黄精种子休眠解除机理及组织培养研究

　摘要

黄精（Polygonatum sibircum Red.）是百合科(Liliacae)黄精属(Polygonatum)的多年生草本植物。在自然条件，黄精种子具有休眠特性，出苗率低，给人工栽培造成困难。本论文以黄精种子为试验材料，建立以破眠黄精种子为外植体的组织快繁体系，同时，论文对黄精种子休眠解除过程中涉及到的生理变化和相关差异基因进行了深入研究，探讨了黄精种子休眠解除机制。主要研究结果如下：

黄精破眠种子组织快繁体系研究。研究发现以黄精破眠种子为外植体的最佳萌芽诱导培养基为：MS +2.0mg/L 6-BA+ 0.1mg/L NAA；最佳增殖培养基为：MS +1.5mg/L 6-BA+ 0.5mg/L NAA；最佳试管苗生根培养基为1/2MS+0.1mg/L 6-BA + 2.0mg/L NAA 。黄精种子层积过程中生理变化的研究。研究发现可溶性糖、淀粉含量在层积期间呈现持续下降的趋势，而可溶性蛋白含量先下降后上升，通过对种子内部的SOD、CAT和POD进行分析，SOD活性总体随层积时间的延长呈现先下降后上升趋势，层积90 d时SOD活性达到最大值为112.52 U/g.FW，CAT、POD活性总体随变温层积的时间延长而逐渐上升。变温层积120 d时，黄精种子逐渐完成形态后熟，相关酶活性逐渐升高，种子内营养物质和GA3、ABA向生理成熟状态转化，变温层积120 d是黄精种子破除休眠的最佳时间点。黄精种子休眠解除过程中转录组研究。研究发现外源GA3可有效打破黄精种子休眠；通过转录组测序得到上调差异基因60,074个，下调差异基因19,642个；共有130,284个差异基因被GO功能注释到代谢过程、生物调控、细胞组分合成和酶催化活性等GO条目。对65,038个差异表达基因进行Pathway显著性富集分析，共发现138个代谢通路，休眠前后DEGs主要富集在碳代谢、次生代谢产物的生物合成和多糖的代谢等途径，基于KEGG数据库中注释结果，共发现15条与黄精种子休眠解除相关的代谢通路。黄精种子发育与休眠解除过程中大量与种胚形态建成、多糖分解及蛋白质合成的差异基因参与表达，涉及到多个代谢途径的相互作用，构成复杂的休眠解除调控网络，其中植物激素信号转导是调控休眠解除的关键因素之一。关键词：黄精；休眠；组织培养；生理变化；转录组

　绪 论

黄精（Polygonatum sibircum Red.）为百合科黄精属植物，是2015年版《中国药典》中药黄精三种基原植物之一，以其干燥根茎入药，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾等功效，多用于治疗心血管疾病和糖尿病等疾病，对于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴有显著疗效。随着社会对黄精药材的需求日益增加，传统采用根茎进行无性繁殖的人工栽培方式也严重制约着黄精药材产业的规模化生产。

目前，国内外关于黄精的研究大多集中在药理和有效成分等方面（党艳妮等，2020；楚冬海等，2020）。关于黄精的离体组织培养也大多以根茎、茎尖和叶片当外植体为主，黄精的破眠种子则鲜少被利用在组织培养上。而地下根茎中附着的微生物多，黄精根茎本身也存在内生菌（万学峰等，2013），建立以根茎作为外植体的无菌系存在不小的困难；以茎尖和叶片当外植体则又多一道愈伤组织诱导的程序，不仅更加繁琐，而且生产成本也会提高。因此，以黄精破眠种子为离体组织培养材料在节省工序的同时还能降低组培的困难度。黄精种子的休眠机制研究大部分集中在种子的机械障碍、内源激素平衡和生理形态后熟上面（赵昕等，2003；张玉翠，2011；张跃进等，2011），在解除休眠的分子机制上却鲜有报道。探寻黄精种子休眠解除分子机理并提高其种子利用率已成为黄精人工栽培亟待解决的问题。

本研究以黄精破眠种子为试验材料，采用单因素控制变量法，筛选了以黄精破眠种子为外植体的最佳萌芽诱导、增殖和生根培养基，为提高黄精种子利用率提供思路，也为优质黄精种苗工厂化提供技术支撑。同时本文通过对层积过程中种子酶活性及其生理生化指标进行测定和对休眠解除前后的种胚进行转录组测序，从两个方面揭示了黄精种子休眠解除机制，为进一步完善黄精种子破除休眠机理提供材料。

第一章 文献综述

　1 黄精的生物学特性与资源分布

黄精[Polygonatum sibiricumRed.]为百合科黄精属多年生草本植物，其根状茎圆柱状，节膨大，节间一头粗、一头细，粗头有短分枝，径1-2cm；茎高50-90cm，不分枝，有时攀援状；叶4-6枚轮生，长椭圆形，线状披针形，长8-15cm，宽0.4-1.6cm，先端拳卷或弯曲；花生于叶腋间，花序常具2-4花，成伞状，花序梗长1-2cm；浆果径0.7-1cm，球形或近球形，成熟时黑色，具4-7种子；花期5-6月，果期8-9月。野生黄精多生于林下、灌丛或山坡阴处，海拔800-2800米。黄精分布广泛，除了我国，朝鲜、蒙古和西伯利亚东部地区也有。我国的黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、陕西、内蒙古、宁夏、甘肃（东部）、河南、山东、安徽（东部）、浙江（西北部）是黄精的主要分布地，目前河北、内蒙古、陕西为其主要产区。

　2 黄精的研究进展

　　2.1 黄精的本草考证

黄精为 2015 年版《中国药典》收载的常用中药材，其正名始见于南朝梁时陶弘景的《名医别录》，而“葳蕤”、“菟竹”、“鸡格”、“鹿竹”、“救穷”、“垂珠”、“米脯”、“仙人余粮”和“野生姜”等作为其别名出现在历代本草记载中，古代文献对其记载繁多，分布较广，且基原植物不明，就造成了黄精的别名极多，同名异物，同物异名的情况非常普遍。南北朝《本草经集注》首次记载了药材黄精的形态与生境，具体则是根据根状茎的结节大小、形态来区分黄精和玉竹，直至唐初都是沿用这种方法。清代的《植物名实图考》则更加详实地描述了“黄精”和“滇黄精”的形态特征，而经过相关学者考证，《植物名实图考》里的“黄精”更贴近于《中国植物志》记载的“多花黄精”（王雨婷等，2019），从此黄精互生叶类群登上历史舞台。据考证，清朝以前本草所载的药材“黄精”主要指黄精P.sibiricum等轮叶类群，广泛分布于我国安徽、甘肃、河北、黑龙江、河南、吉林、辽宁、内蒙古、宁夏、山西、陕西和浙江等地；多生于林下、灌丛或山坡阴处；药材习称“鸡头黄精”（刘京晶等，2018）。黄精作为药食两用的植物，本草记载根、花、叶、实皆可食用，而黄精非药用部分是否有开发利用价值还需进一步研究。。

　2.2 黄精组织培养

自细胞全能性理论提出以来，在历代科学家们的不懈努力之下，植物组织培养技术在近百年的发展中已经日趋成熟。植物组织培养包括茎尖分生组织培养、愈伤组织培养和原生质体培养等（陈海伟，2007）。该技术能够缩短植物繁育时间，不受时间空间和自然环境的限制；对农业现代化有着重要的推动作用，而且已经产生了巨大的经济社会效益；为黄精产业规模化和育苗工厂化提供理论和技术支撑。

