摘要目的：本文旨在研究干姜大枣饮料酶解超声法提取工艺，并且通过矫味技术掩盖姜辛辣味，研制一款干姜大枣饮料。方法：本文以干姜和大枣为主要材料，优化酶解超声提取方法，通过正交实验确定最优提取工艺，选择壳聚糖作为澄清剂对果汁进行澄清处理，通过优化矫味剂配料比对辛辣味进行掩盖，依据相关饮料质量标准，证实该产品达到相关要求，具备生产价值。结果：最优提取工艺为姜枣比1:4，料液比1:12，酶解温度60℃，超声时间30 min，在此工艺下6-姜酚含量为5.66 mg/g。壳聚糖作为澄清剂对饮料进行澄清处理，，6-姜酚保留率为92.9%，该澄清方法可行有效。最优配料比为甜菊糖苷0.10%，β-环糊精0.24%，冰糖6%，柠檬酸0.10%，辛辣味有效减少，所得饮料酸甜可口。结论：本文以干姜和大枣为原料，优化酶解超声提取方法，确定最优配料比对干姜辛辣味进行矫味，为未来开发功能性饮料及工业化生产提供理论依据。
关键词干姜；大枣；提取工艺；矫味技术
1.研究背景
干姜为姜科植物姜的干燥根茎。冬季采挖，除去须根和泥沙，晒干或低温干燥[1]。干姜具有镇痛抗寒、提神、改善局部血液循环等功效。6-姜酚是所有姜酚中含量最高的成分[2]。6-姜酚有着多种药用价值，例如抗氧化，抗肿瘤，改善局部血循环等[3、4]。干姜作为药食同源的传统食品，在保健食品行业运用广泛。
大枣为鼠李科植物枣的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采收，晒干[5]。大枣可以通过调节肠道菌群来影响肠道健康[6]。大枣有着缓解疲劳，增强抵抗力的功效，大枣多糖能够诱导肿瘤细胞凋亡，可预防肿瘤[7]。大枣作为传统药食兼用资源，受到许多消费者的喜爱。
干姜和大枣作为传统药食兼用资源，二者配伍在传统经方中运用广泛。干姜与大枣相得益彰，干姜有辛散燥烈的缺陷，大枣可以有效防止，大枣有甘缓壅滞的缺点，干姜也可以很好制约[8]。近年来姜枣茶也已成为大众熟知的健康茶饮。姜枣饮料多为家庭自制，一般通过煎煮法提取，有着有效成分提取率低，浑浊，能耗大等局限性；并且姜的辛辣味较重，一些消费者难以接受。本课题旨在研究干姜大枣饮料酶解超声法提取工艺，并且通过矫味技术掩盖姜辛辣味，研制一款干姜大枣饮料，把中国传统饮食疗法开发成更可口、更方便的工业产品，以适应人们对保健饮料的需要。
2.材料与仪器
2.1材料
药材：大枣购自山西省吕梁市临县，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实。干姜采自四川省乐山市沐川县，经南京中医药大学严辉副教授鉴定为姜科姜属植物根枣Zingiber officinal Rosc.的干燥根茎。
试剂：纤维素酶（SPE-017），果胶酶（FDY-2212）购自夏盛生物科技有限公司；β-环糊精、甜菊糖苷、柠檬酸、小苏打购自山东齐鲁生物科技有限公司；单晶冰糖购自广州市中广德盛茶业有限公司；6-姜酚对照品（LOT:M21HB178860）、齐墩果酸对照品（LOT:J24HB174960）、白桦脂酸对照品（LOT:J27GB152745）购自上海源叶生物科技有限公司。
2.2仪器
X025-12DT超声波清洗机（南京先欧仪器制造有限公司），DM0412离心机（大龙兴创实验仪器股份公司），HH-6恒温水浴锅（国华仪器制造有限公司）；Wters2695液相色谱仪（X沃特世）、ZF-20D暗箱式紫外分析仪（上海光豪分析仪器有限公司）TD2002C电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）、ML303精密天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。
3.实验方法
3.1提取方法选择
以6-姜酚含量为考察指标，比较酶解超声法与回流提取法对提取物的影响。
