前言
血细胞存在于血液中,随着血液的流动遍及全身。以哺乳动物为例，扮演了主要的免疫角色的是血细胞中的白细胞【1】。在病菌入侵到人体内时白细胞能迅速的穿过毛细血管壁，聚集到病菌入侵部位，将病菌包围并吞噬。要从根本上解决疾病对动物的危害，我们需要对不同种类生物的免疫机制进行深入研究，因此在生物免疫的科研探究中，血细胞的研究起着非常重要的作用，但目前对很多类生物的血细胞的分类及其功能研究仍然不是很充分，不同研究者之间尚未达成共识，这对地球上生物免疫学的研究造成了很大的障碍【2-4】。
几个世界以来，国内外的研究人员运用了不同的方法进行研究，分别应用组织化学、光镜、电镜、、物理染色、免疫学单克隆抗体等技术，对血细胞形态、结构进行观察分类，观察细胞内各种组分的分子组成及功能。
血细胞染色法操作简单有效，在动物的生理和病理研究中意义非凡,特别是在鉴定血液及细胞免疫相关的疾病的时候意义重大，最基本的诊断手段至今仍是血细胞染色观察。因此在细胞的形态观察和分类时，血细胞涂片染色效果是否明显突出在细胞的形态观察和分类中占有决定性的意义【5-7】。目前为止，在解决人类和其他生物的疾病方面，我们主要通过对血细胞染色方法进行研究，从而进一步分析免疫反应在血细胞中的体现。
本文主要探讨了三种血细胞染色方法，用显微镜观察三种方法下血细胞各自的不同染色效果，进而了解它们对细胞分类影响。
1材料与方法
1.1实验材料
血液，载玻片
1.2主要仪器
培养皿保温箱
分析检测的仪器灭菌箱
台式离心机血细胞计数板
显微镜
1.3试剂及药品
姬姆氏色素(BS)钟楼区北港海拓实验仪器经营部
瑞氏色素(BS)上海展云化工有限公司
磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛连云港市德邦精细化工有限公司
乙醇、二甲苯、盐酸、氢氧化钠连云港市德邦精细化工有限公司
1.4主要试剂的配制
（1）Giemsa染液的配制
用药匙取姬姆氏色素(BS)0.5g放入干燥的研钵中，然后在研钵内滴入入少量的甘油，开始研磨到混合物里无颗粒状时停止，然后把剩余的甘油全部倒入研钵，混合均匀后放温箱内，将温度调至56℃保温2小时，保温结束拿出混合物并把33ml的甲醇全部倒入搅拌均匀，最后把配制好的染液放入棕色瓶内密封保存，棕色瓶最好在0~4℃的环境内保存【8-11】。
（2）Wright染液的配制
用药匙盛出0.1g瑞特色素(BS)放入已清洁干净并保持干燥的研钵中，甲醇滴入少量，开始进行充分研磨直到染料完全溶解，溶解的染料直接倒入棕色试剂瓶中，未溶解的继续加入少量甲醇进行研磨，最后染料完全溶解，60ml的甲醇全部也完全溶解其中。染液配好全部装入棕色瓶，室温保存，一周方可拿出使用。新配制的染液染色效果较差，我们应当适当的延长放置时间，时间越久染色效果也更加明显。因为甲醇会挥发或者氧化成甲酸，如果需要长时间放置需要进行密封。另外将中性甘油2～3ml加入到染液中，既可以阻止甲醛挥发还可以增强细胞着色效果。
（3）Giemsa-Wright染液的配制
Giemsa-Wright染液的配制和前两种染液的配制一样，用药匙取出姬姆氏色素(BS)、瑞氏色素(BS)各1g直接放到已经清洗干净保持干燥的研钵中，慢慢地把10ml甘油倒入研钵内，开始进行研磨，当染料完全溶解时把500ml甲醛倒入混合均匀，最后要把配制好的染液密封保存棕色瓶内。
（4）Sorensen缓冲液的配制
用药匙称取磷酸二氢钾（无水）1 g，磷酸氢二钠（无水）1 g；加入1000 ml蒸馏水使其溶解。配好后磷酸盐缓冲溶液应校正PH值，其范围在PH6.4～7.0即可，后塞紧瓶口备用。
2实验方法
2.1血涂片的制作
首先我们需要用脱脂棉蘸取75%的酒精涂抹在将要取血的部位（如指尖），进行消毒；接着用已消毒的针尖刺破指尖的皮肤；挤出一滴血,滴在已消毒的载玻片上；取另外一片消毒过的载玻片，推动玻片自血滴左侧向右移动，保持两片成30~45度夹角；当两片之间出现均匀的血滴之后,推片继续向左慢慢地推移，直到推出均匀的血膜【12】。
2.2 Giemsa染色
染色方法:我们在血涂片干燥之后开始染色，血涂片在湿润的环境中进行，首先将其放入湿盒，滴入4～6滴Giemsa染色液完全覆盖血膜，保持染色35分钟后滴入8～12滴的Sorensen缓冲液，染色25分钟，用自来水冲洗晾干，密封存储。