前人通过大量实验，对黄精愈伤组织的诱导、外植体选择、最适培养基筛选和环境条件控制均取得了不错的成果。从2003年开始就有不同的学者分别对黄精、多花黄精、滇黄精展开了组织快繁的研究。徐红梅等人（2003）在研究中发现多花黄精的根茎不定芽切片在1.0 mg/LBA+0.5 mg/L2，4-D培养基上可被诱导成愈伤组织；而该愈伤组织在1.5mg/LTDZ+1.0 mg/L2，4-D上不仅能被诱导出不定芽还能自身增殖；单独使用浓度在0.5-1.0mg/L的NAA、IBA、IAA或2，4-D有利于根的诱导。宁慧等（2009）选择根状茎作为外植体，适宜根状茎外植体愈伤组织诱导的培养基为 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；最佳增殖和丛生芽分化的培养基为 MS+2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L IBA 和MS+3.0mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA，而诱导试管苗生根的最佳培养基为1/2MS+3.0~5.0 mg/L NAA 。尹宏等（2009）以黄精萌动芽为材料，确定了不定芽分化培养基的理想组合MS + 1.5mg/L AgNO3 + 0.6mg/L BA+ 0.1m g/L IAA+ 0.1mg/L NAA；最佳试管苗生根培养基为1/3MS + 0.6mg/L NAA 。李文金等（2010）以泰山多花黄精试管苗为材料，筛选出了试管苗生根的最佳培养基为：改良 1/2MS+ 0.5mg/L NAA+20g/L 蔗糖+7d 暗培养，有效解决了黄精组培快繁中生根率低的问题。杨玉红（2011）认为 6-BA 对诱导黄精愈伤组织生长效果显著，2,4-D、NAA 和 KT 效果不显著；黄精愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS+2,4-D 3.0 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+KT 0.25 mg/L。朱伍凤（2013)利用黄精的叶片和茎段为外植体建立了黄精的无菌系，筛选出最佳愈伤诱导培养基MS+2.0 mg/L6-BA+3.0 mg/LNAA；最佳增殖培养基MS+1.5 mg/L6-BA+0.3 mg/LNAA；最佳生根培养基为MS+0.5 mg/LNAA。张智慧等（2018）以滇黄精种子为试验材料，筛选出了种子萌发和生根最优培养基，即不附加任何激素的1/2MS培养基和MS+0. 5 mg/LNAA。

　2.3黄精的化学成分研究

黄精化学成分为黄精多糖、甾体皂苷、黄酮、木脂素、氨基酸以及微量元素、挥发油等。黄精多糖是其主要的药理活性成分，其中，生黄精中多糖含量最高, 4.47%～21.34%，而炮制方法的不同则会在不同程度上导致多糖含量的降低（曹明菊等，2008）。黄精多糖最早由中国医学科学院药物研究所进行系统研究，当时通过Sephadex G-200层析分离法分析得知黄精多糖分别由葡萄糖、半乳糖醛酸和甘露糖缩合形成, 其比例组成为6∶1∶26（杨明河等，1980）。皂苷类成分是药用黄精中主要的药效成分，包含三萜皂苷和甾体皂苷。随着现代分离技术的发展和应用，黄精的化学成分研究取得了较大进展。据文献报道，从药用黄精的化学成分中总共分离出67种甾体皂苷类化合物，主要是薯蓣皂苷（徐德平等，2006）；12种三萜皂苷类成分, 主要有乌苏酸型三萜皂苷（徐德平等，2006）、齐墩果烷型三萜皂苷（Hu C Yet al.2010）、达玛烷型三萜皂苷（马百平等，2007）等。药用黄精中黄酮类化合物主要有二氢黄酮、查耳酮、高异黄酮等多种结构类型，作为黄精属植物所含的另一重要特征性成分, 高异黄酮类化合物母核结构仅比异黄酮多一个碳原子，目前从黄精中发现的高异黄酮类化合物主要为4′, 5, 7-三羟基-6, 8-二甲基高异黄酮（孙隆儒等，2001）。据文献记载，在中药黄精的三种基原植物中，黄精的黄酮类成分含量最少，滇黄精最多，多花黄精居中（王晓慧等，2019），但是同样有研究表示，不同基原黄精总黄酮含量比较结果为:黄精高于滇黄精, 滇黄精高于多花黄精（张洪洋等，2017），造成这种结果的原因可能与同种植物不同的产地有关。木脂素是存在于植物中一类基本结构由苯丙素组成的多聚体。关于黄精中木脂素的文献报道最早见于2001年，孙隆儒等首次从其根茎中分离得到了已知的4种木脂素类成分（(+) -丁香脂素、 (+) -丁香脂素-O–D-吡喃葡萄糖苷、右旋松脂醇-O–D-吡喃葡萄糖基 (6→1) –D-吡喃葡萄糖苷和鹅掌楸碱）和3个神经鞘苷类成分。陈辉等（2020）则从黄精根茎中发现1个新的苯骈呋喃型木脂素，被命名为黄精新木脂素苷A(1)。此外，黄精还含有人体所需的8种氨基酸及其他10种氨基酸（王冬梅等，2006），另外王曙东等（2001）还测得Fe、Zn、Sr、Ba、Ge、Mn等18种无机元素。尤新军（2009）采用水蒸气蒸馏法（SD）结合气质联用（GC-MS）技术对黄精根茎挥发油成分进行分析。从中共鉴定出42种组分,已鉴定挥发油成分占总挥发油含量的92.36%。采用固相微萃取法（SPME）结合气质联用（GC-MS）技术对黄精根茎挥发油成分进行分析。从中共鉴定出46种组分,已鉴定挥发油成分占总挥发油含量的96.37%。此外, 黄精属植物中还含有少量生物碱（陈辉等，2020）、维生素及色素（王晓慧等，2019）。

　2.4黄精的药理作用研究

黄精具有极高的药用价值, 早在2000年前就已被古典药学著作《名医别录》将其列为上品, 称其能“补中益气, 除风湿, 安五脏, 久服轻身、延年、不饥”。现代研究表明黄精在抗氧化和抗衰老、调节免疫力、调血脂、改善记忆力、抗肿瘤等方面作用显著。大量研究表明，黄精多糖有抗衰老、调节免疫力、改善记忆力和防治痴呆、降血糖、抗动脉粥样硬化（李友元等，2005）、抗炎和抗菌（郑春艳等，2010；李志涛等，2017）、抗肿瘤（张锋等，2007；段华等，2014）、抗病毒（辜红梅等，2003）、预防骨质疏松（曾高峰等，2014；Li D et al.2016）、保护心肌细胞（马怀芬等，2018）及改善贫血（王红玲等，2000）等功效。黄精延缓衰老的作用可能与其增强和调节机体免疫功能、激活内源性防御自由基损伤的物质和抑制氧自由基等方面有关（朱红艳等，1999）。方欢乐等人（2018）研究表明黄精多糖使大鼠血液中的SOD活性增加,MDA含量降低,表现出了很好的体内抗氧化作用。傅圣斌等（2013）则发现高剂量的黄精多糖可明显增加小鼠胸腺及脾脏质量, 提高血清溶血素含量及巨噬细胞吞噬指数，从而改善环磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能。另外，黄精多糖可通过升高患儿RBC-C3b受体花环率从而增强肾病综合征患儿红细胞免疫功能（肖小妹等，2018）。黄精多糖具有抑制多巴胺神经元凋亡、促进多巴胺神经元再生（陈娟等，2010）、改善慢性脑缺血和老年痴呆大鼠的学习记忆能力和减轻大脑超微结构损伤的作用（唐伟等，2017；吴石星，2009）。黄精可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值，可使小鼠肝脏中控制肝糖原的合成与分解以及维持机体血糖恒定的环磷酸腺苷 (c AMP) 含量下降,（王红玲等，2002）。李友元等（2005）研究发现黄精多糖能下调实验性兔动脉粥样硬化血管内膜血管细胞黏附分子-1 （VCAM-1）的高表达，抑制炎性细胞对内皮细胞的黏附，阻止血管内皮炎症反应的发生、发展。黄精根茎中的Sr、Ge、P、Ca、Na等元素含量具有较强的抗衰老、防癌及安神健脑作用（王曙东等，2001）。黄精皂苷通过影响慢性应激抑郁大鼠大脑皮层特定受体及其介导的信号通路，改善模型大鼠的体质量及自发活动次数，显示出其抗抑郁效果（陈程等，2013；魏浩洁等，2012）。在抗肿瘤方面，Ahn等（Ahn M J et al.2006）对从黄精中分离得到的6个甾体皂苷类化合物进行体外细胞毒活性测试，其中4个化合物有抗肿瘤活性。 现代研究表明，木脂素能够抵抗多种肿瘤细胞（Dewick P Met al.2007）、抗艾滋病病毒（Ichimura Tet al.1998）、抗氧化（孙潇，2009）以及降血糖（Mizuno Tet al.1999）等药理作用，而关于黄精中木脂素的药理作用研究则并无文献报道。另外，黄精在治疗精子DNA碎片率 (DFI) 异常的弱精子不孕症方面有一定疗效（刘炜等，2016），但还需要进一步的研究证明。

