ABA信号转导家族基因鉴定与功能分析

摘要

ABA是一种天然的、植物自身合成的关键激素，广泛存在于高等植物的各组织器官中，参与调控植物生长发育的各个方面，包括：种子的生长休眠与发芽，幼苗的生长，叶片的衰老等。同时，ABA也是一种抗胁迫激素，响应各种生物和非生物胁迫，如：干旱，盐碱，低温冷害等。

茶树作为我国重要的园艺作物之一，是多年生喜温喜湿常绿植物，耐旱性较弱。干旱缺水对茶树的正常生长及茶叶产量、品质有严重的影响。且随着世界气候的恶劣情况，这一问题愈发严重。因此培育耐旱茶树品种是应对干旱胁迫最主要的措施之一。但茶树抗逆机制的研究还处于初步阶段，对于茶树抗逆相关基因的了解和认识还在初步阶段。而ABA作为一种抗胁迫激素，被运用到提高植物抵御逆境胁迫的能力上来。本论文通过研究茶树ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族的表达模式、在逆境胁迫中的表达模式、相互之间的互作关系来更好的诠释和解析茶树ABA 信号转导通路，为寻找和改造抗逆新品种，以提高作物产量提供理论依据，具有重要的理论与实践意义。

本文基于茶树基因组数据库TPIA，对茶树中的ABA受体及信号转导家族，PYR/PYL/RCAR基因家族，PP2CA基因家族，SnRK2基因家族成员进行了鉴定与分析，其中发现有3个CsPYL基因（CsPYL11-13）有缺失，被认为是假基因。分析了CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个基因家族的基本功能以及在不同组织器官、多种非生物胁迫（干旱、盐碱、低温冷害）下的表达模式；分析了干旱处理下，不同茶树品种CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族的表达模式；分析了外源添加ABA后的表达模式并根据此结果建立茶树ABA信号转导路线图，并对部分基因进行了克隆，利用酵母双杂交技术检测CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s家族蛋白的互作情况，初步探究了ABA信号在茶树内的转导过程。主要研究结果如下：

利用茶树基因组数据库，鉴定出了15个茶树CsPYLs基因，8个茶树PP2CAs基因，8个茶树SnRK2s基因，分别命名为CsPYL 1-15，CsPP2CA1-8，CsSnRK2.1-8。根据基因结构与系统进化树分析，CsPYLs划分为3组，CsPP2CAs划分为2组，CsSnRK2s划分为3组。三个家族在不同组织器官均有表达，且表现出差异性。CsPYLs家族中CsPYL4在成熟叶及根茎中表达量高，CsPYL5在嫩叶及花中表达量较高，而CsPYL9在种子中表达量较高；CsPYL1-2,14-15在所有组织器官中表达量都低。CsPP2CAs家族中，CsPP2CA3在根中表达量较高，CsPP2CA8在地上部位表达量较高，CsPP2CA4在所有组织器官中表达量都较高；CsSnRK2s家族中，CsSnRK2.3在所有组织器官中表达量都较高，CsSnRK2.8在叶部表达量较高。CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个家族对干旱、盐碱和低温胁迫的响应具有多样性。在干旱胁迫下，CsPYL家族的基因表达呈现不同的响应模式，其中CsPYL10，15呈现明显上调表达，CsPYL14明显下调表达；CsPP2CA家族整体均为上调表达，其中CsPP2CA1响应最为强烈；CsSnRK2家族则大多为下调表达。在盐碱胁迫下，三个家族均呈现不同的响应模式，CsPYL1,4-5,15呈现明显上调表达，CsPYL3、14明显下调表达；CsPP2CA家族只有CsPP2CA6呈现显著的下调表达，其他家族成员均不显著；CsSnRK2.5,6,8表现为下调表达。在低温胁迫下，CsPYL1呈现显著的上调表达，CsPYL4,5为下调表达；CsPP2CA5,6呈现上调表达，其余不显著；CsSnRK2家族均不显著。干旱处理下，不同品种茶树的ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因表达呈现不同的响应模式。其中干旱敏感型品种“福云6号”中，CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个家族的响应程度明显高于干旱耐受型品种“中茶108”。说明不同茶树品种的耐旱分子机理呈现差异性。ABA处理下， CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s表达呈现差异性，不同组织部位的表达也呈现不同表达模式。将ABA处理下，根和叶两个组织器官在0h，0.5h，2h，6h，24h五个时间点的表达量进行相关性分析，根据相关性分析结果，绘制出三条茶树ABA依赖型信号转导途径。将筛选出的部分CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因分别构建酵母双杂交诱饵载体pGADT7和捕获载体pGBKT7，共转化酵母Y2H Gold菌株。酵母双杂交结果证明绘制出的茶树ABA依赖型信号转导途径具有可参考性。综上所述，本研究通过对CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个基因家族的鉴定及生物学功能分析为探究ABA信号分子在茶树内信号传导奠定了一定的基础；分析在干旱处理下，不同茶树品种ABA信号转导家族的调节机制，为茶树抗旱的研究提供新的思路，有利于进一步阐明茶树抗旱机制。