2.3 Wright染色
染色方法:待血涂片干燥之后将其放入湿盒，滴入适量Wright染色液至将涂片完全被覆盖，保持2分钟后加入等量的Sorensen缓冲液，染色3分钟，用自来水冲洗晾干，密封存储。
2.4 Giemsa-Wright染色
染色方法:待血涂片干燥之后将其放入湿盒，滴加Giemsa-Wright染色液4～5滴，染色3分钟，然后加Sorensen缓冲液2～3倍混合均匀，静止15分钟后用自来水冲洗晾干，密封存储。
2.5注意事项
（1）PH对细胞染色有影响。血细胞中的蛋白性质主要是两性电解质，因此血细胞蛋白所带电荷与PH值大小息息相关。因此我们在实验中药使用清洁中性的载玻片，缓冲液PH值6.4～7.0之间，另外需要用流水冲洗玻片，我们直接使用自来水实验【13】。
（2）新作好的血膜未干透染色时容易出现血膜脱落，因此等干燥之后再进行染色。
（3）染液浓度、染色温度以及细胞数量都会影响染色时间。
（4）冲洗时要用流水冲洗去染液，若直接倒掉染液容易造成防染料沉淀在血膜上。
（5）当有染料颗粒沉积在血膜上时滴入少量甲醇溶解，并且马上用水冲洗掉，以免发生脱色。
（6）假如染色效果过于不明显，可以进行复染。复染时不能先加染液，要先加缓冲液后加染液，或直接加染液与缓冲液的混合液。
（7）假如染色过深，可用水冲洗或者甲醇脱色。
（8）当染色偏酸、偏碱时更换缓冲液重染。
3结果
3.1 Giemsa染色
用显微镜观察血涂片可以看到，呈粉红色的是红细胞，它们位于厚薄均匀处有碟状感。白细胞浆中颗粒清楚，色彩清晰。染成紫红色或蓝紫色的是细胞核，结构清楚。粒细胞的细胞核和细胞本身的界限明确，但细胞质中的颗粒染色效果分辨的不清晰【13-16】。
3.2 Wright染色
观察显微镜下已染色好的血涂片，可直观看到血膜染成淡紫红色，仔细观察可以看到呈粉红色的是红细胞，它们位于厚薄均匀处有碟状感。白细胞浆中颗粒清楚，色彩清晰。细胞核染色紫红色，核染色质结构清楚。该结果与Giemsa滴染相似，粒细胞细胞质中的颗粒着色较好，但细胞核不如Giemsa滴染时清晰，细胞质界限不是十分清晰，有时看不到细胞质界限【17】。
3.3 Giemsa-Wright染色
显微镜下观察可以发现，呈桔红色的是红细胞。Giemsa-Wright滴染时，染色时间介于Giemsa和Wright染色之间，染色效果优于前两者，其结果是粒细胞的细胞核和细胞质分均着色较好，细胞质中的颗粒成分和细胞界限均清洗。
4探究不同条件下三种染色方法的效果
4.1不同染色条件下Giemsa的染色效果
采用Giemsa染液,在不同染液用量、染色时间、分色方式和分色时间等条件下,对血涂片进行染色。通过显微镜观察，部分结果见表1。在实验进程中我们还对比了不同温度条件下姬姆萨染液的结果,发现38℃条件下的染色效果比25℃条件下的效果好。38℃温度条件下尤以下四种情况染色效果为佳,可以对血细胞的种类进行明确区分:①染色20min,分色1min；②染色10min，水洗分色；珍适量染料染20～30min；④染色20～30min，50%乙醇分色5s。
4.2不同条件下Wright染液的染色效果
Wright染液和缓冲液的比例改为1:2，分别对染色时间，分色方式，分色时间等做出改变,以相同的方法对血涂片进行染色,并用显微镜进行染色效果观察,部分结果见表2。由表2可知,25℃条件下染色15min后,用95%或者50%的乙醇分色5s时，Wright染液染色效果比较好。
4.3不同条件下Giemsa-Wright混合染液染色效果
比较采用Giemsa-Wright混合染液,通过改变染色时间、染色温度,分色方式和分色时间、染液用量和浓度等染色条件,对血涂片进行染色。显微镜下观察染色效果。部分结果见表3，由表3可知,25℃下混合染液在以下三种染色条件下可以取得较好的染色效果:①混合染液:缓冲液=l:2，25℃染10min水洗；②适量混合染液25℃染10min,水洗；③25℃染15min，50%乙醇洗5s。
5讨论
在研究动物免疫的科研中，对血细胞形态结构的观察是其中比较重要的一个环节,观察的结果直接受血细胞染色的效果影响。通常情况下,染液浓度、室温及细胞数量都会影响染色时间,当染液较浓、室温偏低而细胞数量有较多时，需要的染色时间就加长。因此要得到理想的血涂片,必须灵活掌握染色技巧,也可以用低倍镜在冲洗前提前观察一下有核细胞染色情况,查看核着色是否分明【18】。
