抗病毒口服液的质量标准研究

摘要

目的：研究与提升抗病毒口服液的质量标准，并为衡量药品质量提供新的参考数据。方法：采用高效液相色谱法中的标准曲线法去对抗毒口服液成分中（R，S）-告依春和连翘苷进行含量的测定。色谱柱选择Waters BEH C18（2.1mm×100 mm，1.7μm）；流动相的配比为乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脱；检测波长为235 nm；柱温为30℃。结果：测得样品（R，S）-告依春含量为27.94μg/ml，连翘苷含量为93.66μg/ml。（R，S）-告依春在4.86 ～170.27 μg/ml范围内测得峰面积响应值与样品中被测物浓度呈良好的线性关系，拟合度为0.9998，连翘苷在13.75 ～481.16 μg/ml范围内测得峰面积响应值与样品中被测物浓度呈良好的线性关系拟合度为0.9998。（R，S）-告依春平均加样回收率为100.90%，连翘苷的平均加样回收率为100.86%。结论：该方法能够精准、高效、方便快捷地地测定该药品中的成分含量，为建立更全面、更完善的质量标准提供了方法和数据上的参考，以及更好地把控与提升市面上抗病毒口服液的质量，保证了该产药品的有效、稳定、安全、均一。

　关键词:抗病毒口服液；高效液相色谱法；（R，S）-告依春；连翘苷

　一、前言

　　（一）病毒概况与中药抗病毒概况

　　1.病毒的简介

在生物学的概念里，病毒是个体形态只有纳米级别微小的，简单地由外围部分的衣壳和内部的负责传递遗传信息的物质组合构造而成的，寄生在宿主的细胞内并利用其能营养的物质与能量进行复制繁殖的一类非细胞微生物。病毒虽然小，但是某些病毒具有十分强大的传染性以及变异能力，不仅仅能威胁着人类个体的生命安全与健康，对于人类社会文明更是有着毁灭性的打击。例如1918年于西班牙爆发的感染了全球10亿人并导致4000万人死亡的流感病毒、导致3000万美洲土著的死亡和印第安文明衰落的天花病毒以及最近正在肆虐全世界，使得各国经济萧条与医疗系统崩坏的新型冠状病毒。由于病毒特殊的生物学特性以及致病机理，现阶段的人类缺乏能够有效杀死病人体内的病毒的药物。因此，对于抗病毒药物的研发与现有抗病毒药物的质量控制就显得格外重要，这不仅仅保障了人类个体的安全健康，更是对人类文明延续的一把保护伞。

　2.中药抗病毒的概况

病毒主要是通过在宿主体内快速复制繁殖，然后以引起过度炎症和变态反应、损伤或使宿主细胞凋亡、感染引起自身免疫病或免疫抑制等机理致病。目前抗病毒西药按照作用机制可分为核苷类似物、逆转录酶抑制剂、神经氨酸酶抑制剂等，主要通过抑制病毒吸附和侵入、核酸合成、脱壳等过程发挥抗病毒作用[1]。但由于病毒具有伪装性、潜伏性和强大的变异性，许多的抗病毒的西药在抗病毒方面上的疗效不佳，对人体的副作用也是十分巨大，并且一种抗病毒的西药在一般情况下只能用于治疗对抗一种或几种病毒，并不能起到像中药一样广谱抗病毒的作用。因此，中药毒副作用小、依从性好、广谱抗病毒作用的特点便成为了它抗病毒方面独特的优势，具有不可替代的作用，国内外的研究工作者们对于中药在抗病毒作用方面的研究便也变得逐渐重视了起来。在中医的理论基础中，由病毒引起的传染病为“瘟疫”。遵循中医辨证论治的观点，这类疾病常选用清热泻火、清热燥湿等治疗原则，同时以补气血、滋阴生津的药材辅助治疗[2]。近年来，许多研究已经证实几种单味中药有抗流感病毒的作用，并已经研究出其有效成分，例如金银花中的金银花醇、板蓝根提取物、鱼腥草中的挥发油、甘草中的甘草酸、虎杖中的活性成分和黄芩中的黄芩苷均能对甲型流感起抑制或灭活作用。而复方中药中的麻杏石甘汤、毒热平注射液、连花清瘟胶囊、热毒宁注射液、银翘散、疏风宣肺方、大青龙汤、冰香散、玉屏风散、银花平感颗粒等也均对流感病毒有抑制作用。其中，据国内外多家大型权威的研究机构的科学研究表明中我们可得知，连花清瘟胶囊具有广谱的抗病毒功效，它能够对多种病毒起到阻止其复制繁殖或杀灭的作用，例如腺病毒、疱疹病毒、以及各种常见的流感病毒等。最近中科院更是有科学研究表明双黄连口服液与连花清瘟胶囊对新型冠状病毒有抑制作用，这些研究证明了运用中药去抗病毒是可行的，更是科学的，我国应该加大对于传统中药的研究与开发，在继承传统的同时要做到创新发展，使中药在国际的舞台上发挥出自己的光芒。

