白果总黄酮提取工艺优化研究

　摘 要

目的：采用乙醇溶剂对白果总黄酮进行提取，进一步分析提取温度和乙醇浓度以及提取时间等不同因素对于总黄酮提取率所产生的具体影响。

方法：借助单因素试验的方式将各个因素三水平进行确定，随后凭借正交法试验针对对白果总黄酮提取率造成影响的因素展开细致的分析，其中主要的因素有四个，分别是提取时间、温度和乙醇浓度以及料液比，在这个基础上将最为合适的提取条件确定出来。

结果：凭借正交法试验针对对白果总黄酮提取率造成影响的因素展开细致的分析，其中主要的因素有四个，分别是提取时间、温度和乙醇浓度以及料液比。在这个基础上获得的最佳工艺是：乙醇浓度数值为80%，提取温度数值是60℃，提取时间主要为50min，料液比的数值是1:60，其获得的提取率数值是2.102mg/g。通过一系列有效验证的前提下，并且在这个条件的基础上开展三次重复性的试验，以白果总黄酮为观察对象其提取率的均值是2.102mg/g，而相对标准偏差RSD的具体数值是 0.33%，由此表示本提取工艺具有较为优越的重复性条件，其能够使用到提取白果总黄酮的工作中。

关键词：白果，总黄酮，提取，工艺优化

1 绪 论

　　1.1白果概述

人们所熟知的白果，其在医学上的名称就是银杏，这是我国非常贵重的树种，其被称作是植物界的活化石。通过相关的了解和分析可以看出，银杏当前所处的位置主要是山东和江苏以及X和日本等，在这里面我国的银杏产量占据了全球总产量的70%。在《本草纲目》这部作品之中就明确的阐述到，银杏果实（白果）具备止咳以及定喘的功效；人们可以使用银杏叶调理心痛和胸闷以及胆固醇等身体问题；同时银杏树根还能够具有滋补强壮的作用，并且也能够使得虚弱体质得到改善。站在国人的角度上来看，银杏属于医疗之树[1]。

白果具有丰富的营养成分，其中包含了蛋白质和淀粉以及脂肪等元素；除此之外其白果酚和黄酮以及多糖等成分含量也是非常丰富的[2]。在这里面白果之中最为主要的功能因子就是黄酮类化合物，通过对该化合物的功能进行了解，其能够抗菌和抗炎以及抗衰老；除此之外还能够对心脑血管疾病起到调节作用[3]。

站在医学界的角度上来看 ，其表示白果所具有的保健医疗效果是绝佳的，最近这些年里有关的分析表示，白果之中不单单包含了脂肪和蛋白质以及淀粉等，同时也有大量的维生素和卵磷脂以及微量元素。大量的学者通过研究和分析表示，白果本身具被耐缺氧和广谱杀菌以及抗疲劳的功效，因此白果不仅具有食用性，同时其也是化妆品以及医药行业的首选材料。当前人们对于白果仁医药价值的认可度已经有了较大的提升[1]。

　1.2 黄酮类化合物概述

所谓的黄酮指的就是由天然植物内部借助分离的方式而获取的黄酮类化合物，其在自然界有着普遍的分布[4]。详细的了解黄酮类化合物分子结构能够发现， 其中包含了碱性氧原子，其能够同矿酸产生反应从个人形成盐，基于此也在之前也将黄酮类化合物叫做是黄碱素类化合物[5]。

以黄酮类化合物作为观察对象，其药理活性以光谱和低毒为主，并且其在抗肿瘤和心血管疾病的治疗过程中起到了积极的作用。除此之外其也具有较好的抗菌以及抗病毒的效果[6]。

通过对黄酮类化合物进行了解，其溶解度由于自身存在状态以及结构的差异性而不同。通常情况下游离苷元是不能够同水相溶的，可是其会很容易的溶于乙醇和甲醇以及乙醚等物质之中。黄酮醇和黄酮以及查耳酮等都属于平面型分子，由于堆砌非常的密实，并且分子间具有较大的引力，因此导致其很难同水相溶；但是二氢黄酮醇以及二氢黄酮等都属于非平面型分子，其在排列方面并没有紧密型，而分子间并不具备较高的引力，这样就使得水分子可以很轻松的融入其中。在黄酮类化合物之中的羟基被糖被苷化以后，其水溶性相较于之前而言就会有所提升，而脂溶性就会降低。基于此能够借助这个性质将黄酮类化合物进行提取和分离[7,8]。