5.1 Giemsa染色法优点是从对血涂片的染色结果可以看到，细胞核染色清晰，细胞界限分明。在染色过程中，Giemsa染液不会出现挥发的情况，不易在染色过程中污染血涂片，可以比较容易地控制染色过程，染液pH值对染色效果影响极大，该血细胞的染色在pH=6.8时染色效果最好；Giemsa氏染色法的缺点是粒细胞细胞质中的颗粒染色效果不清晰同时染色时间比较长。结论：Giemsa氏染色法对粒细胞中的颗粒显示效果很差在需要血涂片染色时不建议使用。
5.2 Wright染色法优点：从对血涂片的染色结果可以观察到，粒细胞质中的颗粒染色效果十分清晰而且染色时间短，可以很快出现染色结果；缺点是相较于Giemsa氏染色法对细胞核的染色效果不清晰，细胞界限不明确。另外Wright染色液中没有加入甘油，染液容易挥发，在染色过程中血涂片较易受到污染，因此染色过程不易掌握易发生意外。由于该方法所使用的试剂配制简单，染色时间短等特点，可以用于血细胞的染色和血细胞类型的辨别，尤其可以在实验中，用于血细胞的辨别。
5.3 Wright-Giemsa混合法染色的优点：通过对血涂片的染色结果观察看到，使用Wright-Giemsa混合法染色后，粒细胞的细胞核和细胞质中的颗粒着色明显，细胞界限明确，染色效果集合了两种染液的优点。缺点：该混合染液容易挥发，且很快会发生变性和污染。因此，在使用Wright-Giemsa染液时要注意，要在湿盒中进行，保持湿润；滴染过程中多加入几滴染液；在血涂片染色结束后马上用流水冲洗，可通过调节自来水的水压，用自来水冲去染料沉渣减少污染。该法不仅可以广泛用于血细胞的染色和血细胞的类型识别，也可以在实验中广泛使用，是广泛研究血细胞的一个较好的染色方法。
Wright-Giemsa混合染色法的染色效果突出，主要原因是关于粒细胞的特异性颗粒的着色效果Wright染液比Giemsa染色法的要突出,但是，Giemsa染液对细胞核的着色结果较为明显,可以看到清晰的结构显示,同时胞浆和特异性颗粒则染色不是很好。因此,在通常的血细胞染色实验中可以采用Wright-Giemsa混合染色法，兼并两种染液的优点使血涂片染色效果更为理想。
结论
通过本文的实验和观察，我们得到了以下结论：Giemsa染液染色时间最长，对细胞质中的颗粒染色效果较差，但同时细胞核染色效果突出，细胞质界限明显；②Wright染液染色时间最短，细胞核和细胞质中颗粒成分染色效果也很突出，但细胞质的界限不分明；Giemsa-Wright混合染色结合两种染液的优点，染色时间在其他两种方法中间，细胞核和细胞质中的颗粒物质染色效果较好，细胞界限分明。经分析，Giemsa-Wright混合染色法可用于血细胞中的广泛研究【19-20】。通过实验还发现染液的浓度在血细胞的着色上影响巨大，在分色的时候用缓冲液分色的效果较差,细胞类型区分不鲜明，用体积分数95%的乙醇脱色效果太强,容易造成过度脱色；换做体积分数50%乙醇来分色的话,其脱色效果适中,可以作为分色首选。
参考文献
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窗体顶端
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致谢
在本论文的写作过程中，我的导师对我倾注了大量的心血，从选题到开题报告，从写作提纲，到一遍又一遍地指出稿中的具体问题，严格把关，循循善诱，在此我表示衷心感谢。同时我还要感谢在我学习期间给我极大关心和支持的各位老师以及关心我的同学和朋友。
写作毕业论文是一次再系统学习的过程，毕业论文的完成，同样也意味着新的学习生活的开始。此外，本文最终得以顺利完成，也是与医学检验系其他老师的帮助分不开的，虽然他们没有直接参与我的论文指导，但在开题时也给我提供了不少的意见，提出了一系列可行性的建议，在此向他们表示深深的感谢!最后要感谢的是我的父母，他们培养了我对医学知识的浓厚的兴趣，不遗余力的支持我在医学院的学习，坚定了我对医学的敬畏和信仰，而且也为我能够顺利的完成毕业论文提供了巨大的支持与帮助。在未来的日子里，我会更加努力的学习和工作，不辜负父母对我的殷殷期望!我一定会好好孝敬和报答他们!