　（二）药品与药品质量标准

药品与药品质量简介：药品被定义为一种特殊商品，是一种用于预防、治疗、诊断人类的疾病、调节人类的生理机能和细胞代谢活动的化学物质。由于药品质量无论是对个体的健康安全还是社会的稳定繁盛都是至关重要的，因此我国对于药品的管理是十分严格的。质量不过关的药品被分为两类：假药和劣药。每个国家都有自己的药品检验标准，而目前为止我国的药品质量标准则是以2015年出版的《中国药典》为标准。

（三）抗病毒口服液的研究现状

　　1.抗病毒口服液的简介

抗病毒口服液是一款配方中包含板蓝根、广藿香、连翘等九味中药材，在市面上比较常用的纯中药液体制剂。它具有清热祛湿、凉血解毒、抗菌消炎、增强免疫力之功效，临床上主要用于治疗三类疾病。第一种是甲型流感病毒引起的呼吸道感染、风热感冒、流行性感冒等各种疾病，而抗病毒口服液对于发烧、头晕头疼、咳嗽、肌肉酸痛、发力、流鼻涕等症状有十分明显的疗效。第二种是肺炎链球菌或各种病毒引起的肺部炎症、中耳部的炎症，抗病毒口服液能够很大程度上舒缓炎症的症状并抑制病毒和细菌。第三种则是肠道病毒诱发的手足口病，相对于成年人，未成年的儿童免疫系统还没发育成熟，免疫力水平不及成人，因此患此病的几率较高，而抗病毒口服液能够增强儿童的免疫力并抵御病毒的侵害[3,4,5]。在抗病毒口服液九种成分中的主要靠板蓝根与连翘起到清热祛湿、凉血解毒的作用。板蓝根的主要成分主要为多糖、氨基酸、生物碱和硫代葡萄糖等，而抗病毒的活性成分则是其中的生物碱中的吲哚类、喹唑酮类和喹啉类的生物碱。板蓝根是通过多成分多靶点抗病毒机制来对流感病毒起到抑制作用的[6]。此外，板蓝根还具有抑制细菌生长繁殖、增强免疫系统功能、抑制血小板聚集和对抗癌症的功效，因此板蓝根是抗病毒口服液中的君药。而另一种同样起到清热解毒功效的连翘的主要成分则是苯乙醇苷、挥发油、萜类、木质素类、黄酮类和有机酸[7]。具研究表明，连翘能干扰病毒对细胞的吸附及抑制病毒在细胞中的复制以达到抗病毒的功效。除了流感病毒外，连翘对腺病毒以及疱疹病毒、合胞病毒均有抑制作用。

　2.抗病毒口服液的质量标准研究进展

2015年版《中国药典》中收载的抗病毒口服液的质量标准[8]，是对连翘、石菖蒲和知母中的菝葜皂苷元用薄层色谱法作定性鉴别，对广藿香中的百秋李醇用气相色谱法作定性鉴别，以连翘苷的含量作为含量测定项。而由于连翘叶的成本不高，在市场中有发现用连翘叶代替连翘入药的xx行为，现行的质量标准很可能无法对其质量进行把控。再加上上文我们介绍到了抗病毒口服液中起到清热解毒作用的成分主要是连翘与板蓝根，这两种物质的含量的多少可能会影响到抗病毒口服液的质量以及抗病毒的功效。因此，为了建立更全面、更完善的质量标准，以及更好地把控与提升市面上抗病毒口服液的质量，本研究在测定连翘苷含量的基础上，增加了作为君药的板蓝根的含量测定，测定了其抗病毒活性成分（R,S）-告依春的实际含量。