在白果有效成分中，黄酮类化合物物质含量较高、种类较多，其结构可分为3种类型[1-3]。第一种为单黄酮类化合物，具体包含异鼠李素和槲皮素以及山奈酚等化合物，而槲皮素、山奈酚和异鼠李素是银杏黄酮中最主要的三种成分。

第二种是双黄酮类化合物，其主要是由两分子黄酮母核借助C-C 键聚合的方式所产生的化合物；具体包含的六种类型[8]。最后的一个类型主要为儿茶素类，其并没有在银杏黄酮化合物内部占据较高的含量，主要包含了表儿茶素-五乙酰化合物以及儿茶素-五乙酰化合物等。

存在于银杏叶内部的黄酮类化合物，其苷元并不能够亦或是很难同水相溶，其很容易同乙醇和甲醇以及氯仿等溶剂融为一体[9-11]，具有较好的抗氧化、抗癌、抗炎和镇痛等多种药理作用，可增强人体的免疫能力，对于治疗心血管等疾病也十分有效，在市场上非常畅销。

　1.3总黄酮的检测方法

对于银杏黄酮含量进行测定的方法主要包含了两种，分别是高效液相色谱法以及紫外分光光度法，除此之外，三波长法、荧光分光光度法、毛细管电泳法和超临界流体色谱法也可用于测定植物中黄酮类物质的含量[4,6,10-13]。紫外分光光度法常利用显色剂与银杏黄酮发生显色反应后，在一定的紫外吸收波长下会有最大吸收，然后根据比尔定律，将溶液对应的吸光值精准的测定出来，最后借助标准曲线的基础上获取到黄酮含量。通过对紫外分光光度法进行了解，其具体涵盖了两种方法，分别是三氯化铝比色法以及硝酸铝比色法，选择合适的显色剂，能避免提取溶液中其他成分和杂质的干扰，从而得到具有专一性的含量测定方法。高效液相色谱法也是黄酮类物质测定的一种常用方法，该法根据黄酮类化合物在某一特定波长下有吸收，且峰面积与其浓度成正比的原理，通过标准曲线及峰面积得到黄酮含量。

　1.4 白果黄酮提取及其应用

　　1.4.1 白果黄酮的提取研究概况

针对提取黄酮类化合物的工作，其通常是参照自身伴存杂质以及具体性质作为基础来将提取溶剂选取出来，目前工业上多采用溶剂浸提法提取银杏黄酮，但溶剂浸提法提取率较低，为此人们也采用超声提取法、微波提取法、酶法和CO2超临界流体法等新型技术提取白果黄酮[10-16]。

（1）溶剂提取法

截止到现在为止用来将银杏黄酮进行提取的溶剂包含了甲醇和水以及乙醇等等。在这里面具有较强挥发性的是丙酮以及甲醇，且有一定的毒性，一般使用较少；水提法与乙醇提取相比，操作简单、成本低，但是提取率相对较低，故应用也相对较少；目前常选择乙醇作为提取溶剂。李新舟等[17]通过单因素法对乙醇回流提取法所具有的工艺条件展开了细致的分析和研究，通过观察发现基于优化工艺条件的基础上，银杏总黄酮提取率的数值能够在0.918%的水平。

（2）超声法和微波法

超声法和微波法是在提取过程中是通过外加场破坏细胞膜，从而促进有效成分释放出来的一种新技术。杜若源等[18]通过超声波辅助乙醇法提取银杏黄酮，提取率达1.20%以上，比传统溶剂法提高了1.5倍。此类方法提取率高，但对设备的要求高成本较大，同时会产生热效应，强烈的微波辐射还可能破坏样品的组织结构，从而影响黄酮结构的稳定性。

