义RNA探针和反义RNA探针）可通过体外转录技术获得，该类探针与靶序列的杂交效率很高，可用于检测DNA和mRNA及基因转录状况等，但具有易于降解等缺点；寡核苷酸探针通过化学合成的方法获得，链短且复杂程度低，可识别靶序列内1个碱基的变化，因而具有特殊用途。在实际操作时可根据不同的目的，综合考虑各因素选择相应的核酸探针。标记核酸探针的物质主要有两类放射性标记物（同位素标记探针）和非放射性标记物（非同位素标记的探针）。放射性探针与放射性自显影检测相结合具有很高的灵敏度和很强的分辨率，有利于杂交分析，但由于核素的安全性、半衰期和成本等问题，限制了它的广泛使用。而使用非同位素标记核酸探针具有性能稳定，操作简便，成本低等优点，但其检测灵敏度和分辨率没有放射性探针效果好。因此在选择标记物时综合考虑实验情况，如目的片段表达量低时应选择同位素标记探针杂交检测以利观察，而大量表达的片段则可选择非同位素标记的探针杂交。
2.2.1 同位素标记探针
大多数放射性标记方法常使用35S、125I或2H标记核苷酸并依靠酶促反应将标记的基团掺入到DNA或RNA中。（1）PCR法：该方法利用PCR扩增的主要原理及流程，在体系中掺入同位素标记的核苷酸作为底物，通过PCR扩增作用,对待标记DNA在扩增的同时给予标记。该方法具有经济、快速、简易和标记量大等优点。(2)体外转录法：该方法适用于制备RNA探针，其原理为将相应的DNA片段酶切克隆到与SP6、T3或 T7等RNA聚合酶的RNA启动位点相邻的MCS中构建载体，这些元件具有很强的启动子特异性，只转录启动区下游的DNA，将相应的RNA聚合酶加入到含有放射性标记的三磷酸核苷前体的转录系统中,并将环形质粒酶切为线性以保证只得到目的mRNA, 在特定条件下反应，可制备出被标记的目的RNA探针。（3）缺口平移法：利用DNA酶Ⅰ的内切酶活性、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合酶和5′→3′外切核酸酶的综合活性。DNA酶Ⅰ在双链DNA中随机引起断裂并产生一个游离的3′-OH, 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的 5′→ 3′外切核酸酶活性使缺口5′-PO4端的碱基降解,同时DNA聚合酶活性在缺口的3′-OH 端催化掺入核苷酸。随着切割和聚合的进行, 缺口平移，新的核苷酸不断被掺入，该反应中加入的放射性标记的dNTP也被掺入, 从而得到被标记的DNA探针。（4）引物延伸法：利用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段，以随机序列六聚核苷酸作为引物提供3′-OH，[α-35S]、[α-32P] 等标记的dNTP作为前体，依赖大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段的5′-3′聚合酶活性延伸，由于该酶缺乏5′-3′的外切核酸酶活性可避免已掺入得标记物丢失，有利于探针的形成。（5）末端标记法：可用来标记线性DNA、RNA的3′-末端或5′-末端，这种方法利用各种酶的催化活性在核酸的端部加上标记的核苷酸或寡核苷酸链制备探针如：利用末端脱氧核苷酸基转移酶将35S、32P、3H-核苷酸加到核酸分子游离的 3′-OH 末端，并根据需要设计条件使不同类型及不同长度的标记前体加到核酸探针上；T4 多聚核苷酸激酶可催化标记DNA或RNA的5′-末端，其原理为：合成寡脱氧核糖核苷酸时, 其末端通常未被磷酸化含有5′-OH(或使用碱性磷酸酯酶脱去5′-PO4），在T4 多聚核苷酸激酶的催化下使[γ-32P] ATP的γ-磷转移到游离的5′-OH上，从而标记该核酸片段。