综述
血细胞染色方法
摘要:血细胞,也被称为血细胞,是存在于血液中的细胞,并在血液流动的全身流动。在哺乳动物中,血细胞主要包含以下三个部分:红细胞:主要功能是输送氧气。白细胞:主要起免疫作用。当细菌侵入人体时,白细胞穿过毛细血管壁,集中在细菌的侵入部位。他们包围细菌,然后吞噬它们。血小板在止血中起重要作用。血细胞约占血容量的45%,包括红细胞、白细胞和血小板。在正常生理条件下,血细胞和血小板具有一定的形态和相对稳定的数量。
关键词:红细胞,白细胞,血小板,染色方法
几个世界以来,国内外的研究人员运用了不同的方法进行研究,分别应用组织化学、光镜、电镜、、物理染色、免疫学单克隆抗体等技术,观察和分类血细胞的形态和结构,观察各组细胞的分子组成和功能。
血细胞染色法操作简单有效,在动物的生理和病理研究中意义非凡,特别是在鉴定血液及细胞免疫相关的疾病的时候意义重大,最基本的诊断手段至今仍是血细胞染色观察。因此在细胞的形态观察和分类时,血细胞涂片染色效果是否明显突出在细胞的形态观察和分类中占有决定性的意义【5-7】。目前为止,在解决人类和其他生物的疾病方面,我们主要通过对血细胞染色方法进行研究,从而进一步分析免疫反应在血细胞中的体现。
红血细胞(红细胞,红细胞)7~直径8.5米,双凹圆盘状,中央薄(1米),边缘厚(2米),中央染色在外周血涂片标本浅和深。扫描电镜能清晰显示红细胞形态特征。这种红细胞的形态使其具有较大的表面积(约140平方米),最大限度地适应其功能–携带O2和CO2。新鲜的红细胞是黄绿的,大量的红细胞使血液呈猩红色,而一些红细胞经常堆积成一串红细胞,称红细胞索。
White(白细胞、血液、细胞)是一种无色、有核的球形细胞,体积大于红细胞,具有变形能力,具有防御和免疫功能。成人白细胞正常值为4000~10000/亩1。男女之间无明显差异。婴儿略高于成人。血液中白细胞的价值受多种生理因素的影响,如劳动、运动、饮食和妇女经期等,均略有增加。在疾病状态下,白细胞总数和各种白细胞的百分比可以改变。光镜下,根据白细胞的细胞质是否有特殊的颗粒,可分为两组:颗粒白细胞和无颗粒白细胞。粒细胞分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞,视颗粒颜色。白细胞、单核细胞和淋巴细胞有两种。当病毒存在时,白细胞在抵抗病毒中起作用
血小板(血液、血小板)–的红骨髓巨核细胞胞质脱落,本身并不是一个细胞。正常值为10万~30/亩10000/1。它是在骨髓中巨核细胞胞浆中的一小部分。它没有细胞核,有完整的细胞膜。血小板体积小,直径2~4厘米,双凸盘状。当它受到机械或化学的刺激时,会突出形状,形状不规则。在血液涂片中,血小板通常呈多角形,聚集在一起。血小板的中央部分有蓝紫色的颗粒,称颗粒区,及周边地区是同质的,淡蓝色,称为明区。电镜下,血小板有冰膜的表面上和在细胞没有细胞核,但细胞器如线粒体、微管、微丝和微管,以及血小板颗粒和糖原颗粒。
Giemsa染色方法:我们在血涂片干燥之后开始染色,血涂片在湿润的环境中进行,首先将其放入湿盒,滴入4~6滴Giemsa染色液完全覆盖血膜,保持染色35分钟后滴入8~12滴入索伦森缓冲液,染色25分钟,用自来水冲洗并擦干,密封存储。
Wright染色方法:待血涂片干燥之后将其放入湿盒,滴入适量Wright染色液至将涂片完全被覆盖,保持2分钟后加入等量索伦森缓冲液,染色3分钟,用自来水冲洗并擦干,密封存储。
Giemsa-Wright染色方法:待在血涂片干燥后,放在湿盒和4~滴5滴姬姆萨Wright染色,染色3分钟,然后加Sorensen缓冲液2~3倍混合均匀,休息15分钟,用自来水冲洗,干燥,密封,储存。
小结:Giemsa染色法、Wright染色法和Giemsa-Wright混合染色三种染色方法均能有效的协助甄别血细胞,Giemsa-Wright混合染色方法相较于前两种方法染色效果更为明显,值得广泛应用。
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