（3）酶法

酶是一种高效的生物催化剂，具有无毒无害、高效和专一的特点，在中药成分提取方面也有着广泛的使用。所谓的酶法指的为借助酶以及果胶和纤维素产生作用，由此使得细胞壁结构出现破坏，减小提取过程的传质阻力，增加传质速率的方法。张玲等[19]在研究和分析的过程中借助纤维素酶来对鬼针草叶总黄酮进行提取。当酶用量的数值是1.14%，酶解温度的数值设定为41.9℃，酶解pH4.35的基础上，其总黄酮提取率的数值可以到6.31%的水平。但酶的价格较高，且在高温下容易失活。

（4）超临界流体法

超临界流体法是利用超临界时CO2粘度小、扩散系数大等特殊的理化性能，从原料中萃取目标化合物的新型分离技术，因其具有环保、无毒和无残留的特点，在植物活性成分提取方面有较广泛的应用。学者文颖等[20]借助超临界CO2萃取技术来提取存在于山楂核内部的黄酮，在这个步骤中所需要花费的时间成本是90 min，而此时的萃取压力数值是25 MPa，在提取过程中需要设定的温度数值是40℃，在山楂核内部的黄酮提取率的数值达到3.308%的水平。但由于超临界萃取法所需设备昂贵，且需要在较高的压力下操作，因此也很难应用于工业生产中。

1.4.2 白果黄酮的应用概况

白果黄酮为白果提取物的主要药用成分，由于其具有活血化瘀、降低血脂、预防和治疗心脑血管疾病以及潜在的抗肿瘤和天然自由基清除剂作用，国内外已开发出各种白果药品、饮料、保健品、食品、化妆品等产品，如国内浙江康恩贝制药股份有限公司在中科院上海药物研究所协助下，研制出的“天保宁”牌银杏叶片，其他国内白果提取物制剂产品有冠心酮、银可路、史泰隆、抗栓宁、以及舒血宁等。国外白果制剂类产品有法国普益生制药公司的达纳康、德国威玛舒培博士大药厂的金纳多片剂、注射液和瑞士的 Ginkgo Vital等[21-23]。此外，戴玄等[24]利用蜜环菌提取液与银杏叶提取液为主要原理进行调配，研制出了味美可口、风味独特且具有多种营养成分的保健功能饮料。有研究发现，银杏黄酮对炎症、心脏病以及癌症的治疗效果可能与其清除自由基活性有极大的相关性[5,16]。此外，山奈酚能够抑制胰腺癌细胞的生长，诱导癌细胞凋亡并且能增强化疗或放疗的效果，这标志着山奈酚在治疗癌症方面具有临床应用价值[17]。人们也将银杏叶应用于烟草行业，如将银杏叶粉末和果糖粉末混合制得多孔颗粒用于卷烟复合滤棒中，能选择性吸附卷烟烟气中的氢氰酸和巴豆醛，有效降低卷烟烟气刺激性、改善余味，增加烟气甜润感[18，24]，这可能是由于银杏叶提取物中含有丰富的酚羟基结构，有较好的抗氧化作用，对卷烟烟气产生的自由基有抑制作用，并且其热裂解产物中含有多种香味物质，从而具有定香和助香的作用[13，24]。

目前我国在白果种植及产量方面占有较大的优势，但是白果提取物生产厂家的提取技术相对于国外较为落后。国内白果制剂多以片剂、胶囊剂和口服液为主，技术含量较低，常常通过出口银杏叶粗提物，获得较低的收益。而国外企业拥有较为先进的提取分离技术，且白果制剂的规格和标准较为统一，能对白果粗提物进行后续加工，从而生产出纯度高、疗效好但相应价格也十分高的白果产品，进而从中获得较高的经济收益。因此，国内的白果提取分离技术亟待提高，若能解决这一技术难题，则会进一步促进我国银杏资源产业链的形成，生产出疗效好、成本低的白果制剂，从而打断国外企业对白果高端市场的垄断[13，24]。

1.5白果黄酮类化合物分离纯化

分离纯化黄酮类化合物的方式众多，具体包含了重结晶法和溶剂萃取法以及超滤法等，其需要参照具体的分离纯化场景来对相应的方法进行选择。比如说当杂志以及黄酮类化合物具有不同极性的时候，此时能够使用的是有机溶剂萃取法；当杂质以及黄酮类化合物具有不同吸附性能的时候，此时能够使用的是层析柱吸附分离。