　　3 黄精种子休眠研究进展

种子休眠是一种植物种子在长期系统进化和选择过程中不断演化形成的对外界环境的适应机制（Baskin J Met al.2004）。休眠能提高植物对高温、低温和干旱等不良环境的适应性，有利于植物度过恶劣环境条件，这对保持其自身的繁衍发展具有重要意义。

　3.1 休眠类型及原因

Baskin等（2004）在前人的分类系统上进行了完善和修订，提出了比较全面的休眠分类系统，分别为：物理休眠（physical dormancy）、生理休眠（physiological dormancy ）、 形态休眠（morphological dormancy）、形态生理休眠（morphophysiogical dormanc）和复合型休眠（combinational dormancy）。而大量研究表明，黄精种子休眠与种子结构、种子内源抑制物、种胚发育程度有关。黄精种皮孔隙小且结构致密，表皮还沉积有角质，使得种皮更加不透气和不透水，影响种子代谢活动（赵昕等，2003）。而且种皮的机械阻碍作用也会限制胚突破种皮影响种子萌发。而且黄精种子的胚被厚厚的胚乳包裹，胚乳细胞小、细胞质浓厚、胞间隙小、排列致密，这种结构影响水的吸收利用，存在胚乳吸水障碍，从而导致黄精种子萌发缓慢（张跃进等，2010；王剑龙等，2013）。Amen（1968）认为种子休眠和萌发取决于内源抑促物之间的平衡。有研究表明，植物种子中脱落酸 (Abscisic acid, ABA) 和赤霉素 (Gibberellin acid, GA)是关键的内源信号分子，两者在调节种子休眠和萌发过程中存在相互拮抗的关系：GA启动和促进种子萌发，ABA则诱导种胚细胞分裂停止从而维持种子休眠（江玲等，2007）。张跃进等（2011）用黄精种子胚、胚乳和种皮的粗提物分别处理白菜种子，均出现萌发抑制现象，其中胚的抑制活性最强。说明黄精种子胚、胚乳、种皮都存在萌发抑制物。并且发现黄精种子成熟后期内源激素 ABA 含量升高，因此可以判断，黄精种子充分成熟后ABA含量升高也是导致黄精种子休眠的原因之一。黄精成熟果实中种子胚发育不完全，需要时间让胚的结构发育完善。黄精种子属于淀粉性种子，刚采摘的黄精种子粗脂肪和淀粉含量较高，淀粉酶活性较低，可用于种子萌发的可溶性蛋白和可溶性糖含量较低，所以黄精种子的休眠是形态后熟和生理后熟的综合休眠（张玉翠，2011）。黄精种胚存在形态和生理后熟，种皮、胚乳结构及其所含萌发抑制物也导致黄精种子休眠，所以可以合理推断，黄精种子的休眠是其种子结构、内源激素以及胚的发育情况等综合因素造成的。

　3.2打破种子休眠的方法

种子休眠在一定程度上保护个体生存与延续的同时也给种子育苗带来诸多麻烦，满足不了现代生产的需要。因此，如何快速打破种子休眠，缩短育苗周期正逐渐成为研究热点。

打破休眠的方法有很多，如机械处理（张玉翠，2011）、温水浸种处理（朱伍凤，2013）、层积处理（Lin C Het al. 1994；Meyer S Eet al. 2000；赵致等，2005）、化学试剂处理（Randolph L Fet al. 1943；杨期和等，2006）、激素处理（Tager Jet al. 1961；Ren Y Qet al. 2008；焦劼等，2016）、调节温度和光照（朱伍凤，2013）等。在各种打破黄精种子休眠的方法中，单一的处理法在一定程度上提高了种子萌发率，其中层积处理对种子萌发最好（刘佳等，2018）。有研究表明，通过低温层积处理能促进种子胚形态发育成熟，分解内源抑制物质，脱落酸及赤霉素等激素含量平衡也发生改变，相关酶的活力提高，淀粉等大分子物质分解等（Lin C Het al. 1994；Meyer S Eet al. 2000）。低温沙藏和冷冻沙藏处理可以帮助种子保留内部水分，有利于种胚后熟发育，提高种子活力且发芽快。而室内储藏的种子水分散失较快，从而导致后熟停滞，萌发率降低。试验表明，低温沙藏更有利于黄精种子的萌发（赵致等，2005）。低温沙藏与一定浓度外源激素相结合的处理方法和种子层积后通过温水浸种，都表明多花黄精种子发芽率有所提高（刘保财等，2015）。

　　3.3种子休眠解除机理研究进展

导致种子休眠解除的机理是复杂多样的，其中一类种子休眠是由于胚周围包被组织的限制，例如种皮机械束缚、种皮不透水、不透气以及化学抑制物质的存在等，一旦将胚从种子中分离出来，休眠即被打破。豆科、锦葵科和茄科植物种子休眠大部分是由于透水困难导致，通过破除种皮机械障碍，休眠便会解除。还有一部分种子的休眠原因是透气性不足而处于休眠状态，但是种皮透水性良好（李耀龙，2011）。张玉翠（2011）对黄精种子进行了完整种子、划伤种皮、切除胚乳基部、纵向切除部分胚乳、切除种皮只带少量胚乳、离体胚的6种处理，结果表明，离体胚及切除种皮和大量胚乳的萌发率较高，完整种子始终未萌发。另一种却是由于胚本身造成的。胚的休眠可分为形态后熟和生理后熟两类，有些种子由于内部胚在形态上未发育成熟，需要继续完成器官分化才能发芽，虽然在种子外表看已充分成熟，但仍处于休眠状态，如巴东木莲种子休眠的主要是由种胚发育不完全造成的（陈发菊等，2007）。许多物种的种子虽然胚结构已分化完全，但仍需要经过一定的后熟期干燥或湿冷环境如低温层积处理，才能解除休眠。华重楼、西洋参、银杏等植物均是由于胚生理后熟而导致的休眠（李昭玲等，2015；赵春香等，2005；刘玉芹等，1994）。种皮、胚或胚乳中存在化学抑制物质也是影响种子休眠的原因之一。张跃进等（2011）发现黄精种子充分成熟后ABA含量升高，ABA则能诱导种胚细胞分裂停止从而维持种子休眠。三七种子休眠则是由于胚形态后熟和ABA抑制物质共同作用导致的（杨凯等，2018）。