酶解超声法：称量10 g姜粉和30 g大枣置于锥形瓶中，加入400 mL纯水，加入0.4 g纤维素酶和0.4 mL果胶酶并混匀，60℃水浴2 h，超声在频率40 kHz，超声功率500 W条件下超声30 min。
回流法：称量10 g姜粉和30 g大枣置于圆底烧瓶中，加入400 mL纯水，温度调至120℃，加热回流2 h。
3.2工艺流程
选材→预处理→水浴酶解→超声提取→过滤→澄清离心→配料
3.3操作要点
选材：选取无霉变、无杂质、无虫害的干姜片；选取无霉变、无杂质、无虫害、颗粒饱满的大枣。
预处理：干姜利用粉碎机打粉，打粉时注意间隔时间防止过热导致油类物质挥发；大枣留枣核用剪刀剪碎，备用。
水浴酶解：加入原料重量1%的纤维素酶和果胶酶，密封。选取不同料液比和水浴温度，水浴2 h。最后90℃灭酶10 min。
超声提取：将酶解好的样品在频率40 kHz，超声功率500 W条件下超声不同时间。
过滤：待冷却后用纱布过滤，测定体积。
澄清离心：添加配置好的壳聚糖溶液澄清，水浴1 h，在4000 r/min条件下离心15 min，取上清液。
配料：加入不同量的配料，50℃水浴30 min，静置12 h。
3.4酶解超声法提取单因素实验
3.4.1姜枣比例的确定
固定料液比1:10，酶解温度60℃，超声时间30 min，根据传统经方中姜枣配伍比例，选取姜枣比分别为1:1、1:2、1:3、1:4，以6-姜酚含量和感官评分为指标，研究不同姜枣比对提取液品质的影响。
3.4.2料液比例的确定
固定姜枣比1:3，酶解温度60℃，超声时间30 min，选取料液比分别为1:8、1:10、1:12、1:14，以6-姜酚含量和感官评分为指标，研究不同料液比对提取液品质的影响。
3.4.3酶解温度的确定
固定姜枣比1:3，料液比1:10，超声时间30 min，根据纤维素酶和果胶酶的最适pH范围选取酶解温度分别为50℃、55℃、60℃、65℃，以6-姜酚含量和感官评分为指标，研究不同酶解温度对提取液品质的影响。
3.4.4超声时间的确定
固定姜枣比1:3，料液比1:10，酶解温度60℃，选取超声时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min，以6-姜酚含量和感官评分为指标，研究不同超声时间对提取液品质的影响。
3.5酶解超声法提取正交实验
根据单因素实验结果，选取姜枣比、料液比、酶解温度、超声时间四个因素的各三个水平（表1），进行L9（34）正交试验，根据综合评分，综合评分为6-姜酚含量得分和提取感官得分（表2），确定最优提取工艺。
3.6 HPLC含量测定
3.6.1色谱条件
色谱柱：Alltima HP C18 Column色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min,65%～80%A;10～14min,80%～65%A）；检测波长：280 nm;柱温：30℃；流速：1.0 mL/min;进样量10μL。
3.6.2样品制备
3.6.2.1标准品溶液的制备
取适量6-姜酚标准品，精密称定，置于2ml离心管中，用甲醇溶解并涡旋，制成质量浓度分别为3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500μg/mL的标准品溶液，备用。
3.6.2.2供试品溶液的制备
称取相应比例的干姜和大枣，置于锥形瓶中，加入药材干重1%的纤维素酶和果胶酶，加入相应比例的水溶液，利用水浴锅在特定温度下水浴2 h，超声特定时间后纱布过滤，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得到供试品溶液。
3.6.2.3阴性样品溶液的制备
按照3.6.2.2方法制备不含干姜大枣的阴性样品，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得到阴性样品溶液。
