摘要：新型冠状病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCoV )为一种高致病性的新毒株，通过通过spike刺突蛋白（2019-nCoV配体）连接到ACE2蛋白（细胞上的受体蛋白）而感染细胞，随后复制，破坏微环境，使人类患呼吸系统等疾病重则致死。本文以几种已存冠状病毒为研究对象利用生物信息学手段分析其同源性，并推测其起源[1]；以2019-nCoV受体ACE2为研究对象分析含有相似片段的物种以判断可能携带该病毒的可能性。
关键词：新型冠状病毒；疫情；宿主
引言
新型冠状病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCoV )疫情爆发给世界带来了巨大的损失，对公共卫生构成了重大威胁。2019-nCoV是一种高致病性人类冠状病毒，该病毒为此前无记载的新毒株，人们对该病毒的高侵袭力了解甚少。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡[2]。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。但随着对该病毒的深入研究，已开发出了一些对新冠肺炎辅助治疗的药物，且抗2019-nCoV的疫苗也在临床试用阶段。但2019-nCoV的传播力及感染力极强，随时都有可能在某地爆发，研究已证实该病毒的感染方式为飞沫传播及接触传播。在人群中可通过戴口罩、勤洗手等方式降低传播几率，并已显示了良好的控制效果。但研究表明该病为人畜共患病，在最开始追溯2019-nCoV起源时有文献以穿山甲、蝙蝠、果子狸等野生动物[3]为对象将相关病毒序列比对并分析特定结构域，其结果显示了很大的相关性。此后，许多研究相继证明了该病毒宿主的广泛性如在雪貂、猫中具有有效的复制能力。2019-nCoV具有两个显著基因组特点（1）通过结构研究和生物化学研究，2019-nCoV与人受体ACE2亲和[4-6]；（2）2019-nCoV的刺突蛋白在S1-S2的边界线嵌合了12个核苷酸形成了多元切割位点[7]，此外预测有3个O连接的多糖在这个区域。6个受体结合域的氨基酸对结合ACE2受体具关键作用，并决定了SARS-CoV样特征（SARS-CoV：Y442；L472；N479；D480；T487和Y4911，SARS-CoV-2:L455，F486，Q493，S494，N501和Y505）。该病毒的感染机制为：通过spike刺突蛋白（2019-nCoV配体）连接到ACE2蛋白（细胞上的受体蛋白）[8]而感染细胞，随后复制，破坏微环境，使机体患病。在新冠病毒的核酸序列中，编码这个配体的区域叫做RBD（受体结合域），根据基因测序的结果，新冠病毒的RBD上结合ACE2的残基序列，和其他几种冠状病毒非常像。分别是（1）新冠病毒；（2）蝙蝠RaTG13 病毒；（3）穿山甲冠状病毒；（4）SARS病毒；（5）蝙蝠SARS样病毒。此外，与2019-nCoV受体结合域相匹配的密切联系的受体ACE2在人，雪貂，猫和其他物种高度同源。因此，了解该病毒的起源演化、宿主范围及跨物种传播机制是探索该病毒的重要方法，可帮助控制该病毒的持续爆发。本研究以几种已存在的冠状病毒序列及2019-nCoV为研究对象分析它们的同源性并检测保守基序，以该病毒受体ACE2为研究对象利用序列比对工具探索可能成为该病毒携带宿主的物种，并分析该推测可信度。
1 材料与方法
1.1 在NCBI中获得MN908947（2019-nCoV）、MN996532（蝙蝠冠状病毒RaTG13）、MT072864.1（穿山甲冠状病毒PCoV_GX-P2V）、AY278741（SARS冠状病毒Urbani）、KY417146（蝙蝠SARS样冠状病毒Rs4231）、MK211376序列（冠状病毒BtRs-BetaCoV/YN2018B），用EMBL：Clustal Omega将所有序列做多序列比对分析保守区域；并用MEME，寻找这些病毒的保守基序。
1.2 在NCBI中获得两条ACE2序列NP_001358344.1、NP_068576.1,使用NCBI中的blastp (protein-protein BLAST)及PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST)将两条序列分别在swissprot中比对获得匹配片段。
2 结果
2.1对六种冠状病毒进行序列比对并分析保守区域
2.1.1 将Human-SARS-CoV-2和Bat-RaTG13做EMBL全局双序列比对：
参数如下：
比对结果：可见在刺突蛋白区域两序列相似度和一致度都很高，显示了像很多文章所提到的SARS-CoV-2很有可能起源于中华菊头蝠。
2.1.2 将Human-SARS-CoV-2和穿山甲冠状病毒做全局比对和局部比对：
可见Human-SARS-CoV-2和穿山甲冠状病毒在刺突蛋白区域相似度和一致度都很高且相同区域较为集中，为其进化出（原文样本）Human-SARS-CoV-2中间宿主提供可能。
2.1.3 如图所示为用EMBL：Clustal Omega将所有序列做多序列比对多基裂解位点及O-连接聚糖残基区域
如图所标序列在其他穿山甲冠状病毒中很相似，但在疑似为2019-nCoV的中间携带者的穿山甲冠状病毒中的序列有所不同，且该区域在O-连接聚糖残基区域，可能对演化成为Human-SARS-CoV-2很重要。
2.1.4 将六条序列序列输入MEME，找到排名前三的保守基序，并找到了它们所在的位置如图所示：
可见这几个基序的一致性很高，且位置也很相似，验证了它们的同源性。
2.2 将两条ACE2序列在swissprot数据库中做blastp 和PSI-BLAST结果显示很多物种都具有该受体的相似序列片段。
2.2.1 如图为序列NP_001358344.1通过blastp比对swissprot数据库结果：
得到32个高分匹配片段其中包括和人相近的猩猩，哺乳动物小鼠，兔以及果子狸、猫、牛、鸡还有果蝇线虫等但匹配程度较低。
2.2.2 如图为序列NP_001358344.1通过PSI-BLAST比对swissprot数据库结果：
除灵长类、胎生哺乳类物种也有鸟类等被检出匹配片段但得分较低，如图，Haematobie irritans exigua（果蝇类）、Theromyzon tessulatum颚蛭科水蛭、Caenorhabditis elegans秀丽隐杆线虫具有较高的得分。
使用NP_068576.1序列分别做blastp 和PSI-BLAST 结果类似。
3 讨论
对六种冠状病毒进行序列比对分析结果显示2019-nCoV与蝙蝠冠状病毒及穿山甲冠状病毒均有很高的同源性，尤其与蝙蝠RaTG13同源性很高，但与其在RBD区域略有差别却仍能很好与受体ACE2受体结合，可能是演化选择的结果[9]，对ACE2受体序列比对发现有许多物种都有与该受体相似的片段除哺乳动物外一些虫类也具有相似片段，这为携带病毒提供了可能，如果一些寄生虫类具有成为该病毒宿主的可能性，它们的宿主（如海产，牲畜等）虽不被病毒感染，但由于携带病毒宿主仍存在使人类患病的风险。
[参 考 文 献]
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