关键词：ABA；CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s；调节机制；抗旱；酵母双杂

文献综述

1.1.1 脱落酸

1.1.1.1脱落酸的发现

脱落酸（abscisic acid, ABA）是一种由植物自己本身合成的天然的倍半萜类激素，因为其能够使植物叶片从枝干自然脱落而得名。ABA分布在高等植物的各个组织部位，特别是在即将面临休眠状态和将要掉落的器官中，植物一旦感知受到外界恶劣环境的威胁，体内ABA的含量就会立刻上升[1]。ABA在植株生长发育的每个过程均发挥功能，包括种子的发芽、睡眠，幼株的生长[2]，植物的衰败及叶片的掉落[3]。此外，它还是抗胁迫激素之一，参与调控植物受到的各种胁迫[4]。脱落酸，关键的植物激素之一，很早就被科学家们关注，1961年，W.C.Liu从成熟的棉铃中得到了一种能够促进植物体脱落的透明物质，并将这种透明物质称为脱落素（abscisin）[4]。1963年， K.Ohkuma等从棉花幼铃中得到了同样能够促进植物脱落的物质，将其称为脱落素Ⅱ（abscisin Ⅱ），且脱落素Ⅱ的活性更强[6]。与此同时，C.F.Eagles等从槭树叶片中纯化出一种可以抑制植物生长且能调控植物休眠的物质，将其称作休眠素（dormin）[7]。1965年，J.W.Cornforth 等从干槭树叶中提取出休眠素纯结晶，并用多种方式比较了脱落素Ⅱ和休眠素的性质，均证明了休眠素与脱落素Ⅱ两者化学结构相同，是同一种物质[8]。1967 年，在第六届国际生长物质会议上，将可以调节生物生长的物质正式命名为脱落酸[9]。由此确立了ABA作为植物生长调节剂的广泛存在和重要性。

1.1.1.2脱落酸的合成及分布

脱落酸存在于全部维管植物中，被子植物、裸子植物等高等植物中；苔藓、藻类等低等植物中都有存在[9]。高等植物中每个组织部位均含有ABA，特别是在即将面临休眠状态和将要掉落的部位中最多。植物维管束薄壁细胞是脱落酸的主要生成部位，然后被运输到特定的植物组织或器官中发挥生理功能[9]。ABA的生物合成途径主要有两条，在质体/叶绿体及细胞质中由C15直接途径和C40间接途径合成[10]。

碳15直接合成途径又称为类帖途径，以甲瓦龙酸（MVA）为前体由三个异戊烯单位聚合成碳15前体法呢基焦磷酸（FPP），FPP分别经过环化作用和氧化作用直接形成15碳的ABA[11]；碳40间接途径又称类胡萝卜途径，具体合成过程包括:以碳40类胡萝卜素为前体，经氧化作用形成玉米黄质[12]，玉米黄质在玉米黄质环氧化酶(ZEP/AtABA1)的作用下经过环氧化作用形成全反式紫黄质[12]。全反式紫黄质在9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）的氧化作用下，裂解形成黄质醛[14-16]。黄质醛从质体中转移到细胞质，在一个短链脱氢酶(SDR/AtABA2)催化作用下变为ABA醛[17]。ABA醛经醛氧化酶(AAO/AO)的脱氢作用生成了ABA[18]。间接合成途径是植物（主要是高等植物）体内ABA的主要合成途径。如图1.1所示。

图 1.1 ABA在拟南芥中的生物合成途径[16]