经过科研工作者们的不懈努力，种子休眠解除机理总结如下：

激素信号的感知和传递植物激素在种子休眠和萌发过程中扮演着非常重要的角色，激素能对环境变化做出响应并通过信号转导因子对种子内各种生理变化做出反应，通过调节相关酶、蛋白质的代谢活动，进而调控种子休眠与萌发过程（杨荣超等，2012）。研究表明，赤霉素和脱落酸是种子萌发的主要促进剂和抑制剂。GA通过促进α-淀粉酶、蛋白水解酶等的表达从而促进种子萌发，ABA则诱导种胚细胞分裂周期停滞从而抑制种胚萌发（江玲等，2007）。除此之外，其他激素及化合物也发挥一定的作用，例如乙烯（Ethylene，ETH）、油菜素内酯（Brassinosteroid，BRS）等。乙烯和油菜素内脂均能影响ABA和GA在种子萌发中的作用。在种子萌发过程中，乙烯（ETH）通过增强种子的呼吸作用或增加水势，促进胚轴中胚根细胞的扩大，利于胚轴的伸长，同时也促进根毛的分化（杨荣超等，2012）。ETH与ABA相互拮抗，Beaudoin N等（2000）在研究烟草（Nicotiana tabacum）种子休眠调控时发现内源ETH能够诱导ABA敏感型Iβ-1，3-葡聚糖酶（βGlu I）基因的高水平表达，即通过降低种子对脱落酸抑制作用的敏感性从而促进种子萌发。油菜素内酯不敏感型和缺陷型突变体对脱落酸更敏感，外源油菜素内酯能使缺乏赤霉素合成酶的种子恢复萌发。

胚乳弱化胚乳通过提供营养物质，支撑胚并控制胚生长，在种子发育和萌发过程中作为机械屏障。黄精种子有着致密且厚重的胚乳，其萌发过程中单纯依靠胚根细胞的伸长生长并不足以突破这些机械障碍，萌发的完成还需要胚乳自身进行弱化，在萌发过程中，胚乳细胞壁逐步裂解，胚乳组织弱化，从而胚根突出。细胞壁主要由纤维素、果胶和半纤维素等成分构成，降解这些多糖的酶可能会与胚乳弱化有关。现代研究者普遍认为，种子萌发过程中胚乳弱化其实是胚乳本身产生的细胞壁降解酶导致其自身降解(程序化死亡)，而且胚乳弱化是由多种细胞壁降解酶共同作用完成的。研究发现，在众多细胞壁降解酶中（β-甘露聚糖酶(β-Man)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、果胶甲酯酶(PME)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纤维素酶(Cx)、阿拉伯糖苷酶(Ara)、木糖苷酶(Xys)和甘露糖苷酶(Mas)），β-Man 、PG、PME、Cx、β-Gal 和 β-Mas 这 6 种酶在黄精种子整个胚乳弱化过程中发挥着重要且积极的作用；该研究还发现，在黄精种子培养过程中，GA3处理后的黄精种子胚周围的组织较CK组软化更快，且胚的生长速度也更快（程秋香，2016）。

温度温度是影响种子休眠与萌发的主要因子之一，种子感受外界温度的变化并调节自身萌发状态，每一种植物种子都有其适宜萌发的温度范围，温度太高或太低都会对种子活力造成影响（刘小金等，2014）。段秋红（2014）在研究拟南芥种子对环境信号的响应时，发现高温不仅可以通过促进脱落酸的合成抑制萌发，还可以抑制GA20ox和GA3ox的基因表达使赤霉素合成减少。在适宜的培养温度范围内，种子发芽快，发芽率高，胚轴长势好。对于大多数植物种子而言，水和低温是其解除休眠必不可少的条件，一般处理温度在1~10 ℃之间，有时可达到15 ℃。低温处理时需要把种子和潮湿的介质逐层间隔放置，也被成为“层积”。研究表明，低温层积对物理休眠、形态休眠、生理休眠、形态生理休眠和复合型休眠的解除均有一定的作用。在低温层积过程中，种胚不断膨大，萌发势逐渐提高，最终突破胚乳等外周组织解除休眠（史桑桑，2014；Katarzyna Ciacka et al. 2019）。低温层积处理可以提高种子对环境因子（如光照和硝酸盐）及外源赤霉素的敏感性，促进种胚形态的发育成熟，加快抑制物质的分解，提高相关酶活性，促进贮藏物质的分解代谢等（Lin C Het al. 1994；Meyer S Eet al. 2000）。变温层积有利于解除休眠，且温差越大，效果越明显。变温层积过程中，植物种子内部各内源激素量及比值逐渐变化，内源激素的变化是种子储藏物质转化、大分子物质合成和萌发的重要条件。李晓琳等（2018）在红豆杉种子休眠机制研究中发现高低温交叉处理和低温层积处理都能引起脱落酸含量的下降，促进种子萌发。

4 本研究的目的意义与研究内容

　　4.1 本研究的目的意义

黄精为以其干燥根茎入药，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾等功效，在治疗心血管疾病和糖尿病等疾病上有着显著疗效。随着社会对黄精药材的需求日益增加，传统采用根茎进行无性繁殖的人工栽培方式也严重制约着黄精药材产业的规模化生产。关于黄精的离体组织培养也大多以根茎、茎尖和叶片当外植体为主，黄精的破眠种子则鲜少被利用在组织培养上。而地下根茎中附着的微生物多，黄精根茎本身也存在内生菌（万学峰等，2013），建立以根茎作为外植体的无菌系存在不小的困难；以茎尖和叶片当外植体则又多一道愈伤组织诱导的程序，不仅更加繁琐，而且生产成本也会提高。因此，以黄精破眠种子为离体组织培养材料在节省工序的同时还能降低组培的困难度。黄精种子的休眠机制研究大部分集中在种子的机械障碍、内源激素平衡和生理形态后熟上面（赵昕等，2003；张玉翠，2011；张跃进等，2011），在解除休眠的分子机制上却鲜有报道。探寻黄精种子休眠解除分子机理并提高其种子利用率已成为黄精人工栽培亟待解决的问题。

本研究以黄精破眠种子为试验材料，，筛选了以黄精破眠种子为外植体的最佳萌芽诱导、增殖和生根培养基，为提高黄精种子利用率提供思路，也为优质黄精种苗工厂化提供技术支撑。同时本文通过对层积过程中种子酶活性及其生理生化指标进行测定和对休眠解除前后的种胚进行转录组测序，从两个方面揭示了黄精种子休眠解除机制，为进一步完善黄精种子破除休眠机理提供材料。

　4.2 本研究的内容

（1）筛选以黄精破眠种子为外植体的最佳萌芽诱导、增殖和生根培养基组合。以MS培养基为基本培养基，外加不同植物激素配比，建立三种培养基配方并比较分析植株的增殖系数、株高和茎粗以及生根率，筛选出最佳组合。

（2）黄精种子休眠解除机制的生理生化研究。对变温层积过程中黄精种子过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、可溶性糖、可溶性蛋白、内源激素含量进行分析比较。

（3）黄精种子休眠解除机制的分子层面研究。以休眠解除前后的黄精种胚为材料，利用新一代高通量测序手段对供试样品进行转录组测序，并进行系统的生物信息学分析。

第二章 黄精破眠种子组织快繁体系研究

　摘要： 筛选以黄精破眠种子为外植体的最佳组织快繁培养基组合，提高黄精种子利用率，为黄精人工栽培规模化、工厂化提供技术支持。采用200 mg/LGA3浸种处理24h并结合沙藏层积90d打破种子休眠，通过单因素变量法确定增殖、壮苗和生根的最佳培养基组合。结果表明，以黄精破眠种子为外植体的最佳萌芽诱导培养基为：MS +2.0mg/L 6-BA+ 0.1mg/L NAA；最佳增殖培养基为：MS +1.5mg/L 6-BA+ 0.5mg/L NAA；最佳试管苗生根培养基为1/2MS +0.1mg/L 6-BA+ 2.0mg/L NAA 。本研究建立了黄精破眠种子的组织快繁体系，提高了黄精种子利用率，为黄精的大规模设施人工栽培和种苗工厂化生产提供了技术支撑。