3.6.3方法学考察
3.6.3.1专属性试验
精密量取供试品、对照品、阴性样品溶液适量，在3.6.1色谱条件下进样测定。
3.6.3.2线性关系考察
取制备好的6-姜酚标准品溶液，在3.6.1色谱条件下进样测定。以6-姜酚浓度作为横坐标（X,μg/mL），峰面积作为纵坐标（Y,mv）进行回归。
3.6.3.3精密度实验
按3.6.2.2制备方法制备1份供试品溶液，在3.6.1色谱条件下进样测定6次，计算6-姜酚峰面积的相对标准偏差。
3.6.3.4稳定性实验
按3.6.2.2制备方法制备1份供试品溶液，在3.6.1色谱条件下分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算6-姜酚峰面积的相对标准偏差。
3.6.3.5重复性实验
按3.6.2.2制备方法制备6份供试品溶液，在3.6.1色谱条件下进样测定，计算6-姜酚浓度的平均值及相对标准偏差。
3.6.3.6加样回收实验
取干姜大枣适量，加入一定量的6-姜酚标准品，按照3.6.2.2方法制备供试品溶液，按照3.6.1色谱条件下进行测定，计算平均加样回收率及相对标准偏差。
3.7澄清工艺实验
选取1%壳聚糖溶液作为澄清剂。用49mL纯水溶解0.5g柠檬酸，再加入0.5 g壳聚糖，90℃加热30 min，冷却后备用[9]。每20 mL加入1 mL的壳聚糖溶液，25℃保温1 h，在4000 r/min条件下离心15 min，取上清液[10]。测定6-姜酚含量并与原样品对比。
3.8矫味技术研究
选取甜菊糖苷、β-环糊精、冰糖、柠檬酸作为掩盖干姜辛辣味的矫味剂。甜菊糖苷作为天然甜味剂，其甜度约为蔗糖的300倍，甜味持久且不被吸收[11]，使大脑的味觉混乱，从而在某种程度上掩盖了姜的辛辣味道。β-环糊精具有空穴结构，是利用范德华力将产生辛辣味的酚类分子完全或部分包裹在空穴结构的主体分子中，避免了味觉与目标分子之间的直接接触，从而实现了矫味[12]。添加冰糖使饮料风味更加柔和。添加柠檬酸作为酸味剂。设计L9（34）正交试验，四因素分别为甜菊糖苷、β-环糊精、冰糖、柠檬酸（表3），以感官评分为指标（表4），确定最佳配料比。
4.结果分析
4.1方法学考察结果
专属性：根据3.6.3.1中的线性关系试验方法，如图1~3，表明该方法专属性良好。
线性关系：根据3.6.3.2中的线性关系试验方法，以6-姜酚浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标，制作出标准曲线，结果如图4所示。
精确度：根据3.6.3.3中的精密度试验方法，测定结果的相对标准偏差为0.422%，表明该仪器的精确度达到标准。
稳定度：根据3.6.3.4中的稳定性试验方法，计算相对标准偏差为2.200%，表明该溶液具有良好的室温稳定性。
重复性：根据3.6.3.5项下重复性实验方法，计算6-姜酚平均浓度为111.3μg/mL，相对标准偏差为1.962%，说明方法具用较优的重复性。
加样回收：按3.6.3.6项下加样回收实验方法计算得到平均加样回收率为96.31%，RSD为2.192%，说明准确度良好
4.2酶解超声法与回流法对比结果
将酶解超声提取法和回流法提取液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得到供试品溶液，按照3.6.1色谱条件对酶解超声提取法样品和回流法样品进行测定，酶解超声法6-姜酚含量为5.15 mg/g，回流法6-姜酚含量为2.45 mg/g。酶解超声法提取出的溶液较为澄清，回流法提取出的溶液浑浊。结果表明酶解超声法对比回流法更优越。
4.3酶解超声法提取单因素实验结果
4.3.1姜枣比对提取液品质的影响
如图所示（图5），当姜枣比为1:1时，6-姜酚含量最低，姜味与枣味失调，提取液呈现浑浊，提取效果最差。而姜枣比为1:2、1:3、1:4时，6-姜酚的含量较高，外观与1:1相比清澈，口感更加协调。