Fig. 1.1 The biosynthetic pathway of ABA in arabidopsis thaliana

1.1.1.3脱落酸的生物功能

ABA参与种子的休眠与萌发。有研究发现，ABA缺陷型或ABA不敏感型拟南芥突变体种子不能进行正常的休眠[18, 19]。这一结果说明在种子休眠尚未萌发的过程中，脱落酸参与整个过程中，没有ABA存在时，种子将停止休眠状态，开始萌发。ABA分解酶CYP707A2在种子休眠初期，表达情况未被检测到；当种子休眠状态被破坏，CYP707A2表达量逐渐上升，ABA被分解，种子开始萌发[20]。这一结果说了种子的萌发过程中，ABA参与控制并发挥功能。

ABA调控气孔关闭。当植物处于干旱条件下，ABA在植物叶片细胞中的含量会迅速增多，提高细胞渗透势，使细胞失水，气孔关闭，来抵抗干旱胁迫[21, 22]。研究者发现，ABA对气孔关闭的调节，还能保护植物抵御外界病原微生物的侵染，PAMP（pathogen-associated molecular pattern）可以参与植物的免疫反应，使叶片气孔关闭，抵御外界病原微生物的入侵[23]。

ABA调控植物的生长。研究发现，对生长中的番茄外源施加ABA，能够抑制番茄果实的生长，此外同时抑制番茄侧根的生长[24]。对桑树幼苗喷洒ABA处理，有效抑制其根、茎的生长的长度，且ABA处理浓度越高，抑制作用越强[25]。这些实验结果说明在植物的生长发育中ABA发挥反向抑制作用。

ABA响应植物非生物胁迫。研究发现水稻转录因子OsABL1通过直接调节含有ABA响应元件ABRE的WRKY家族基因来调控植物的逆境反应[25]。水稻OsbZIP46通过调控抗性相关基因的表达来影响植物对干旱的抗性[26]。

此外，脱落酸还具有调节控制果实的发育与叶片的衰老等功能。

1.1.2 ABA受体研究进展

伴随着科学家对脱落酸研究的深入，ABA信号在植物内的传递转导成为大家关注的焦点。ABA信号转导过程中最关键的第一步是ABA与其受体的结合，受体蛋白对ABA信号的感知和识别是该信号转导的前提和基础。ABA发现以来，寻找ABA的受体蛋白一直是ABA信号转导领域的最为关心的问题，人们一直通过遗传和化学筛选等方法来寻找受体，直至最近几年，一些ABA受体才逐渐被发现，经过鉴定和证实，主要有FCA、ABAR/CHLH、GCR2、GTG1/2 和PYR/PYL/RCARs。

1.1.2.1 FCA研究进展

分离到的第一个具有ABA结合功能的蛋白是在大麦糊粉蛋白中被鉴定出来的ABAP1（ABA protein1），该蛋白具有WW结构域，亚细胞定位于质膜，受ABA诱导，能够与(3)H-(+)-ABA结合，是一种针对ABA抗体的抗体[29]。而后因实验结果受到质疑，不能被重复出来，已经撤稿。经序列分析发现，拟南芥FCA为ABAP1同源序列，FCA是一种RNA结合蛋白，其在调控植物花期中起关键作用[30]。FCA通过阻止在开花过程中起抑制作用的转录因子FLC的mRNA的积累而起到促进拟南芥开花[31]。此外，FCA能与ABA结合，影响 FCA-FY（一个 RNA 结合因子）之间的相互作用从而抑制拟南芥开花[32]。然而，ABAP1和FCA在几个基本方面存在差异：ABAP1最初被描述为与质膜相关，而FCA是一种核蛋白，具有两个ABAP1中不存在的保守的RNA结合域。使用放射配体结合测定法重复FCA与ABA的结合实验没有成功[33, 34]。基于这些结果，FCA作为ABA结合受体的观点不被认同。

1.1.2.2 ABAR/CHLH研究进展

第二个被当作的ABA受体蛋白是GHLH，是在蚕豆表皮中被发现，通过利用一种有氨基功能的树脂与ABA的羧酸盐连接，然后利用亲和层析法提取出的ABAR蛋白[35]。ABAR蛋白几乎参与所有ABA功能反应，如种子的萌芽发育，气孔的开关闭运动等[36]。通过序列比对发现，ABAR蛋白就是已报道的镁离子螯合酶的H亚基(CHLH)，CHLH是一种多亚基质体复合物，具有将Mg2+插入原卟啉IX中，从而产生叶绿素前体Mg-原卟啉IX (Mg-proto) 的功能[37]。Mg-proto在拟南芥[38]和衣藻[39]能够协调细胞核和叶绿体基因的表达，起到信号转导作用。进一步研究发现，拟南芥ABAR/CHLH在特异性结合ABA之余，可以正向调控ABA信号[36]。而大麦中的同源基因ChIH，不能结合ABA，而且其突变体显示出正常的的ABA应激性表型，这表明大麦ChIH不能充当ABA受体，或者单子叶植物和双子叶植物ChlH蛋白在ABA结合和信号传导方面可能有所不同[40]。且ABAR参与传递介导ABA信号的分子机制尚不明确，因此关于ABAR/CHLH作为ABA 受体的资格还需进一步探究。