　关键词： 黄精；组织培养；休眠；种苗

百合科多年生草本植物黄精（Polygonatum sibiricumRed.），始载于《名医别录》，以其干燥根茎入药，性平，味甘。归脾、肺、肾经。中国药典（2015）收录的三种药用黄精基原植物之一。近年来，随着黄精药用价值和保健价值越来越被人们认识，对黄精原料的需求与日俱增，人工栽培已成为解决资源短缺的主要渠道。

黄精繁殖方式主要为2 种：有性繁殖(种子)和无性繁殖(根茎) 。然而，由于黄精种子自然条件下休眠期较长、发芽率较低、出苗不整齐等问题。多年来在人工栽培中大多采用根茎进行无性繁殖，但是无性繁殖用种根茎量大且繁殖系数低，长期的无性繁殖还会引起黄精品质退化，严重制约着黄精药材产业的规模化生产。利用植物组织培养技术生产的试管苗能有效解决黄精的种苗问题。

本研究以黄精破眠种子为外植体，建立黄精破眠种子的组织快繁体系，提高黄精种子利用率，为黄精的大规模设施人工栽培和种苗工厂化生产提供技术支撑。

　　1 材料与方法

1.1 试验材料

黄精种子采自安徽省宣城市旌德县庙首镇黄精栽培试验基地（118° 25´18″E，30°14´27″N，海拔255 m），样本植株经南京农业大学园艺学院向增旭副教授鉴定为百合科植物黄精Polygonatum sibiricumRed.，黄精成熟种子见图2-1。

1.2 试验设计

　1.2.1 化学试剂处理

采用200 mg/L的GA3 溶液浸泡成熟黄精种子24 h。

　　1.2.2 沙藏层积

将上述化学试剂处理过的黄精种子与河沙按1：（2.5～3.5）比例混合均匀后装入网袋中，将网袋覆河沙2.5-4.5 cm进行沙藏处理，河沙含水量以“手握成团，松之即散”为宜。室外沙藏层积90d后，挑选出露出胚根的种子。

1.2.3 培养基

MS 培养基为基本培养基，建立黄精破眠种子组织培养的三种培养基配方:

萌芽诱导培养基：

增殖培养基：

生根培养基：

以上培养基均为添加蔗糖 30 g/L，琼脂粉6.5g/L，PH 值为5. 8～6. 0。

　1.2.4 试验方法

黄精组织培养过程均在超净工作台内进行无菌操作。培养房环境温度为( 26 ± 2) ℃，光照强度为2000 Lx，时间 12 h/d。

1. 2. 4.1 种子消毒与萌芽

将室外沙藏层积90d后，挑选出露出胚根的种子，用自来水漂洗三次。在超净工作台内进行消毒处理: 将种子放入玻璃瓶内，用无菌水冲洗 3 次用 75% 酒精漂洗 30 s，后用 0. 2% 的氯化汞溶液表面灭菌 4~6 min 后，再用无菌水冲洗 4~5 次，取出种子用无菌纱布沥干。将种子接至诱导培养基上，每瓶接 2~3 颗种子，每个配方接 20 瓶，放在培养室培养。启动诱导前阶段( 5~10 d) ，种子萌发变绿，继续培养 5~10 d，变绿的球茎组织形成生长点而萌发出芽，接种25 d 后，观察各个配方的萌芽情况。

萌芽率 = 萌芽数 / 接种数 × 100%

1. 2.4.2 继代增殖培养

将萌芽的小球茎继续培养，球茎基部继续膨大，芽长到 2~3cm 左右高度时，将其接种至继代增殖培养基中。每瓶只接入 1 个芽，每个配方接种 20 瓶。放置培养房内培养 25 d，小球茎继续萌发出芽，观察和统计各自增殖情况，重复三次试验。

增殖系数 = 萌发芽数 / 接种芽数

1. 2. 4.3 生根壮苗

在继代增殖培养过程中，选取株型较好，植株粗壮的继代苗，接种于生根培养基中。每瓶接入 2株苗，每个配方接种 20 瓶。放置培养室光照培养 30 d，观察和统计各自生根情况。

生根率 =生根株数 / 接种株数 × 100%

　　图 2-1 黄精成熟种子

Fig. 2-1 mature seeds ofPolygonatum sibircum Red.

　2 结果与分析

2.1 激素浓度黄精破眠种子萌芽的影响

如表2-1所示，在不同激素浓度配比下，破眠种子的萌芽率会随着6-BA的升高而增加。试验中发现，当6-BA的浓度升至2.0mg/L(A5，A6)，萌芽率最高。而将破眠种子接种培养的第 9d，观察发现有的种子开始萌芽(图2-2)。结合试验数据，生长素NAA的浓度对萌发率并没有太明显的影响。对比各个培养基配方的初次萌芽时间，不难看出，生长素NAA的浓度较低的培养基（A2，A4，A6）比NAA浓度较高的培养基（A1，A3，A5）的萌发速度更快。因此，生长素对黄精破眠种子的萌发有促进作用。

　　图2-2 发芽的种子

表 2-1 不同激素配方组合对诱导萌芽的影响

2.2 不同激素对黄精继代增殖的影响

在继代增殖过程中，主要考虑细胞分裂素( 6-BA)对芽增殖影响，生长素 NAA 固定在较低浓度配合使用。在成功获得无菌外植体后，将带有萌芽的球茎接种于设计的 6 组继代增殖培养基中，25 d 后均可以产生丛生芽以达到增殖目的(图 2-3) 。

根据实验过程的观察和记录，此培养过程中做的三次重复试验，每次接种芽数均为20个，( 三次试验新芽数 B1: 32、30、32；B2: 29、31、30; B3: 35、34、36；B4: 37、37、39；B5: 38、40、42；B6: 39、41、40; ) 每组激素浓度配方的三次新芽数相差均在 ± 3个以内，可以看出各组激素浓度对增殖影响的相对稳定性，由此综合统计得出表 2-2。

表 2-2不同激素配方组合对继代增殖的影响

由表 2-2 可以看出，在黄精破眠种子萌发继代增殖过程中，随着6-BA 浓度的提高，其增殖系数也会相应提高，当浓度到达2. 0 mg/L时，表 2-2 中 B5 和 B6 配方增殖系数都能达到2. 0，均比前两个浓度水平更高。但在继代过程中观察发现 B5 和 B6 组的继代苗长势较另外两个激素水平弱，比较不利于后面的生根壮苗培养，达不到优质种苗要求。而且试验过程中发现，生长素NAA对增殖系数影响不大，但是0.5mg/L（B2，B4，B6）水平的培养基里的苗更加粗壮，对后续的生根培养和育苗移栽更加有利。

2.3 不同激素浓度对黄精生根的影响

在生根壮苗过程中，通常培养基采用1 /2MS。在激素调节方面主要考虑生长素与细胞分裂素的比值对生根的影响，生长素NAA对生根有促进作用。本次试验中，设计NAA/6-BA比值的 6 个不同梯度的生根壮苗配方( C1-C6) 。接种培养30 d，根据试验过程观察和记录数据，结果见表 2-3。