学者张鹤等[25]借助乙酸乙酯和石油醚以及正丁醇来提取向日葵茎之中的乙醇，借助该操作的方式获得了乙酸乙酯萃取物以及石油醚萃取部物等。相较于石油醚以及乙酸乙酯萃取而言，在正丁醇萃取物内部具有较高的总黄酮含量。陈帅等[26]在实践和分析的过程中主要开展了静态解吸附试验，由此使得同罗布麻叶总黄酮相适合的聚酰胺树脂类型提取出来的。通过对聚酰胺树脂进行层析纯化之后，此时能够使得罗布麻之中的总黄酮粗提物纯度从最初的28.42%增加为78.13%，基于此可以将聚酰胺树脂使用到罗布麻总黄酮的分离纯化工作中。张斌等[27]在选取原料的时候最终选择为花生壳，并且针对花生壳总黄酮完成了分离纯化工作。

1.6本课题的研究背景、意义与主要研究内容

　　1.6.1本课题的研究背景和意义

白果不单单能够食用，同时还能够作为珍贵的药材，其在明朝的时候就有相关的记录。在最近的这些年里，同银杏叶相关的报道合研究数量都在持续的提升，但是针对银杏白果的分析作品却并不多，白果黄酮的分离以及提取是合理利用白果资源的前提，所以有必要对其工艺进行专门研究。

所以本论文主要是针对银杏中黄酮类化合物的制备，重点对其提取分离工艺中的关键步骤展开分析，希望能够对银杏白果资源的开发利用提供有效的参考依据。

　1.6.2本课题研究的主要内容

本文研究的主要目标是对现有的银杏白果黄酮提取工艺做一梳理，结合最新的研究进展，提出一种最为高效便捷的银杏白果黄酮提取分离工艺，具体研究内容有以下几点：

银杏白果中的黄酮提取工艺的研究。本文采用溶剂浸提法来提取银杏白果内部的黄酮，将最佳提取条件确定出来；

（2）借助正交试验法来将最佳条件确定出来。

　2 材料与方法

　　2.1 实验材料和仪器

　　2.1.1 实验原料

实验所用白果采自学校附近公园；其余的材料包含了高锰酸钾合乙醇以及硝酸铝等试剂；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等：Sigma公司。

2.1.2仪器与设备

旋转蒸发器基于RE52-98型的：是由上海亚荣生化仪器厂所生产；中草药粉碎机基于FW177型的：是由天津泰斯特仪器有限公司所生产；恒温水浴锅基于HH-4型号的：是由金坛市杰瑞尔电器有限公司生产的等等。

　2.2 白果总黄酮的制备与测定

　　2.2.1 芦丁标准曲线的绘制[4]

对于芦丁标准曲线来说，一般都是采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法来进行绘制。对于标准的芦丁，将不同浓度的芦丁溶液来进行配置，5%NaNO2溶液采取1.0 mL加入到溶液中，将其摇匀后放置6分钟，在将10%Al(NO3)3溶液1.0mL直接加入其内，将其摇匀后经由6分钟的放置；然后将10.0mL 4%NaOH溶液再进行加入，把水加到对应的刻度摇匀后，需要15分钟的时间进行放置。对于吸光度进行测定是基于510nm波长处，以质量浓度对吸光度进行线性回归，其方程具体如下Y=0.6695X+0.0290，R2=0.9998。

2.2.2 白果总黄酮的提取

剥掉佛手白果的皮之后，在70℃的温度下烘干果肉，经由48小时之后对其粉碎，用40目过筛。在三角瓶中基于250mL，将其称取10g放置进去，将乙醇溶液基于70%的加入150mL，基于70℃的温度下，经由40分钟的超声提取，对于滤渣继续2次的提取，然后将提取液来进行合并，测量总黄酮含量的时候使用的就是2.2.1中所提到的方法，均需经由3次对于全部的样品进行测试。