1.1.2.3 GCR2/GTG1/2研究进展

长期以来，有实验证明，植物中涉及G蛋白偶联的ABA信号转导途径[41]。2007，Liu等报道了一个定位在细胞膜上的蛋白，GCR2，其被认为是ABA分子存在于细胞膜上的受体蛋白，是一种G蛋白偶联受体(GPCR)[40]。GCR2可以以很强的结合力与ABA相互作用。能够与拟南芥异源三聚体Ga亚基(GPA1)相互作用来参与介导ABA应答反应，包括气孔的关闭、种子的萌发以及ABA响应基因的表达[42]。但不久之后，多个研究小组提出质疑，GCR2与细菌羊毛硫氨酸合成酶 (lanthionine synthetase) 蛋白同源性高，并非G蛋白偶联受体。且在拟南芥中GCR2突变体与野生型对ABA的反应表型完全一致，对种子的发芽和植物的生长没有影响；因此，GCR2是否是ABA受体蛋白在植物界依旧存在着争议[43, 44]。

Pandey等人认为，不同的GPCR可能是拟南芥G蛋白调节途径中缺少ABA感知成分。通过生物信息学在拟南芥基因组中搜索鉴定出两个同源的GPCR型G蛋白：GTG1和GTG2。并且发现GTG1/2能够与(+)-ABA特异性结合，由此判断GTG1和GTG2是ABA受体蛋白且存在于细胞膜上的[45]。但研究发现敲除GTG1/2的双突变体在幼苗生长、种子萌发、以及气孔关闭等方面虽然表现出对ABA的低敏感性，但是对ABA的反应并没有完全消除，可能还存在着其他的ABA受体[46]。

1.1.2.4 PYR/PYL/RCARs研究进展

ABA作为一种关键的生长激素，其受体蛋白的发现历经曲折，科学家们不断报道发现的新的ABA受体，而又不断收到质疑甚至撤稿，这让研究者们更加致力于对于发现确定的ABA受体。由于传统的系统生物研究方法存在局限性，不能鉴定出其他可能的ABA受体，所以同时有不同的研究团队采用新的试验方法发现新的ABA受体PYR/PYL/RCARs基因家族。

Ma等人利用已知的拟南芥中负调控ABA信号通路的磷酸酶（PP2C）ABI2为诱饵通过酵母双杂交的方法筛选获得了互作的蛋白，研究者将其命名为ABA受体调控元1，即RCAR1(regulatory component of ABA receptor 1)[45]。磷酸酶活性试验显示RCAR1抑制了亚细胞水平定位在细胞核及细胞质的PP2C的磷酸酶活性。拟南芥中RCAR1与白杨的具有75%序列相似性，推断其他物种的相关蛋白也具有ABA受体活性。在模式植物拟南芥中，AtRCAR拥有14个家族基因成员，分别命名为AtRCAR1-14[47]。

巧合的是，在RCAR 1被发现的同时，Park等人利用化学遗传学手段人工合成的能够特异性抑制植物种子萌发和细胞扩增的小分子植物生长抑制剂Pyrabactin (ABA的功能类似物)为选择性激动剂，筛选鉴定出了ABA受体PYR1(PYRABACTIN RESISTANCE 1)，通过基因分析发现，PYR1还具有其他13同源基因，分别命名为PYL1-13/PYR1-Like[48]。而后证实Ma等人发现的14个RCARs家族成员与Park等人发现的PYR/PYLs家族成员同属一个家族。如图1.2所示。从这以后，PYR/PYL/RCARs基因家族作为ABA受体蛋白得到科学界的认同。

图 1.2RCARs基因家族进化树与PYR/PYLs基因家族进化树对比图[47, 48]

Fig.1.2 Comparison of RCARs gene family evolutionary tree and PYR/PYLsgene family evolutionary tree