（四）检测方法与原理介绍

　　1.高效液相色谱法简介

高效液相色谱法是一种广泛运用与化工行业、医药学行业、农业种植、食品加工、进出口商品检查、法定检查等领域中的化学成分分离与分析的应用技术，具有分析速度快、感应与响应灵敏、效率高、应用的领域广泛等特点。高效液相色谱仪的每一构成的部件都有其对应的功能，例如输液泵负责输送被测物与流动相，色谱系统用于使被测的样品分离，进样系统是用于将被测物按照一定量精准地注入于色谱柱中，检测器产生响应值来反映此刻流经检测器的物质瞬时的浓度，数据检测与收集系统则是用来记录色谱数据并将数据中的保留时间和检测器响应值形成色谱图。通常来说，色谱柱都由流动相和固定相组成。高效液相色谱法能够将不同成分分离与分析的原理是：由于被测的物质是由多种成分组成的混合物，物质中的各种组成的成分的化学结构和理化性质不同，进样到色谱柱后，拥有不同物理和化学性质的物质产生的力与固定相和流动相产生的力也不同，因此经过流动相的流动，混合物在互不相溶的流动相与固定相中经过不断地分配平衡，最后流出色谱柱的时间也不同从而达到分离和分析的效果。而根据分离原理细分又可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法、分子排阻色谱法、键合建色谱法、亲和色谱法六种[9]。

　2.反相色谱法定量与定性原理

本次研究中运用的则是分配色谱法中的反相色谱法。色谱柱选用的是比较常用的C18柱。在定义上，反相色谱法中的流动相有着更大的极性，而固定相则极性相对之较小，由于相似相溶原理，固定相对于极性大的组分保留能力差，因此滞留在色谱柱中的时间比较短，极性较小的被测组分则被固定相保留，更长时间的滞留在色谱柱中，形成了时间差，于极性的组分后流出色谱柱。也因此其中参数中的保留时间可以作为定性的依据。而高效液相色谱定量的原理则是：当被测组分进样，并流经检测器时，检测器会随之产生一个响应值，这个值是与流经检测器的组分的量成正比例的，这个响应值与时间共同构成色谱图，色谱图根据被测物所含成分的数量和含量比例不同会呈现不同的峰，而色谱图中的我们经常取峰的高度或者面积作为定量的依据。

3.标准曲线法

高效液相色谱中有几种常用的定量方法，由于内标法中的对于内标物的寻找有限制性，比较不便，因此本次研究选择了相对高效、简便、快捷的外标法，也称标准曲线法。这种方法需要我们配置已知浓度但各不相同的标准品，与待测样品使用相同的色谱参数下，进样相同的体积的标准品与待测样品，测得并记录各浓度标准品色谱图中的峰的高度或者面积与浓度进行线性回归，可以得到一条以物质测得的浓度作为横坐标，而纵坐标为峰高或峰面积的标准回归曲线，将待测样品的峰高或峰面积代入标准曲线中，即可反求得待测样品中某成分的浓度并计算含量。

　二、实验材料

　　（一）实验仪器

XWaters超高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司）；MS105电子天平（梅特勒-托利多集团）。

（二）药品与试剂

（R,S）-告依春标准品（批号111753-201706 中国食品药品检定研究院，含量以100%计）；连翘苷标准品（批号110821-201816，中国食品药品检定研究院，含量以95.1%计）；抗病毒口服液(广州香雪制药股份有限公司，批号201806031)。水为超纯水；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

三、实验方法与结果

　　（一）检测方法–超高效液相色谱法

　　1.色谱条件及系统适应性检验

色谱柱为Waters BEH C18（2.1mm×100 mm，1.7μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水，乙腈为流动相A、0.1%磷酸水为流动相B，进行梯度洗脱程序 ( 0 ～0.5min，7%， 0.5～9.3min、7% →18% A， 9.3 ～ 13.1 min、18% →18%A，13.1 ～ 13.9 min、18% →23% A， 13.9 ～ 16.5 min、23% →23% A， 16.5 ～ 21.7 min、23% →40% A，21.7 ～ 24.5 min、40% →40% A，24.5 ～ 26.5 min、40% →7% A，26.5 ～ 31min、7% →7% A，) ； 检测波长 235 nm；柱温为30℃；进样量为1.0μL。在此条件下，理论塔板数按（R，S）告依春峰计算不低于200000，分离度符合要求。理论塔板按连翘苷峰计算不低于5000，分离度符合要求。色谱见图3-1。

　2.对照品溶液的配制

精密称取（R，S）-告依春对照品12.16mg，移置10ml容量瓶中，加入70%甲醇溶解，并将溶液稀释至刻度，盖上瓶盖，上下翻转，摇匀，静置，作为对照品储备液。精密称取连翘苷对照品18.04mg，移置10ml容量瓶中，加入70%甲醇溶解，并将溶液稀释至刻度， 盖上瓶盖，上下翻转，摇匀，静置，作为对照品储备液[10]。取对照品储备液，依次稀释（R，S）-告依春为4.86 μg/ml，24.32μg/ml，60.81μg/ml，97.29μg/ml，121.62μg/ml，170.27μg/ml；连翘苷为13.75μg/ml，68.74μg/ml，171.84μg/ml，274.95μg/ml，343.69μg/ml，481.16 μg/ml。