表 2-3不同激素配方组合对生根的影响

由表 3 可以看出，随着NAA/6-BA比值的升高，生根率也会增加，但是比值过高（C5）会影响生根状态，虽然生根率略有提高，但每根太过须细弱( 图 2-5) ，不利于后续的炼苗移栽。同时，试验中发现，低浓度的细胞分裂素6-BA（C1，C3）更有利于试管苗的生根，其生根率和生根状态处于一个较佳状态( 图 2-5) ，能相对提高室外的炼苗移栽成活率。

3 讨论

　　3.1 黄精破眠种子组织快繁体系的建立

黄精种子在自然条件下每年7月至8月成熟，第二年3月至4月才开始萌发，有很长时间深度休眠期。研究表明，低温沙藏和冷冻沙藏处理可以帮助种子保留内部水分，有利于种胚后熟发育，提高种子活力且发芽快。而室内储藏的种子水分散失较快，从而导致后熟停滞，萌发率降低。试验表明，低温沙藏更有利于黄精种子的萌发（赵致等，2005）。

本研究利用试剂处理并结合沙藏层积的方法破除黄精种子休眠，以成功解除休眠的黄精种子为组培材料建立组织快繁体系，以此来解决黄精根茎外植体易污染的问题（万学峰等，2013），另外还能提高黄精种子利用率，缩短黄精有性繁殖的年限。众所周知，植物生长素与细胞分裂素之比影响植物细胞的发育方向，比值高时促进植株根的生长，低时促进茎叶的生长伸长。笔者在试验中也发现，组织培养的激素配比十分重要：当6-BA的浓度升至2.0mg/L(A5，A6)，萌芽率最高，而与A6相比A5的萌发速度较快；继代增殖过程中，随着6-BA 浓度的提高，其增殖系数也会相应提高，当浓度到达2. 0 mg/L时，B5 和 B6 配方增殖系数都能达到2. 0，均比前两个浓度水平更高，B6水平的培养基里的苗更加粗壮，对后续的生根培养和育苗移栽更加有利；低浓度的细胞分裂素6-BA（C1，C3）更有利于试管苗的生根，C3有着更发达的根系，更加有利于后续的炼苗移栽。

3.2 试验设计的不足和改进

本试验采用较为简单的激素搭配，即生长素NAA和细胞分裂素6-BA。在继代增殖过程中，整体的增殖系数并不高，最高的增殖系数也只是达到2.0。在增殖系数低的情况下，如果试验材料达到目标需求，就必须增加继代次数，这就导致了试验工作量的增加和试管苗污染率的上升，在生产上这种情况直接提高了生产成本，十分不利于规模化、工厂化生产。

李莺等人（2011）研究发现，在6-BA浓度相同时，使用一定浓度的IAA或IBA比相同浓度的NAA，在出芽率和增殖系数上有明显优势。因为外植体材料的不同，所以不一定有参考价值，却为以黄精破眠种子为外植体的组织快繁体系的优化，提供了一个不错的思路。

　4 结论

本试验研究筛选出以黄精破眠种子为外植体的最佳增殖培养基为：MS +1.5mg/L 6-BA+ 0.5mg/L NAA；最佳不定芽分化培养基为：MS +2.0mg/L 6-BA+ 0.1mg/L NAA；最佳试管苗生根培养基为1/2MS +0.1mg/L 6-BA+ 2.0mg/L NAA 。这为今后黄精种子的试管苗规模化工厂化栽培提供了一定的理论基础和参考。

第三章 黄精种子层积过程中酶活性及其生理变化研究

摘要：通过对变温层积过程中黄精种子酶活性及其生理生化指标的测定，探索出打破黄精种子休眠的关键时间节点，为揭示变温层积打破黄精种子休眠机理提供依据。将成熟黄精种子进行变温层积不同时间（0 d、30 d、60 d、90 d、120 d）处理，并测定在不同处理下种子的酶活性、贮藏物质变化和激素含量。结果表明，可溶性糖、淀粉含量在层积期间呈现持续下降的趋势，而可溶性蛋白含量先下降后上升，通过对种子内部的SOD、CAT和POD进行分析，SOD活性总体随层积时间的延长呈现先下降后上升趋势，层积90 d时SOD活性达到最大值为112.52 U/g.FW，CAT、POD活性总体随变温层积的时间延长而逐渐上升。本研究结果表明变温层积120 d时，黄精种子逐渐完成形态后熟，相关酶活性逐渐升高，种子内营养物质和GA3、ABA向生理成熟状态转化，变温层积120 d是黄精种子破除休眠的最佳时间点。

　关键词：黄精；休眠；层积；酶活性；生理生化

黄精（Polygonatum sibiricumRed.）种子属于淀粉性种子，刚采摘的黄精种子粗脂肪和淀粉含量较高，淀粉酶活性较低，可用于种子萌发的可溶性蛋白和可溶性糖含量较低（张玉翠，2011）。变温层积是一种有效打破种子休眠的方法，具有软化种皮，增强种子透性，提高呼吸速率，降低种子ABA含量和增加GA含量的作用（张桓溥等，2016）。种子在层积过程中，种胚逐渐完成形态后熟，其大分子贮藏物质在相关酶的作用下转化为可溶性糖、可溶性蛋白等小分子物质，在胚的代谢和生长过程中被利用（费日雯等，2017）。

本研究以成熟的黄精种子为试验材料，进行室外沙藏层积处理，并对层积过程中种子酶活性及其生理生化指标进行测定，探索打破黄精种子休眠的关键时间节点，为揭示沙藏层积打破黄精种子休眠机理提供依据。

　1 材料与方法

1.1 试验材料

同第二章。

1.2 试验设计

　1.2.1 种子层积处理

分别取适量饱满、干净的黄精种子流水冲洗24 h，然后将晾干的种子与河沙按1：（2.5～3.5）比例混合均匀后装入网袋中，将网袋覆河沙2.5-4.5 cm进行沙藏处理，河沙含水量以“手握成团，松之即散”为宜。室外沙藏层积0、30、60、90、120 d后随机取出部分种子，洗净晾干后检测其种皮透性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性。

1.2.2 种子粒径、生活力测定及发芽试验

（1）取不同层积时间处理种子（0、30 d、60 d、90 d、120 d）各10粒，分别用游标卡尺测量不同层积时间处理的黄精种子粒径，并做好数据统计。（2）取成熟、饱满的黄精种子用TTC法（雷慧霞等，2019）测定其种子生活力，实验重复3次，每个重复100粒。（3）发芽试验。取成熟、饱满的黄精种子置于铺有滤纸和湿沙的培养皿中，每皿30粒，置于25 ℃恒温光照培养箱中进行发芽试验。以连续3 d中每天的发芽率不超过参试种子总数的1%视为萌发结束持续30 d，统计发芽数并计算发芽率（许晓岗等，2012）。

1.2.3 种子吸水率测定

取不同层积时间处理种子（0、30 d、60 d、90 d、120 d）各100粒，称质量后放入直径为9 cm的培养皿中，加入足量的蒸馏水，置于25 ℃恒温箱中让其吸水（许晓岗等，2012）。于2、14、26、38、50、62、74 h和86 h后取出种子，用吸水纸吸取去多余水分，用万分之一天平称质量，测定黄精种子吸水率（贾金蓉等，2017），吸水率计算公式如下：

吸水率=

×100%

　1.2.4 黄精种子层积过程中内部各项物质的变化

采用1.2.1所述的方法处理种子，在种子层积0 d、30 d、60 d、90 d、120 d时测定种子中可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等指标的变化，操作方式如下：