2.2.2 非同位素标记探针
非放射性原位杂交技术根据报告分子掺入DNA 的方式分为两种。 酶促法标记和化学标记直接法和间接法, 间接法包括酶促法标记和化学标记。标记物有酶类如：辣根过氧化酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）等；还有化学物质如：用荧光素、生物素（光敏生物素等）、地高辛（DIG）等。直接标记法是将标记物直接与探针核苷酸或磷酸
戊糖骨架共价结合；间接法分为（1）酶促标记法：该方法的原理为修饰准备掺入的核苷酸分子，在核苷酸分子或磷酸戊糖骨架上连接报告基团（地高辛，生物素，荧光素等）如：异羟基洋地黄毒苷配基即地高辛(Digoxigen) 标记,为半抗原标记，地高辛是类固醇半抗原分子，人及多种动物体内不存在类似的物质，无交叉反应干扰，因此常用地高辛标记探针，该方法将地高辛其与dUTP通过连接臂连接,形成 Dig -dUTP ，然后通过各种酶反应法将其掺入探针核酸中；生物素标记，生物素可与亲和素特异结合,具有多级放大的作用，有利于信号的检测，通过连臂连接生物素和核苷酸，然后将这种生物素结合物通过酶促应法掺入DNA分子，杂交后通过相应的方法检测报告基团,显示目的序列的位置及相对含量；探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还利用亲和素生物素荧光素复合物，将荧光信号进行放大。将修饰的核苷酸掺入核酸探针的方法与同位素探针的标记相似有缺口平移法、随机引物法、寡核苷酸片段加尾法、PCR法等，依据不同需要（如DNA片段长短等）选择合适的方法将非放射性标记的核苷酸掺入到核酸片段中。（2）化学标记法：利用化学反应使标记物与探针相连如：光敏化合物标记法，其原理为:光敏化合物是一种化学合成的生物素衍生物，其分子中含有可光照活化的叠氨代硝苯基。在强可见光照射下能与核酸（DNA和RNA）的碱基反应，生成光敏生物素标记核酸探针;化学标记半抗原,该方法先将连接臂连附到DNA上,再用各种半抗原检测基团标记DNA的连接臂，从而标记核酸探针。
2.3 标记物的检测
2.3.1 同位素标记探针的检测
对于同位素标记的探针，用放射自显影的方法检测。原理为放射性粒子撞击胶片卤化银感光层时,会形成潜在影像,经显影处理后即可成像观察，具有较高的灵敏度。
2.3.2 非同位素标记探针的检测
非同位素标记探针的检测，如地高辛和生物素等化学物质，一般采用免疫酶反应方法检测，其原理为：将连有地高辛/生物素的探针与抗地高辛/生物素的抗体(一抗)结合,再使一抗与酶连的抗体(二抗)结合，形成复合物，最后加入酶相应的催化底物显色检测（底物可溶，催化反应的产物不可溶），显色为组织化学原理。其中与抗体相连的酶常为过氧化物酶或碱性磷酸酶。碱性磷酸酶可催化底物四唑氮蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)反应,最终形成可检测的蓝色沉淀。辣根过氧化物酶可催化底物二氨基联苯胺(DBA)形成棕黄色沉淀，从而定性，定位及相对定量地检测目的基因的表达。或在抗体上连接荧光素等化学发光物质，抗体特异性与连有地高辛/生物素的探针结合后，采用X-光胶片于室温下曝光数分钟的方法进行检测。该过程的原理为化学发光物在碱性磷酸酶作用下发生化学发光反应,产生不同波长的光,利用荧光检测系统检测发光结果，从而显示目的基因的表达状况，其中，用酶标记组织化学显色观察结构清晰，定位效果好，且可长时间保存，一般做组织检测时使用此方法；而荧光素标记曝光检测为暗背景观察，信号灵敏度比较高，但容易淬灭，不易长时间保存，一般做细胞检测时使用此方法。
3 原位杂交实验技术的分类
3.1 根据检测的目的核酸