3.供试品溶液与阴性样品的配制

精密量取抗病毒口服液25 ml，移置分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取6次，每次25ml，合并乙酸乙酯层液后，于水浴上蒸干，残渣用适量的70% 甲醇溶解，移置10mL容量瓶中，加入70% 甲醇定容，即得供试品溶液。按照抗病毒口服液配方，用除连翘的8种药材适量打碎后，于烧杯中用适量的70% 甲醇溶解后，将其移液至10mL量瓶中，加入70% 甲醇定容，即得阴性样品溶液，以上溶液在上机之前，均需要用0.22μm微孔滤膜过滤。

　3.高效液相色谱图

在“3.1.1”项规定的色谱条件下，分别精密量取进阴性样品、供试品溶液、对照品溶液各1μl，进样测定并记录数据，得以下色谱图。

A 空白溶液色谱图B 对照品溶液色谱图C 供试品溶液色谱图D 阴性样品溶液

图3-1超高效液相色谱图(液相色谱品牌：Waters)

　（二）药品质量标准分析方法验证

　　1.仪器精密度试验

在“3.1.1”项规定的参数下， 取“3.1.2”项下配备好的对照品溶液，对其进行6次峰面积测定。最后可以算得两种被测物峰面积的 RSD（具体见表3.1）。试验说明仪器设备的精密度良好。

表3.1 精密度试验结果

　2.准确度试验

称取六份体积为25ml的抗病毒口服液加入（R,S）-告依春储备液0.576ml，连翘苷储备液1.36ml。照样品含量测定项下的方法测定加样回收率， 测得（R,S）-告依春、连翘苷的平均加样回收率如下 (n=6)（具体见表3-2与表3-3）。

表3.2 （R,S）-告依春回收试验结果

表3.3 连翘苷回收试验结果

　3.专属性检验

而按照“3.1.1”项规定的色谱的参数下，分别精密量取进阴性样品、供试品溶液、对照品溶液1μl，进样测定，得到色谱图。据所得色谱图显示：供试品溶液色谱图中有两个明显的目标特征峰，在对照品溶液色谱图中可以找到与之相对应的峰，且保留时间的值相同，且两个目标特征峰与其他峰的分离度符合药典标准；不含连翘苷的阴性样品溶液在同一位置无任何干扰的杂质峰(图3.1) 。结果证明该方法的专属性强，制剂中其他组分无干扰。

　4.线性关系与范围检验

取对照品储备液，依次稀释（R，S）-告依春为4.86 μg/ml，24.32μg/ml，60.81μg/ml，97.29μg/ml，121.62μg/ml，170.27μg/ml；连翘苷为13.75μg/ml，68.74μg/ml，171.84μg/ml，274.95μg/ml，343.69μg/ml，481.16 μg/ml。按照“3.1.1”项规定的色谱参数，分别量取上述的对照品储备液1.0 μL，进样测定，以对照品浓度(C)为横坐标、峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，（见表3-4）可得（R，S）-告依春回归方程为 Y = 3.54e+004 X + 9.24e+004， r=0.9998， 线性范围为4.86 ～170.27 μg/ml；连翘苷回归方程为 Y = 3.57e+003 X + 3.62e+003， r=0.9998， 线性范围为13.75 ～481.16 μg/ml。

表3.4 线性关系检验

　5.稳定性检验

在“3.1.1”色谱条件下，取按照“3.1.3”项方法配制的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、18小时取样进样测定，样品含量测定的 RSD为 0.28%(n=7)，表明样品在18小时内稳定（见表3.5）

表3.5 稳定性检验结果

6.重复性检验

表3.6 （R,S）-告依春重复性检验结果

表3.7 连翘苷重现性检验结果

精密称取样品6份，每份25ml，按“3.1.3”项所述方法配制供试品溶液，在“3.1.1”项规定下的色谱条件下进行含量测定，实验结果：其平均含量 RSD均＜3%，证明了该方法的重复性良好。

　7.耐用性检验

取具同一批的抗病毒口服液按照“3.1.3”项方法将其配制成供试品溶液，用两台来自不同制造商的液相色谱仪分别测定这一批样品的含量。结果显示，两台来自不同制造商的液相色谱仪测得的相对偏差都＜3%，因此可以认为这种方法的耐用性良好。