在模式植物拟南芥中，PYR/PYL/RCARs(以下简称为PYLs)基因家族一共发现14个家族成员，除了AtPYL13以外，其他都能在植物体内激活ABA下游相关基因的表达[49]，AtPYL5， AtPYL8和AtPYL9基因过量表达不仅能够能显著提高植物在种子萌发、幼苗生长、气孔开闭等阶段对ABA的敏感性，而且还能提高植物的抗旱能力[47, 50]。朱健康实验室发现，除了PYL13基因，其它所有的PYLs基因均能够激活ABA信号转导路径，并且与ABA发生结合[50]。颜宁课题组发现在PYLs家族中，PYL2881和PYL 1080k位点对ABA受体与PP2Cs的结合非常重要，决定了受体蛋白与PP2C互作时是否依赖ABA的存在[48]。以上研究结果表明，PYLs基因家族作为ABA受体蛋白的地位不容挑战，同时ABA受体构象的变化对其功能非常重要。

目前，在不同的植物物种中如：水稻、番茄、大豆等，也鉴定到 ABA 受体 PYLs的同源蛋白，并且这些同源蛋白在PYLs介导的ABA信号转导模型中表现出高度的保守性[50-53]。PYLs的功能在不同植物物种中也是高度保守的，水稻ABA受体OsPYL/RCAR5被报道能够正调控ABA信号，且提高了水稻的抗旱和抗盐碱胁迫的能力[54]。赵杨等发现，敲除了拟南芥中所有PYLs的十四重突变体，突变体表型极其矮小且无法产生后代。PYL的十二重突变体则发育迟缓，种子活力下降等现象，外源施加ABA后，可促进PYL的十二重突变体的根部生长[55]。说明植物的正常生长发育离不开ABA的参与调控，证明了ABA的重要性。

1.1.3 ABA信号转导途径研究概况

ABA参与调控植物生长发育的全部过程，如种子的成熟与休眠、根系发育等，是植物体内最关键的激素之一[2, 56]。近年来，有关植物体内ABA信号转导的分子机制的研究越来越多，特别是在ABA受体PYR/PYL/RCAR蛋白和其下游蛋白质磷酸化系统的发现后。研究者们根据ABA相关蛋白质元件结构和功能的研究结果，提出了ABA信号转导的双重负调控系统，将PYR/PYL/RCAR蛋白与之前鉴定的其它调节因子PP2C，SnRK2及其下游元件相互联系起来，构建了一条从信号接收到转录调控的ABA信号通路，深刻了人们对ABA信号传递及其传递路线的认识。

ABA信号转导途径由3个核心成分组成：ABA受体蛋白：PYR/PYL/RCAR[48]、ABA信号负调控蛋白：2C类蛋白磷酸酸酶（PP2C）[57]、ABA信号正调控蛋白：SNF1相关蛋白激酶2（SnRK2）[58]。这个通路是一个双负调控系统，在通常情况下，植物体内无ABA存在，PYLs不与PP2Cs结合，PP2Cs与SnRK2s结合通过去磷酸化作用抑制激酶SnRK2s活性，抑制ABA信号往下游传导；当植物感知到周围恶劣环境，受到胁迫时，植物体内ABA 合成增加，细胞内ABA含量增加，ABA受体PYLs感受到ABA信号并与之结合， ABA-PYLs与A类PP2Cs蛋白结合，并抑制PP2CAs的磷酸酶活性，从而将SnRK2从PP2Cs的负调控下释放，并通过磷酸化激活下游信号因子而传递ABA信号[59]。从而增强植物抵抗逆境的能力。如图1.3所示。

图 1.3ABA信号转导途径[56]

Fig. 1.3 ABA signal transduction pathway

1.1.3.1 ABA信号转导途径中的负调控蛋白：2C类蛋白磷酸酸酶（PP2C）

PP2C蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C，PP2C）是一类丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶，在动植物中以单体酶的方式存在，参与调控多种信号途径[60]。植物中的PP2C基因家族成员数量多，在拟南芥中发现有80个家族成员，水稻中鉴定了78个家族成员[61]。高等植物中的PP2C家族成员参与调控多个ABA信号途径，如种子发芽与休眠、叶片气孔的关闭、生物与非生物胁迫等[62]。PP2C作为多条信号途径的负调控因子，能够直接与激酶或其他调控蛋白结合，还可以和启动子区域结合来调控基因的表达[63]。PP2C参与的多条信号转导途径虽然调控机制不同，但其酶催化活性都依赖于Mg2+或Mn2+的浓度。植物PP2C基因的C端的结构域相似度高功能保守，而N端的功能则各不相同[60]。其中PP2C的A亚家族成员(后面称PP2CA)是最早发现能够参与ABA信号的重要调控因子，在拟南芥中PP2CA有9个成员，分别是AHG1, AHG3, HAI1, AIP1, HAI3, HAB2, HAB1, ABI1和ABI2[64]。图1.4所示。