3.1.1 DNA原位杂交
DNA原位杂交是以DNA作为目的序列进行原位杂交，DNA荧光原位杂交(FISH)技术是应用广泛的依赖非放射性荧光物质的原位杂交技术，主要原理为将DNA探针用生物素和毛地黄毒苷等荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结合，通过荧光杂交信号来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。
该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于基因定位、产前诊断、细胞遗传学、肿瘤生物学及哺乳动物染色体进化研究等领域。
3.1.2 RNA原位杂交
RNA原位杂交是以RNA作为目的序列进行原位杂交,以标记的反义RNA为探针，与切片杂交，从而原位的显示RNA的表达部位和相对丰度。RNA原位杂交是研究基因表达谱的重要方法，可提供RNA在组织细胞的空间表达信息。该技术由传统RNA原位杂交：Isotopic ISH、非-ISOTOPIC ISH及直接法RNA原位杂交发展至RNAscope® 原位杂交新一代RNA原位杂交，其敏感性和特异性等都不断提高，越来越被广泛应用。
3.2 根据应用的标记物
3.2.1 同位素标记探针
大多数放射性标记方法常使用35S、125I或2H标记核苷酸并依靠酶促反应将标记的基团掺入到DNA或RNA中。放射性探针与放射性自显影检测相结合具有很高的灵敏度和很强的分辨率，有利于杂交分析，但由于核素的安全性、半衰期和成本等问题，限制了它的广泛使用。
3.2.2 非同位素标记探针
非放射性原位杂交技术根据报告分子掺入DNA 的方式分为两种。 酶促法标记和化学标记直接法和间接法, 间接法包括酶促法标记和化学标记。标记物有酶类如：辣根过氧化酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）等；还有化学物质如：用荧光素、生物素（光敏生物素等）、地高辛（DIG）等。使用非同位素标记核酸探针具有性能稳定，操作简便，成本低等优点，但其检测灵敏度和分辨率没有放射性探针效果好。
3.3 根据使用的核酸探针
3.3.1 DNA探针
DNA探针多为某一基因的全部或部分序列，该类探针制备简便，不易降解保存，有多种标记方法，但是杂交前要变性, 敏感性没有 RNA 探针高。
3.3.2 cDNA探针
cDNA探针依赖于逆转录酶经RT-PCR获得不含有内含子的DNA探针，广泛用于基因表达检测等研究，具有制备简单，放射比活性高，信号特异性强，杂交体较稳定等优点，但需变性后才能使用，且组织穿透力差。
3.3.3 RNA 探针
RNA探针（同义RNA探针和反义RNA探针）可通过体外转录技术获得，该类探针杂交前不需变性,敏感性高, 杂交后可用RNA酶处理标本而本底较低;但有 RNA 探针不易制备, RNA 探针易降解,且不易保存，组织穿透力差的缺点。
3.3.4 寡核苷酸探针
寡核苷酸探针通过化学合成的方法获得，链短且复杂程度低，组织穿透力强 ，可识别靶序列内1个碱基的变化，但杂交体不太稳定且信号较低，因而具有特殊用途。
3.4 根据检测对象的取材方式
3.4.1 细胞涂片
新鲜组织或培养细胞取出后尽快固定，对于细胞用小量缓冲液将细胞悬浮, 然后将细胞沉淀涂在载玻片上,最后置空气中干燥; 对于组织直接将组织印迹在载玻片之上。把新切下的组织表面压或涂在载玻片上, 然后空气干燥载玻片并立即固定，这种办法的缺点是组织无法保持其组织学结构，从而无法进行组织学定位。
3.4.2 冰冻切片