对于白果粉末称取3.0g，用来进行超声波的辅助提取，4000 r/min离心20分钟后的提取液，经由过滤后，将部分的澄清液来进行提取，进而对于总黄酮的提取率来进行测定。

　2.3 单因素试验

设定单因素和水平具体如下：

乙醇浓度： 1:40g/mL的料液比和60℃的温度，再加上20分钟的提取时间以及300W的功率就是其固定反应条件。黄酮提取率受到不同乙醇浓度（0、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）的影响来进行考察。

料液比：60%的乙醇浓度和60℃的提取温度，再加上20分钟的提取时间以及300W的功率就是其固定反应条件。黄酮提取率受到不同料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:80、1:100g/mL）的影响来进行考察。

提取温度：60%的乙醇浓度和1:40g/mL的料液比，再加上20分钟的提取时间以及300W的功率就是其固定反应条件，对黄酮提取率受到温度（30和40，还有50和60以及70与80℃）的影响来进行考察。

提取时间：60%的乙醇浓度和1:40g/mL的料液比，再加上60℃提取温度以及40目的样品就是其固定反应条件，对于提取时间（10、20、30、40、50、60min）的不同来考察其对黄酮提取率的影响。

2.4 正交试验

基于单因素的实验之上，其指标就是提取率基于总黄酮的，经由正交实验之后，就可以对于乙醇浓度和料液比，还有提取温度以及提取时间等相关因素的最佳组合来进行确定，下面所呈现的就是已经优化的提取白果总黄酮的工艺。

表2.1正交因素水平设计表

Table 2.1 Response surface factor level design table

3 白果总黄酮提取工艺优化

提取工艺基于白果总黄酮方面的来进行实验，确定其单因素就是料液比和提取温度以及提取时间等，将提取工艺基于白果总黄酮的来进行优化。

3.1 乙醇浓度对白果总黄酮提取率的影响

　　图3-1 乙醇浓度对提取率的影响

Fig.3-1 Effect of ethanol concentration on extraction rate

通过分析图3-1了解到，由于不断增加的乙醇浓度，提取率基于白果总黄酮的就会出现持续的升高，乙醇浓度不高于60%的时候，在升高的时候就会特别的慢，如果乙醇浓度达到了70%的时候，1.935mg/g就是提取率，已经达到了最大值。如果乙醇的浓度比70%还要高，那么就会出现下滑的提取率，对于提取总黄酮起到来不利的作用。如果出现了过大的乙醇浓度，就会增加醇溶性的色素和杂质还有亲脂性的成分等，进而不利于黄酮类化合物的深入分离以及纯化。同时由于过大的乙醇浓度，就会对于原料进行消耗造成一定的浪费，因此对于乙醇浓度来说一般都是控制在70%。

　3.2料液比对白果总黄酮提取率的影响

　　图 3-2 料液比对提取率的影响

Fig.3-2 Effect of ratio of material to liquid on extraction rate

提取率基于白果总黄酮的，伴随着不断减小料液比，其走向是先减小，接着逐渐增大，然后在下滑，基于1:50（g：mL）料液比的时候，2.171mg/g就是其提取率，可以实现最大值。接着就会出现减小的料液比，然后就会出现慢慢下滑的总黄酮提取率。将浸提液体积进行适当的增加，那么接触面积基于溶剂和浸提物的就可进行增加，这样对于溶出的总黄酮是非常有利的，增大其提取率。所以，对于其他条件来说一定的情况下，对于1:50（g：mL）的料液比来进行选择，其就是最好的公益条件基于提取白果总黄酮的。

　3.3提取温度对白果总黄酮提取率的影响

　　图3-3 温度对提取率的影响

Fig.3-3 Effect of temperature on extraction rate

通过分析图3-3了解到，如果提取的温度还不高于70℃的时候，提取率基于总黄酮的，就会由于上升的温度而进行提升，接着随温度搞到一定程度之后就会出现稍微的下滑。主要就是由于温度越高，速率基于分子平均运动的也就会越大，就会出现更大的扩散速率，对于溶解有效成分以及浸润植物组织方面都还是比较有效的。同时基于高温下，会直接加大很多杂质的溶解量，直接将后续的纯化工作带来较大的难度。所以作为合理的温度就是70℃。