图 1.4拟南芥PP2CA亚家族进化树

 

Fig. 1.4 Evolutionary tree of arabidopsis thaliana PP2CAsubfamily

到目前为止拟南芥PP2CA 9个家族成员中有6个成员均被报道能参与ABA信号转导途径，包括：ABI1、ABI2、HAB1、HAB2、AHG1和AHG3；其中ABI1和ABI2是最早被发现参与ABA信号转导的关键因子[65]。通过EMS手段获得的拟南芥abil-1、abil-2突变体在种子萌发及生长发育阶段会显著降低对ABA的响应，且abil-1、abil-2突变相对于野生型属于显性突变[57, 66, 67]。HAB1/HAB2与 ABI1/ABI2序列同源性高，且存各个组织器官中均能测出表达[68]。在拟南芥中通过利用CaMV35S强启动子组成性表达HAB1获得的突变体，与野生型拟南芥比较，突变体对ABA的敏感性远低于野生型[68]。HAB1的隐性T-DNA插入突变体hab1-1，突变体在种子萌发，组织生长方面表现出ABA高度敏感[68]。AHG1、AGH3缺失突变体ahg1、ahg3在种子萌发及幼苗生长阶段对ABA显示出超敏感性，在成苗阶段则没有较明显的表现[69, 70]。这些研究表明PP2CAs家族是ABA信号转导过程中的负调控因子。

研究表明ABA与PYL蛋白结合后能抑制PP2C的活性，其作用机理是：ABA与PYL结合后，连接PYLβ3、β4链和β4、β5链的两个保守环的构象发生变化，分别称之为“门环”和“门环”，PP2C的保守谷氨酸残基(ABI1 Glu142)与暴露在PYL蛋白“门环”外面的保守丝氨酸残基 (PYL2 Ser89 )在其侧链形成了氢键，影响了PP2C与Mg2+和Mn2+的结合，导致对PP2C活性的竞争性抑制[71]。PYL2的Ser89还能通过氢键与PP2C活性位点上的甘氨酸残基(ABI1 GIy180)相结合，阻止底物蛋白与PP2C的催化活性中心结合，从而直接抑制PP2C的磷酸酶活性[71]。如图1.5所示。

 

图 1.5ABA与PYL蛋白结合后能抑制PP2C的活性机理图[71]。

（A）PYL蛋白与PP2C蛋白结合形式的二聚体结构（B）ABA-PYR1结构中ABA结合口袋的细节（C）非结合状态的PYL蛋白与PP2C蛋白结合形式的二聚体结构

Fig. 1.5 Activity mechanism diagram of PP2C inhibition after ABA binding with PYL protein.(A) Dimer structure in the form of PYL protein binding to PP2C protein .(B)Details of the ABA binding pocket in the aba-pyr1 structure. (C) Dimer structure in the form of non-binding PYL protein binding to PP2C protein.

1.1.4.2 ABA信号转导途径中的正调控蛋白：SNF1相关蛋白激酶2（SnRK2）

SnRK(Sucrose non-fermentingl-related protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，参与多种植物激素信号转导途径，在植物的生长、发育以及各种非生物胁迫如：干旱、盐碱等过程中发挥着多种重要的生理功能[72, 73]。SnRK蛋白激酶家族可分为三个亚家族；SnRK1主要参与碳代谢，在淀粉和糖的合成中发挥作用[74]；SnRK2和SnRK3是植物所特有，主要在植物抵御逆境胁迫中的作用，其中SnRK2是ABA信号转导途径中十分关键的正向调控因子[73]。自1992 年PKABA1被确定为首个从 ABA 处理的小麦胚胎 cDNA 文库中分离得到SnRK2成员以来，研究人员对各种植物中的SnRK2进行了挖掘与鉴定[73]。在拟南芥、水稻、小麦、玉米、葡萄、马铃薯等多个植物中均发现了SnRK2基因家族成员，且在不同植物中的SnRK2成员数目迥然不同[75]。