各种组织均可用于制备冰冻切片。冰冻切片前可先固定组织或切片后再固定组织。用冰冻切片机将冷冻组织切成薄片并放在预处理过的载玻片上, 37℃干燥 2～3 h。组织也可用福尔马林固定并以石蜡包埋进行保存。这种取材方式能更好地保存核酸, 并且更容易被检测，但是一些组织不适合用此方法取材如肾脏及小肠等。
3.4.3 石蜡切片
以福尔马林固定、石蜡包埋的组织可方便地贮藏于室温而不会造成
细胞形态上的改变。但由于福尔马林固定引起的过度交联, 可能会使
探针和检测试剂难以扩散进入组织。且对于RNA原位杂交由于RNA酶的存在，操作过程中很容易使切片中的检测对象降解。
4 地高辛标记RNA探针检测胚胎中SHH基因表达方法技术分析
本实验以鼠胚作为实验材料，采用组织切片原位杂交方法检测Shh基因在胚胎中的表达定位。Shh基因是一种重要的细胞信号分子，在胚胎发育中，其基因表达与许多器官的形成关系密切，如胚胎神经系统、体节、肢芽、肺、消化道等的形成。在早期发育的胚胎中发现，先在脊索，然后在神经管底部检测到Shh基因在时空上的表达差异。
4.1 实验准备
4.1.1 仪器工具的处理
玻璃仪器的处理：将玻璃仪器以此用洗液、碱过夜、自来水、蒸馏水清洗后干热灭菌（180℃灭菌6小时）；塑料器皿的处理：用DEPC处理；药品的配制：使用专用药品、必要时用DEPC处理；载片的处理：清洁如玻璃仪器。技术分析：由于RNA酶在环境中广泛存在，所以在实验准备过程中各处理的目的为严格避免RNA酶污染，如：干热灭菌，DEPC（焦碳酸二乙酯，是一种RNA酶抑制剂）处理器具等。
硅化处理：用多聚赖氨酸处理载片。技术分析：利于标本粘连在载片上。
4.1.2 探针的获得和标记
根据被检测的基因在网站搜索处cDNA序列,提取组织中的RNA,设计特异性引物经RT-PCR获得cDNA，克隆插入载体质粒，测序验证，大肠杆菌扩增。使用罗氏地高辛标记检测试剂盒标记RNA探针。技术分析：探针设计时，选择特异性高的最短序列做探针，经验值为200bp左右，既保证了穿透性，又保证了特异性。利用地高辛标记的d-UTP应用体外转录系统转录合成标记的RNA探针。
4.1.3 取材制作冰冻切片
取材：根据需要把材料切成3-5mm的小块迅速投入液氮中，-70 ºC保存。技术分析：冰冻切片无介质仅依靠内部水份迅速冷冻以保持其形态结构及化学物质不被破坏。切片：用冰冻切片机将标本切成10µM薄片，-70ºC保存。技术分析：冰冻切片机在-27~-28℃为适宜切片温度。温度太低，组织脆易碎。
4.2 实验操作
4.2.1 切片干燥
从-70ºC冰箱取出保存的切片，室温干燥30分钟或置于50ºC展片台2min。技术分析：由于切片从-70℃的环境中转换到室温，空气中的水遇冷在切片上液化成水滴，易使标本脱落，经干燥处理可保证标本在玻璃片上正常粘附。
4.2.2 固定
用4%多聚甲醛（pH9.5）室温固定切片1小时。技术分析：起作用的主要成分为甲醛，使蛋白之间形成稳定的共价键，起化学交联作用，最佳PH条件为9.5，有利于后续杂交（某些蛋白变性后有利于与探针的杂交）。
4.2.3 洗涤
用1×PBS洗涤切片，洗2次每次3min。技术分析：用磷酸缓冲盐溶液洗掉多聚甲醛，避免影响后续实验。
4.2.4 蛋白抽提
将标本用1%Tron-100，室温处理20min ，后用PBS洗干净。技术分析：Tron-100为相对纯净的洗涤剂，其作用为：将要检测的目标分子表面结合的蛋白洗掉，暴露出杂交位点。
4.2.5 预杂交
将标本用预杂交液：5 ×SSC，50%甲酰胺，在室温条件下预杂交15min。技术分析：预杂交液与杂交液的成分基本一致，唯一的差别为预杂交液不含有探针而杂交液含有探针，该操作在杂交之前，使溶液平衡避免因溶液不均匀或离子强度不均匀等因素导致的非特异性结合。其中SSC是柠檬酸盐缓冲液，为强碱弱酸盐，是由柠檬酸和柠檬酸钠组成的缓冲体系，维持操作过程中PH值的恒定，作为盐溶液还具有维持渗透压的作用。其中5×SSC保证离子强度（2~5×SSC都可）；50%甲酰胺的作用为降低杂交温度（从80~90℃到50~60℃），防止破坏标本，其中在杂交过程中温度需维持在80~90℃左右高温的原因为减少非特异性杂交，使杂交既保留特异性又排除非特异性。