1.2.4.1 可溶性糖、淀粉含量的测定

测量可溶性糖含量的方法采用蒽酮比色法（李晓旭等，2013；翁霞等，2013；陈秀兰，1984）。首先以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。将蒽酮溶于乙酸乙酯制成蒽酮试剂，之后进行样品的提取与测定：取待测种子0.1 g在研钵中碾碎，加10 ml蒸馏水于具塞刻度试管中，用塑料膜进行封口，水浴锅中沸水提取30 min，8300 r/min，离心30 min，将提取液过滤并定容到25 ml容量瓶内。吸取样品0.5 ml于试管中，加1.5 ml蒸馏水和5 ml蒽酮溶液，充分震荡后，将试管放入沸水中水浴10 min，冷却后用分光光度计测OD630。

测量淀粉含量的方法采用李彦莹等（2018）的方法，并略有改进。精确称取黄精种仁0.1 g左右，在研钵中碾碎，加入1 ml蒸馏水，混匀，25 ℃条件下3000 r/min，离心10 min，取上清液待测。将分光光度计预热30 min以上，调节波长至620 nm，蒸馏水调至“0”，配制工作液（在试剂三中加入3.75 mL的蒸馏水后，缓慢加入21.25 mL浓硫酸，不断搅拌，充分溶解，待用）。取50 uL待测液与250 uL工作液至EP管中，95 ℃水浴10 min，自然冷却至室温，取200 uL至微量石英比色皿中，在620 nm波长下记录测定吸光度值A

可溶性糖含量（mg/g）=CⅹV/Wⅹ1000

淀粉含量（mg/g 鲜重）=0.578ⅹ（A+0.0295）/W

其中：C=标准曲线查得蔗糖浓度（ug/ml），V=样品总体积（ml），W=样品重量（g）

1.2.4.2 可溶性蛋白含量的测定

可溶性蛋白含量的测定参照（贾金蓉等，2017；冯东辉，2019）并略有改进。精确称量黄精种子0.1 g左右各4份，按照质量（g）与提取液体积（mL）为1:5-10的比例，进行冰浴匀浆，4 ℃条件下8000 r/min，离心10 min，取上清，即待测液；同时配制工作液（将试剂A和B按照50:1的比例混合，充分混匀）。将分光光度计预热30 min，调节波长到562 nm，蒸馏水调到“0”作对照，工作液置于60 ℃水浴预热30 min，然后将待测液与工作液混匀后置于60 ℃保温30 min，于1 mL比色皿在562 nm处测定吸光值A，分别记为A空白管、A标准管、A测定，可溶性蛋白含量计算公式如下：

Cpr（mg/g）=0.5×（A测定管-A空白管）/（A标准管-A空白管）/W

其中：W=样品重量（g）

1.2.4.3 ABA、GA3含量测定

GA3和ABA的提取纯化参照罗夫来等（2012）的方法，并略加修改。采用外标法来定量测定不同层积时间黄精种子内源激素（GA3、ABA），依据外标保留时间来确定激素种类（荆泉凯，2018）。色谱柱为Poroshell 120 EC-C18（3.0×150 mm，2.7 μm，Agilent公司），流动相为甲醇-已腈-磷酸缓冲液（20:20:60，pH3.5），流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测波长GA3 208 nm，ABA 245 nm，试验设置3次重复。

1.2.4.4 超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性测定

精确称量黄精种子0.1 g左右各4份，按照质量（g）与提取液体积（mL）为1:5-10的比例，进行冰浴匀浆。4 ℃条件下8000 r/min，离心10 min，取上清，置冰上待测。采用北京Solarbio试剂盒法，分别在层积时间0、30、60、90、120 d时测定其各种酶的含量。

POD（U/g 鲜重）=7133×∆A÷W

CAT（U/g 鲜重）=678ⅹ∆A÷W

SOD活性（U/g鲜重）=11.11ⅹ抑制百分率÷（1-抑制百分率）÷WⅹF

抑制百分率=（∆A空白-∆A测定）÷∆A空白ⅹ100%

其中：A：吸光度，∆A=A2-A1，W：样本鲜重，F：样本稀释倍数

　1.2.5 数据处理

数据处理和作图用Excel完成，用SPSS 22.0软件进行数据方差分析。

2 结果与分析

2.1 种子的生活力、粒径及其萌发

黄精种子的平均生活力为75.50%，而发芽试验所得的发芽率和发芽势均为0，远低于生活力，表明黄精种子具有及其显著的深度休眠现象，结果见表3-1。黄精种子在室外沙藏层积过程中，在前30 d，种子由于吸水膨胀，其种子粒径逐渐增大。随着沙藏层积时间的延长，黄精种子贮藏物质逐渐分解，种壳逐渐软化，其粒径随之变小，至沙藏层积120 d时，黄精种子粒径仅为5.02mm，与对照组相比，黄精种子粒径减小0.15mm，表明黄精种子在沙藏层积过程中，其种子内部进行着复杂的新陈代谢活动，种壳逐渐软化，透水性增强，种子休眠逐渐解除，结果表3-2。

表3-1 不同层积时间黄精种子粒径测定结果

Table 3-1 determination results of seed size ofPolygonatum sibircum Redat different stratification time

表3-2 黄精种子生活力测定及其发芽试验结果

Table 3-2 test results of seed viability and germination ofPolygonatum sibircum Red

2.2 不同层积时间的种子吸水率测定结果

黄精种子在室外沙藏0 d（CK）、30 d（T1）、60 d（T2）、90 d（T3）和120 d（T4）后，5组处理的吸水率变化趋势基本一致；前14 h为种子快速吸水期，吸水率呈直线上升；26 h后吸水速率缓慢上升，并渐趋平衡，其中对照组（CK）和T4在38~50 h吸水率又逐渐上升；50 h后T1、T2和T3处理基本达到吸水饱，但T4组在50 h缓慢上升，CK则逐渐下降。在吸水后期，T1、T2和T3处理的吸水率大致相等，其中T4组与CK组的吸水率变化大体一致。沙藏层积120 d后，黄精种皮逐渐软化，吸水率趋于上升，低于处理组，表明种皮透性制约其种子萌发，黄精种子存在吸水困难，结果见图3-1。

　　图3-1 黄精种子吸水曲线

Fig. 3-1 water absorption curve ofPolygonatum sibircum Redseed

2.3 黄精种子变温层积过程中内部各项物质含量变化

在种子解除休眠过程中，需要足够的能量来满足各种生理反应，这些能量的获得都依靠种子自身的碳水化合物进行代谢，同时种胚在进行代谢过程中需要合成大量的酶来催化各种生理生化反应。在黄精种子在解除休眠的过程中，其种子内部的各项物质含量会发生变化，包括为解除休眠提供能量的可溶性糖、可溶性蛋白和淀粉，各种参与新陈代谢活动的酶以及与种子萌发相关的物质。从这些物质含量变化中，在生理生化层面探究黄精种子休眠解除机理以及最适宜层积天数。

　2.3.1 层积处理对种子中可溶性蛋白、可溶性糖和淀粉含量的影响

由表3-3可以看出，黄精种子在变温层积过程中可溶性蛋白在层积30 d后，其可溶性蛋白含量由最初的33.30 mg/g锐减到6.47 mg/g，在变温层积60 d时可溶性蛋白含量为5.70 mg/g，为最低值，与层积开始前种子比，下降幅度为83%。在层积60~120 d，可溶性蛋白含量随着层积时间的延长，其含量呈现逐渐上升的趋势。总体来看，可溶性蛋白含量呈先下降后上升的趋势。