SnRK2是一个分子量相对较小的蛋白激酶亚家族，蛋白分子量约为40kD，含有两个结构域：N端激酶结构域和C端调节结构域[76]。N端是高度保守的激酶区域，与其激酶活性密切相关，包含高度保守的ATP结合位点DXGXGNFGVAXL和丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶活性结构域(活化环)KICDFGYSKSXXXHGXPK[73]；C末端是保守性较差的区域，又分为结构域I和结构域II两个区域，结构域I由靠近N端激酶结构域后的30个氨基酸组成，存在于所有的SnRK2家族成员中，是SnRK2受逆境胁迫激活但不依赖ABA的结构基础；结构域II是由靠近C端的40个氨基酸组成的，是植物响应ABA信号的必要结构，是ABA依赖型SnRK2所独有[58, 77]。

根据SnRK2碳末端的结构特点以及它们对ABA的响应情况，研究人员将拟南芥中的10个SnRK2s成员，分为三个亚家族，其中第1亚家族成员碳末端富含谷氨酸（Glu），它们几乎不能响应ABA信号（AtSnRK2.1，AtSnRK2.4，AtSnRK2.5，AtSnRK2.9，AtSnRK2.10）；第2亚家族和第3亚家族的SnRK2碳末端均富含天冬氨酸（Asp），第2亚家族的SnRK2不被或者是较弱地响应ABA信号（AtSnRK2.7，AtSnRK2.8），而第3亚家族的SnRK2被ABA强烈激活（AtSnRK2.2，AtSnRK2.3，AtSnRK2.6）[58, 78]。如图1.5所示。

图1.6拟南芥SnRK2结构图

（A）SnRK2结构模式图；（B）AtSnRK2序列比对结果[58]

FIG. 1.6 Arabidopsis SnRK2 structure diagram

SnRK2 structure pattern diagram ;(B) AtSnRK2sequence alignment results

1引言

1.1研究目的与意义

ABA是一种天然的、植物自身合成的关机激素，广泛存在与高等植物的各组织器官中，在植物生长发育等各个方面均参与调控，包括：种子的生长休眠与发芽，植物的分化，幼苗的生长等[58]。同时，ABA也是一种抗胁迫激素，参与各种生物和非生物胁迫，参与调控植物对干旱、盐碱、低温、高温等逆境胁迫的抵御，提高植物的抗胁迫能力，使植物更好的适应与抵御逆境[4]。

茶树作为我国重要的园艺作物之一，，是多年生喜温喜湿植物，耐寒性较弱。干旱严重影响了茶树生长发育及茶叶产量、品质[79]。随着全球气温变暖，这一问题趋于严重。因此培育抗逆茶树品种是应对干旱胁迫最主要的措施之一。然而，茶树抗逆机制的研究还处于初步阶段，对于茶树抗逆相关基因的鉴定还很有限。而ABA作为一种抗胁迫激素，被很好的运用到提高植物抵御逆境胁迫的能力上来。本论文通过研究茶树ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族的表达模式、在逆境胁迫中的表达模式、相互之间的互作关系来更好的诠释和解析茶树ABA 信号转导通路，为寻找和改造抗逆新品种，以提高作物产量提供理论依据，具有重要的理论与实践意义。

1.2研究内容

（1）深入挖掘茶树基因组，对茶树中ABA受体蛋白CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s全基因家族进行鉴定和分析；确定CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族的基本功能以及组织表达特性；

（2）分析多种非生物胁迫下（干旱、盐碱、低温冷害）CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s的表达情况分析；

（3）干旱处理下，不同茶树品种CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s的应激与表达情况分析；

（4）外源施加ABA处理下CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s家族基因表达情况分析；

（5）酵母双杂验证ABA受体蛋白与蛋白间的相互作用；

（6）为茶树抗旱机制的研究提供分子水平依据，为筛选抗旱品种提供依据。

1.3技术路线

2材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

两年生扦插苗“舒茶早”、“中茶108”、“福云6号”。

2.1.2菌株与载体

菌株：大肠杆菌菌株为Transe-T1，DH5α和Rosetta，购自全式金公司；酵母菌种Y2H Gold，为实验室保存。

载体：克隆载体pEasy-Blunt-Zore购于全式金公司，原核表达载体pGEX-4T-1，pET-32a为实验室保存；酵母双杂交诱饵载体pGADT7和捕获载体pGBKT7为实验室保存。