图5姜枣比对提取液品质影响
4.3.2料液比对提取液品质的影响
如图所示（图6），料液比在1:8~1:12范围内，6-姜酚含量随料液比升高而上市，而溶剂继续增加时，6-姜酚的含量略微下降。溶剂占比增加会使杂质的溶出，同时降低酶的浓度，酶与底物更难接触[13]，料液比高也会导致能源的浪费和提取效率下降[14]。在原料与液体比例为1:8的情况下，产品的感观分数偏低，产品呈现混浊、生姜味过重等特点；在1:8~1:12随着料液比例的增大，产品的感观评分也随之升高；在原料与液体的比例为1∶14的情况下，风味降低，评分降低。
图6料液比比对提取液品质影响
4.3.3酶解温度对提取液品质的影响
如图所示（图7），温度为60度时6-姜酚含量达到最大值，过高或过低的温度都会导致含量贬低。温度低时，偏离最适温度范围，酶活力低不能更好地与底物结合导致含量过低。温度高时，偏离最适温度范围，酶活力下降，温度过高也会导致6-姜酚转化为6-姜烯酚[15]，从而也会导致含量降低。酶解与感官评分成正比，随着提取温度增加，有利于干姜和大枣的风味物质的溶出。
图7酶解温度对提取液品质影响
4.3.4超声时间对提取液品质的影响
如图所示（图8），6-姜酚含量在超声时间40分钟时达到最高。40分钟前提取率与超声时间成正比，随超声时间增加而提高。40分钟后，6-姜酚含量下降。超声具有机械效应，短时间内有利于姜酚的溶出，长时间的作用会破坏姜酚而使姜酚有损失[16]。超声时间与感官评分成正比，随着超声时间增加，干姜和大枣的风味物质可以更好的溶出。
图8超声时间对提取液品质影响
4.4酶解超声法提取正交实验结果
根据极差R大小可知（表5），影响综合评分最大的因素是B，其次是A，影响综合得分最小的因素是C，其影响综合得分由大到小顺序为料水比>姜枣比>超声时间>酶解温度。饮料综合评分最高的提取工艺为A3B3C2D1，即姜枣比1:4，料液比1:12，酶解温度60℃，超声时间30 min。在此工艺条件下，6-姜酚的含量为5.66 mg/g，感官评分80.6。
4.5澄清工艺实验结果
对澄清样品和未澄清样品进行外观对比，如图9所示，结果表明澄清后的样品澄清度明显高于未澄清的样品。测定澄清前后6-姜酚含量变化，澄清前6-姜酚浓度为0.14 mg/mL，澄清后6-姜酚浓度为0.13 mg/mL，6-姜酚保留率为92.9%，表明该澄清方法可行且有效。
4.6矫味技术正交实验
根据极差R大小可知（表6），影响感官评分最大的因素是B，其次是D，影响最小的是C，其影响感官评分由大到小排序为β-环糊精>柠檬酸>甜菊糖苷>冰糖。饮料最优配料比的组合是A2B3C2D1，即甜菊糖苷0.10%，β-环糊精0.24%，冰糖6%，柠檬酸0.10%。在此条件下，饮料姜味柔和不辛辣，枣味酸甜可口，色泽明亮，组织状态稳定均一，久置无分层、沉淀现象，无杂质。
5.干姜大枣质量标准建立
5.1 HPLC含量测定
平行称取3份干姜、大枣按照最优提取工艺提取，澄清后按照最优配料比配料，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，按照3.6.1色谱条件测得6-姜酚浓度平均值为0.13 mg/mL，RSD为1.86%。结果表明该提取方法稳定，工艺可行，可将6-姜酚浓度作为监测成分，用于质量控制。
5.2薄层色谱鉴定
5.2.1大枣的鉴别