黄精种子在变温层积过程中可溶性糖、淀粉含量均呈现持续下降的趋势。层积前种子可溶性糖、淀粉的含量分别为10.39 mg/g、10.83mg/g，变温层积120 d时分别下降到2.01 mg/g，2.24 mg/g，为最低值。由表3-3可知，在0 d~30 d时，黄精种子可溶性糖、淀粉含量显著下降，表明变温层积前期，种子内部的可溶性糖和淀粉被消耗利用，在30 d~120 d，种子可溶性糖和淀粉的含量逐渐下降，大分子物质逐渐分解为可溶性糖、可溶性蛋白等小分子物质，为黄精种子打破休眠提供能量。

表3-3 层积过程中黄精种子可溶性糖、可溶性蛋白和淀粉含量的变化

Table 3-3 changes of soluble sugar, soluble protein and starch content inPolygonatum sibircum Redseeds during stratification

注：数据值为“平均值±标准差”，同列不同字母表示差异显著，P＜0.05

Note: the data value is “average value ± standard deviation”, different letters in the same column indicate significant difference (P < 0.05)

2.3.2 激素（GA3、ABA）含量的变化

黄精种子层积过程激素含量变化见表3-4，GA3和ABA在层积过程中变化剧烈，在层积120 d时ABA含量由层积前的79.24 ug·g-1减少到6.61 ug·g-1 ，减少了91%以上，而GA3则增加了5.88倍以上，由4.76 ug·g-1增加到28.01 ug·g-1，使得GA3/ABA比值由层积前的0.06增加到了4.24，为原来的70.67倍。在0 d~60 d，黄精种子内部GA3含量显著上升，而ABA含量则显著下降。整体来看，GA3含量在层积过程中呈现上升趋势，ABA含量则呈下降趋势，表明黄精种子在打破休眠过程中，GA3/ABA比值发生了变化，使种子由休眠状态向休眠释放状态转变。

表3-4 黄精种子层积过程中激素含量的变化

Table 3-4 changes of hormone content during seed stratificatio

注：数据值为“平均值±标准差”，同列不同字母表示差异显著，P＜0.05

Note: the data value is “average value ± standard deviation”, different letters in the same column indicate significant difference (P < 0.05)

　2.3.2 抗氧化酶（SOD、CAT和POD）活性的变化

变温层积过程中SOD、CAT和POD活性的变化如表3-5所示，SOD活性总体随层积时间的延长呈现先下降后上升趋势，层积90 d时SOD活性达到最大值为112.52 U/g.FW，60 d~90 d时间内SOD活性上升幅度最大，90 d~120 d内SOD活性稍有下降，但仍高于起始值。

CAT、POD活性总体随变温层积的时间延长呈整体上升的趋势，在层积120 d时，二者的酶活性达到峰值分别为341.59 U/g.FW，321.02 U/g.FW，其中CAT酶活性在0 d~60 d上升较为平缓，60 d~90 d上升幅度最高；POD活性在0 d~30 d上升幅度最大，在30 d~90 d上升幅度较为平缓。

表3-5 层积过程中黄精种子CAT、POD和SOD酶活性的变化

Table 3-5 changes of cat, pod and SOD enzyme activities in stamen seed during stratification

注：数据值为“平均值±标准差”，同列不同字母表示差异显著，P＜0.05

Note: the data value is “average value ± standard deviation”, different letters in the same column indicate significant difference (P < 0.05)

　3 讨论

黄精种子休眠与萌发过程中常伴随着物质的代谢和能量的转换。在层积过程中（0~60 d），种子呼吸作用加强，内部组织逐渐分化，新陈代谢和能量转换加速，可溶性蛋白、可溶性糖和淀粉被消耗，其含量大幅度下降；层积60~120 d时，随着种子后熟作用的进行和内源抑制物质的变化，可溶性蛋白含量有所上升，可溶性糖、淀粉含量仍持续下降，但下降幅度减慢，为种子休眠解除和萌发提供能量，这段时间内，种子内部碳水化合物的代谢活动明显增强。GA3在促进黄精种子解除休眠过程中发挥着重要的作用，GA/ABA的比值决定种子休眠状态的维持或释放（Kal Graeber et al. 2012）。在层积120 d时，黄精种子内部的GA3含量由层积前的4.76 ug·g-1增加到28.01 ug·g-1，ABA含量则由最初的79.24 ug·g-1减少到6.61 ug·g-1，GA3/ABA比值由层积前的0.06增加到了4.24，随着层积时间的延长，黄精种子内部抑制物质逐渐减少，促进其萌发的GA3含量逐渐增加，使得黄精种子由休眠状态向休眠释放状态转变。成京晋等（2018）研究表明多花黄精种子激素CTK/ABA含量的比值在整个层积过程中逐渐升高，促进了种子解除休眠。许晓岗等（2019）发现在垂珠花种子休眠解除过程中可溶性糖、可溶性蛋白含量在层积前期（0~30 d）逐渐增加；随着层积时间的延长（30~60 d），可溶性糖、可溶性蛋白的含量则显著下降；在层积后期（60~120 d），其含量又迅速增加，为种子打破休眠提供物质基础和能量供应。

POD、CAT和POD活性是反映植物种子活力的重要参考目标，是植物体内重要的酶系统，能够及时清除植物体内因高温、干旱、低温、损伤等逆境胁迫时产生的活性氧和自由基，从而维持细胞的正常代谢（李昭玲等，2015）。本研究中也发现了黄精种子在层积过程中，其抗氧化酶活性发生了不同程度的变化，这是因为在黄精种子解除休眠过程中，需要足够的能量来满足各种生理反应，这些能量的获得都依靠种子自身的碳水化合物进行代谢，同时种胚在进行代谢过程中需要合成大量的酶来催化各种生理生化反应。

　4 结论

本试验研究表明，在变温层积120 d后，黄精种子内部贮藏物质、内源激素含量和抗氧化酶活性均发生了不同程度的变化，黄精种子在萌发过程中，内源抑制物质和胚未成熟，胚率值极低是限制其种子萌发的主要原因。通过室外沙藏层积结合外源试剂处理可有效打破黄精种子休眠。

     参考文献

[1]子酶活性及其萌发的影响[J]. 草原与草坪, 2016, 36(06): 35-38.

[2]费日雯, 孙晓梅, 麻永磊, 等. 芍药种子变温层积过程中的解剖结构观察[J]. 沈阳农业大学学报, 2017, 48(03): 354-359.

[3]雷慧霞, 于营, 刘亚苓, 等. TTC法快速测定芍药种子生活力[J]. 种子, 2019, 38(03): 41-44.

[4]李晓旭, 李家政. 优化蒽酮比色法测定甜玉米中可溶性糖的含量[J]. 保鲜与加工, 2013, 13(04): 24-27.

致 谢

从论文选题、试验方案设计、试验的进度以及完成，并到论文的写作都是导师的悉心指导下完成的，导师为此倾注了的大量心血。在此论文完成之际，谨向我尊敬的导师表达最诚挚的感谢。导师渊博的学识、严谨的治学态度，敏锐的洞察力、精益求精的科学态度、孜孜不倦的敬业精神、诲人不倦的品质修养和宽厚待人的长者风范都深深地感染和激励着我，这些都使我获益匪浅，受益终生。

试验期间，得到师兄诸多指导，论文的修改、完善得到了同级的同学的帮助。还有实验室师弟等人的协助，很开心读研期间有你们一路相伴。同时也在此谨一并致以诚挚的谢意。

感谢各位老师给予的无私帮助和指导，感谢在百忙之中评审我硕士学位论文的各位专家和同学们。本文引用了数位学者的研究文献，如果没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我将难以完成本论文的写作。

最后，谨向所有在生活中与学习上关心和帮助过我的老师、同学和亲友，对你们致以最美好的祝福！谢谢！

黄精种子休眠解除机理及组织培养研究

价格 ¥9.90 发布时间 2023年8月25日

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