4.2.6 杂交
将标本用杂交液：5 ×SSC，50%甲酰胺，0.02%BSA，250 µg/mltRNA，10%硫酸葡聚糖，1 µg/ml变性探针（可直接在预杂交液中加探针），在55ºC条件下，孵育16小时以上。技术分析：在预杂交液中加入了0.02%BSA，250 µg/mltRNA，10%硫酸葡聚糖，1 µg/ml变性探针，进行特异性分子杂交，其中BSA为牛血清白蛋白，其作用为通过造成空间位阻等封闭非特异性位点，降低背景；tRNA也可降低非特异性结合背景；硫酸葡聚糖与各成分不反应，但可以吸水，使各成分有效浓度提高，一定程度上维持溶液性质稳定；使用变性RNA探针，避免RNA自身的二级结构降低杂交效率，其变性的方法为：将探针在85~90℃处理5分钟后放入冰水中。
4.2.7 杂交后处理
将标本依次用50%甲酰胺5×SSC，在55ºC处理15min；50%甲酰胺2×SSC，在55ºC处理30min；50%甲酰胺0.2×SSC，在55ºC处理两次每次30min；0.2×SSC，室温处理5min；Buffer1，室温处理5min；1% Blooking，室温处理1h；0.5%以1：5000配制的 Blooking +碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，在4ºC孵育过夜。技术分析：在杂交后环境条件控制有所改变，因为杂交后目的分子变为双链，不再需要除去RNA酶。杂交后处理，通过梯度的溶液洗涤，把过量的探针除去，洗涤强度由强到弱。然后逐步洗涤上一步残留的溶质如甲酰胺等，使溶液平衡，最后用Blooking封闭并加入抗地高辛抗体进行免疫组织化学过程。
4.2.8 显色处理
将标本依次用Buffer1在室温下处理3次每次10min；Buffer3在室温下处理5min，然后加显色液，黑暗室温静止显色。其中显色液成分为：Buffer3 中添加0.33mg/mlNBT（氮蓝四唑），0.165 mg/mlBCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐），2mM Levamisole，观察出现信号后，去掉显色液，甲基绿对染照相，保存。技术分析：Buffer1中含有Tris-HCL缓冲液，调节抗原与抗体的作用，洗去多余的抗体；Buffer3中含有镁离子，调节显色，NBT和BCIP为酶的底物，其中NBT为浅黄色液体，BCIP白色两者均可溶，经碱性磷酸酶催化生成红色沉淀，可在标本中观察定位，用甲基绿对染，使染色更易观察。
5 对照实验的设置
对照试验是检定测定方法是否存在系统误差的方法之一，原位杂交实验结果分为阳性结果和阴性结果，其显示结果应与实际情况对应，为证明结果的可信度，排除非特异性结果，以及发现实验中存在的问题需设置对照实验。当实验结果出现阳性时应做阴性对照避免假阳性，即非特异性结合。阴性实验的体系及操作除探针外与原实验相同，可不加探针，当实验结果为：加入探针的原实验有信号，而未加入探针的阴性实验没有信号，则加入的探针为信号的来源，探针的特异性为实验结果的特异性，从而排除了非特异性信号的可能，证明了不是假阳性，此外可加sense探针即和mRNA一致序列的探针，该序列与目的序列匹配程度最低，以使对照实验的体系与步骤和原实验只差别在探针的特异性；当实验结果出现阴性时应设置阳性对照实验，取阳性组织作对照，阳性组织有信号而原实验未出现信号，则可避免探针或体系等出现问题导致的阴性结果的可能，两实验对照可得客观的未检测到组织表达目的基因的结果。对照实验可使结果判断排除非特异性的可能，从而证明实验结果的可信度。