表3.8 耐用性检验

（三）药品的含量测定–标准曲线法

　　1.绘制标准曲线

取对照品储备液，依次稀释（R，S）-告依春为4.86 μg/ml，24.32μg/ml，60.81μg/ml，97.29μg/ml，121.62μg/ml，170.27μg/ml；连翘苷为13.75μg/ml，68.74μg/ml，171.84μg/ml，274.95μg/ml，343.69μg/ml，481.16 μg/ml。取上述配制好的对照品溶液，分别进样1.0 μL测定， 以上述配制好的浓度(C)作为横坐标、测得的峰面积(A)作为纵坐标进行线性回归分析。

2.标准曲线图与数据分析

得（R，S）-告依春回归方程为 Y = 3.54e+004 X + 9.24e+004，r=0.9998，线性范围为4.86～170.27 μg/ml；连翘苷回归方程为 Y = 3.57e+003 X + 3.62e+003， r=0.9998，线性范围为13.75 ～481.16 μg/ml。

　　图3.2（R，S-告依春）标准曲线

　　图3.3连翘苷标准曲线

　3.含量测定

经孔径为0.22μm的微孔滤膜滤过后，量取1.0 μl的供试品溶液进样测定，按标准曲线法以峰面积计算含量。结果见下表3.9。

表3.9 样品含量测定

　四、实验条件与结果分析

　　（一）实验条件分析

　　1.检测波长的选择

在选定扫描波长时，本来选择了245nm为检测波长[11]。但从两种物质的紫外光谱扫描图可得知（见图4.1与图4.2），在波长为235 nm时，综合考量了分离度，峰的各种参数与峰形，其他物质的干扰相对较少，作为检测波长最为理想。因此选定235nm为检测波长。

　　图4.1 (R,S)-告依春标准品光谱图

　　图4.2 连翘苷标准品光谱图

　2.色谱柱的选择

这次试验采用了Waters BEH C18（2.1mm×100 mm，1.7μm），而据其他文献记载，采用Kromasil 100-5 C18柱（250mm×4.6mm，5μm）、Waters CORTECS C18柱（150mm×4.6mm，2.7μm）、WondaSil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）等也均有不错的效果[12]。

　3.柱温的选择

柱温作为色谱条件中的一种参数，可对于实验的结果产生可大可小的影响，但本方法在柱温条件为25℃、30℃、35℃下的测量值相差不大，3种温度下其RSD在0.03%，对实验结果影响较小。

　（二）结果分析

实验测得平均加样回收率稍大于100%，在一个能接受的范围内，其原因除了不可避免的系统误差外，可能是由于加标的浓度过低，加标的浓度如果比较低的话，本身仪器引起的误差会比较明显。如果加标时配制的标准溶液与绘制标准曲线时浓度有误差，也可能导致平均加样回收率偏高。因此作加样回收实验时加样量的大小尽量与测定的含量值相等，溶液配制时也要注意操作，减少人为的误差。除此以外，两种物质的线性回归曲线的拟合度均在0.9998，拟合程度比较理想。从两种标准品的色谱图来看，两种物质的保留时间，峰形，分离度都比较理想，与抗病毒口服液样品色谱图中能找到对应的峰，说明色谱柱的选择以及色谱参数调教都不错，能得到比较好的结果，使实验能够顺利进行。

　结论

本次实验方法测得该批次的抗病毒口服液的连翘苷含量为93.66μg/ml高于《中华人民共和国药典》中规定的25μg/ml，并成功测得药品中（R，S）-告依春含量为27.94μg/ml，证明该方法能够简便、准确、高效地测定药品中的成分含量，为建立更全面、更完善的质量标准提供了参考依据，以及更好地把控与提升市面上抗病毒口服液的质量，保证了该产药品的有效、稳定、安全、均一。

参考文献

[1]袁媛,李阳,徐赓.中药抗病毒性疫病作用机制研究进展[J].中国动物检疫, 2019, 36(06): 56-61+72

[2]石玉芹.抗病毒口服液的制备及质量控制[J].中国实用医药, 2008,3 (31) : 159- 159

[3]肖友兰, 许重远, 陈茂礼.抗病毒口服液的制备及质量控制[J].第一军医大学学报, 1993, 14 (2) :144-144.

[4]宋敏, 李峰, 李清芳.抗病毒口服液制备工艺及临床疗效评价[J].河南大学学报, 2001, 20 (4) :44-46.

致谢

感谢老师。

抗病毒口服液的质量标准研究

价格 ¥9.90 发布时间 2023年9月27日

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