　3.4提取时间对白果总黄酮提取率的影响

　　图3-4 提取时间对提取率的影响

Fig.3-4 Effect of time on extraction rate

通过分析图3-4了解到，经由10-40分钟的提取时间，提取率基于总黄酮的，由于延长的时间而会显著的提升；基于40分钟的时候，对于提取率来说，可以实现最大值1.986mg/g。经由40分钟之后，就会出现缓慢下降的提取率。与此同时还会大幅度的溶解多糖以及色素等相关杂质，不论是在纯化或者是测定黄酮类化合物的时候，均不太方便。所以一般都会将提取时间，在40分钟左右的时候进行控制。

　3.5正交试验

　　3.5.1 正交试验结果

用正交试验设计对提取工艺进行优化，对结果进行直观分析，如表3-1所示。

表3-1正交实验方案及结果

Table 3-1 The scheme and results of orthogonal experiment

从表3.1里我们能够看出，R 值和这个因素所影响的试验结果提取率是正相关的关系。提取率基于白果中黄酮的对其产生影响的主次顺序主要就是：C＞D＞B＞A，C代表的是提取温度，D代表的是提取时间，B代表的是料液比，A代表的是乙醇浓度。A3B3C1D3就是最佳工艺组合，80%乙醇浓度和60℃的提取温度以及50分钟的提取时间，料液比1:60（g：mL），提取率最高为2.101mg/g。

　3.5.2 验证实验

验证其最佳的提取工艺条件，80%的乙醇浓度和60℃的提取温度， 1:60（g：mL）的料液比以及50分钟的提取时间，这样的实验需要重复3次，表3-2所呈现的就是实验结果。

表3-2 验证试验结果

Table 3-2 Validation of test results

4结 论

所使用的实验就是单因素试验，对总黄酮提取率产生影响的有乙醇浓度和温度，还有料液比以及具体的提取时间，主要研究来上述的这四个因素。结果表明：

（1）乙醇浓度

固定反应条件为料液比1:40 g/mL，温度60℃，提取时间20 min，功率300 W。当乙醇浓度为70%时，提取率达到最大为1.935mg/g。

（2）料液比

固定反应条件为乙醇浓度 60%，提取温度60℃，提取时间20 min，功率300W。料液比在1:50（g：mL）时，提取率达到最大值2.171mg/g。

（3）提取温度

对于固定反应来说，其条件主要如下：60%的乙醇浓度和1:40g/mL的料液比，采用300W的功率以及20分钟的提取时间。如果温度达到了70的时候，提取率基于总黄酮的就是1.987mg/g。

（4）提取时间

固定反应条件为乙醇浓度 60%，料液比1:40g/mL，提取温度60℃，样品40 目，40min时，提取率达到最大值1.986mg/g。

提取工艺基于白果总黄酮的，其经由正交试验优化就可获取：采用80%的乙醇浓度和60℃的温度以及50分钟的提取时间，料液之间的比例就是1:60（g：mL），2.102mg/g就是其所要达到的提取率。

通过此次的经验了解到，基于此条件下，将实验经由3次的重复，提取率基于白果总黄酮的数值就是2.102mg/g，RSD相对标准偏差的数值则是0.33%，那么这个就证明，其具备一个较好重复性的提取工艺条件，其主要就是用来提取白果总黄酮。

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　致 谢

首先，我要感谢我的论文导师，对我的论文研究方向的指导和建议。在撰写论文的过程中，及时对我遇到的困难和疑虑提出了许多有益的改进建议，投入了太多的精力和时间。

此外，我还要感谢在论文过程中给过我建议和意见的同学和朋友，因为他们的宝贵意见，给我带来的启发使我受益良多。到最后能使我的论文顺利完成。同时对论文中的文献作者表以感谢。因为通过他们的研究文章，我对这个研究课题有了一个很好的起点。

最后，我衷心感谢我的家人、朋友和同学们的鼓励和支持，使我能够顺利完成这篇论文。

白果总黄酮提取工艺优化研究

价格 ¥9.90 发布时间 2023年8月24日

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