6 原位杂交注意事项
6.1 杂交前处理要严格避免RNA酶的污染
杂交前目的RNA片段处于单链状态，需严格避免RNA酶的污染，在实验前保证实验环境清洁可有效减低RNA酶污染的概率；注意仪器的选择避免污染，杂交前后的仪器、器皿、药品要分开使用；使用的仪器要严格清洗灭菌，在实验时佩戴口罩和手套等。
6.2 杂交时温度的控制
杂交过程中温度的控制需满足既保证特异性杂交的同时减少非特异性杂交，根据杂交结果适当调节杂交温度以获得好的杂交效果，如：当信号不明显时可适当降低杂交温度以增强杂交信号；当背景信号过强时可适当升高杂交温度减少非特异性杂交等。
6.3 实验条件及试剂的调整
实验过程中可根据实验结果围绕标准实验做适当调整，如在预杂交液的基础上配制杂交液；适当调整试剂浓度和时间（进行免疫组织化学时加入低浓度抗地高辛抗体延长孵育时间）等操作降低成本，实现以较低的成本完成高质量的实验。
7 原位杂交技术的应用
7.1 研究特定的核酸序列在染色体中的精确定位
7.1.1 构建DNA物理图谱
利用FISH技术构建 DNA 分子图谱具有很高的分辨率，在 DNA 纤维上用 FISH 技术构建染色体分子图谱，分辨率能达到 1 ～ 2 kb。
7.1.2 基因组分析
利用比较基因组杂交(comparative genomic hybridization , CGH)技术，用杂种一个亲本的基因组 DNA 作探针 , 与杂种进行染色体原位杂交 , 可有效地将同源性比较接近的两个染色体组(如同一属内的不同种之间)区分开来。利用特定的 DNA 片段作为探针通过染色体原位杂交还可以反映染色体结构或有关核酸序列标记的空间物理位置, 以确定染色体是否重排，为基因组研究提供重要信息。
7.1.3 疾病的诊断
使用突变或正常的探针对组织进行原位杂交检测是否具有该基因缺陷；1993年FISH技术就被X遗传学会 (ACMG)允许用于产前辅助诊断；张爱臣等，用双色 X / Y探针 ( CEP X /Y)和 21号染色体探针 ( LSI21)荧光原位杂交经宫颈冲洗宫腔收集的滋养细胞，诊断性连锁遗传病胎儿的性别及染色体非整倍体异常显示了很高的正确率和灵敏度；有文献报道使用商业化探针 UroVysis(雅培公司)用于膀胱癌的诊断,灵敏度达到82.4%,特异度为91.8%。
7.2 检测基因的定位、定量表达
设计探针与细胞内的RNA杂交观察该基因的定位、定量表达，范瑞琦等，通过乳腺疾病及癌组织芯片原位杂交分析microRNA-205的表达;实时定量RT-PCR方法检测正常乳腺细胞株、恶性程度不同的乳腺癌细胞株中microRNA-205的表达，探讨microRNA-205表达与乳腺恶性病变的关系，具有重要的研究价值；利用RNA—RNA原位杂交，检测人肝癌C—myc和H—ras—1基因的表达的变化，为后续针对性治疗提供了重要信息。
7.3 检测病毒感染
用特异性的细菌或病毒的核酸作为探针对组织或细胞进行杂交，以确定有无病原体的感染，并分析感染机制及免疫机制以及机体状况。程安春等，利用原位杂交检测人工感染鸭体内鸭瘟病毒的复制，研究鸭瘟病毒的致病机理及在体内分布状况为制定解决方案奠定基础。陶仪声等，用原位杂交技术及免疫组化方法对33例食管鳞癌手术切除标本进行HPV检测，检测食管鳞癌中人乳头状瘤病毒(HPV)的感染情况,探讨HPV与食管癌发病的关系，取得了可靠的理论信息为后续研究奠定基础。
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