取浓缩后样品5 mL，用15 mL乙酸乙酯萃取，静置20 min后萃取上清液，重复三次。浓缩至2 mL，作为供试品溶液。按照《中华人民共和国药典》的方法制备大枣对照药材。取缺大枣样品5 mL加入15 mL乙酸乙酯萃取，静置20 min，待分层后取上清液，重复三次。浓缩至2 mL，作为缺大枣阴性样品溶液。再取齐墩果酸对照品、白桦脂酸对照品，加乙醇分别制成每1 ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液。将各样品溶液条带状分别点于同一硅胶薄层板上，供试品溶液和对照药材溶液点样量10μL，对照品溶液4μL，阴性样品溶液6μL，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（14∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯（365 nm）下检视[5]。与大枣对照药材溶液、缺大枣阴性样品溶液、齐墩果酸对照品及白桦脂酸对照品比较（图9），3份干姜供试品溶液在相同的比移（RF=0.54、0.58）位上都出现了两个的荧光点，齐墩果酸对照品及白桦脂酸对照品在对应位置出现荧光点，而阴性样品溶液的相同位置没有出现同样的荧光点。
图10大枣薄层鉴别结果
注：1～3干姜供试品溶液；4大枣对照药材溶液；5缺大枣阴性样品溶液；6齐墩果酸对照品；7白桦脂酸对照品
5.2.2干姜的鉴别
取浓缩后饮料5 mL，用15 mL乙酸乙酯萃取，静置20 min后萃取上清液，重复三次。浓缩至2 mL，作为供试品溶液。按照《中华人民共和国药典》的方法制备干姜对照药材。取缺干姜饮料5 mL加入15 mL乙酸乙酯萃取，静置20 min，待分层后取上清液，重复三次。浓缩至2 mL，作为缺干姜阴性样品溶液。精密称定6-姜酚对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液和对照药材溶液6μL，对照品溶液4μL，阴性样品溶液3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-三氯甲烷-乙酸乙酯（2∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰[1]，置于紫外光灯（365 nm）下检视。与干姜对照药材、缺干姜阴性药材溶液和6-姜酚对照品溶液比较（图10），3份干姜供试品溶液与6-姜酚对照品溶液在相同的位置（RF=0.65）处出现了同样的褐色斑点，而阴性对照溶液在这一位置处没有出现同样的颜色斑点。
图11干姜薄层鉴别结果
注：1～3大枣供试品溶液；4干姜对照药材溶液；5缺干姜阴性药材溶液；6 6-姜酚对照品溶液
6.总结与讨论
本文以干姜和大枣为原料，优化酶解超声提取方法，通过正交实验确定最优提取工艺，即姜枣比1:4，料液比1:12，酶解温度60℃，超声时间30 min，在此工艺下6-姜酚含量为5.66 mg/g。然后选择壳聚糖作为澄清剂对果汁进行澄清处理，得到澄清饮料，6-姜酚保留率为92.9%，该澄清方法可行有效。最后通过优化矫味剂配料比对辛辣味进行掩盖，最优配料比为甜菊糖苷0.10%，β-环糊精0.24%，冰糖6%，柠檬酸0.10%。依据相关饮料质量标准，证实该产品达到相关要求，具备生产价值。
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致谢
本论文是在老师的指导下完成的，老师渊博的知识和忘我的工作让我心怀崇敬。由衷感谢老师对我实验开展的帮助和论文写作的指导！同时由衷感谢师姐对我激励和关怀，以及在我实验遇到困难时给予帮助，在论文撰写的过程中，师姐帮我指出很多问题也为我提供了许多宝贵的意见，由衷的表示感谢！同时也感谢师姐和其他叫不出名字的师兄师姐对我仪器使用时的指导和帮助！感谢xxxx等一起在中药资源产业化过程协同创新中心实习同学，感谢你们的陪伴以及相互鼓励相互学习共同进步！感谢我的室友xxx四年生活的陪伴，祝我们有着美好未来。感谢中药资源产业化过程协同创新中心给我提供宝贵的平台开展实验，虽然只有三个多月的实习时间，但这里的的人、事我会永远不会忘记。最后感谢母校，四年的大学时光让我收获，让我成长，我会带着母校的殷切希望砥砺奋进。
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