2.1.3实验仪器与试剂

2.1.3.1实验仪器

表 2.1实验仪器

Tab 2.1 Experimental apparatus

仪器名称	生产公司
研磨仪	上海净信科技有限公司
离心机	Thermo公司
涡旋仪	其林贝尔仪器制造有限公司
天平	赛多利斯科学仪器（北京）有限公司
纯水仪	Merck Millipore
超声仪	深圳市雷德邦电子有限公司
pH计	梅特勒-托利多
PCR仪	Bio-Rad公司
电泳仪	北京六一仪器厂
制冰机	上海安亭科学仪器厂
电子天平	奥豪斯仪器（上海）有限公司
低温冰箱	日本SANYO公司
恒温振荡器	智诚分析仪器制造有限公司
台式离心机	Eppendorf公司
核酸定量仪	Thermo公司
超净工作台	苏州净化设备有限公司
小型离心机	天根公司
凝胶成像系统	Bio-Rad公司
恒温水循环仪	上海锦华试验仪器厂
电热恒温培养箱	上海精宏设备有限公司
-80℃超低温冰箱	Thermo公司
实时荧光定量PCR仪	ABI公司
电热恒温鼓风干燥机	上海精宏设备有限公司
紫外分光光度计DU®730	BECKMAN 公司
立式自动电热压力蒸汽灭菌锅	日本SANYO公司

2.1.3.2实验室常用分子生物学试剂

表 2.2分子生物学试剂

Tab 2.2 Molecular biological reagent

试剂名称	生产公司
RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒	天根公司
PrimeScriptTMRT reagent Kit	TAKARA公司
TB Green®Premix Ex Taq TM Ⅱ	TAKARA公司
KOD plus Neo	东洋纺公司
Primer sta	TAKARA公司
pEASY-Blunt-zero	全式金公司
2×GenRec 重组试剂盒	通用生物公司
质粒提取试剂盒	全式金公司
限制性内切酶	NEB公司
DNA marker	全式金公司
SYBE Green	全式金公司
Protein marker	全式金公司
酵母转化试剂盒	TAKARA公司
Ni-NTA琼脂糖树脂、GST琼脂糖树脂	生工生物公司
酵母培养基（YPDA、SD-Trp、SD-Trp-Leu、SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp）	TAKARA公司
X-a-Gal	TAKARA公司

2.1.3.3实验室常用试剂的配置

氨苄青霉素（Ampicillin）：将其溶于超纯水，配制成0.1g/L母液，实验使用工作液浓度为100 μg/ml。卡那霉素（Kanamycin）：将其溶于超纯水，配制成50 mg/ml母液，实验使用工作液浓度为0.05mg/ml。氯霉素（chloramphenicol）：将其溶于无水乙醇，配制成34 mg/ml母液，实验使用工作液浓度为34 μg/ml。金单子素A（Aureobasidin A）：将其溶于无水乙醇，配制成1 ng/ml母液。5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷（X-a-Gal）：将其溶于DMF，配制成10 mg/ml母液，实验使用工作液浓度为10 μg/ml。脱落酸（abscisic acid）：称取一定量的ABA溶于超纯水，配制成10 mg/ml母液，实验使用工作液浓度为10 μg/ml。

     2.2实验方法

2.2.1植物材料与非生物胁迫处理

2.2.1.1水培茶苗驯化处理

从安徽德昌良种苗木有限公司购买的“舒茶早”扦插苗和从福建千鹤茶苗有限公司购买的 “中茶108”，“福云6号”扦插苗为试验材料。三个品种的扦插苗均为两年生，株高为25~30 cm，苗根完整白嫩，整体长势一致。首先用流动的自来水将茶苗根部泥沙冲洗干净（尽量不要伤及根），放置于日晒过的自来水中，水中插入氧气泵24小时通气，驯化10天，驯化期间注意观察，淘汰萎蔫茶苗，每三日换一次水，再改用纯净水驯化3天。茶苗驯化完成后用1/4浓度的小西茂毅茶树营养液（见附表1）培养茶苗使其顺利过渡至能够正常生长发育阶段，此过渡过程培养7天左右。待茶苗正常生长后，将扦插苗置于营养液中后转移到人工气候室。人工气候室设定程序为：光照时长12小时每天，室温22±1 ℃，空气湿度45 %~50 %。营养液为小西茂毅营养液，使用0.1 M HCL或0.1 M NaOH调节pH至5.5。每12小时间隔通气，每三天更换一次营养液，根部遮光，等待茶苗长出新根。

2.2.1.2干旱处理茶苗

茶苗长出新根后，挑选长势一致，生长状态良好的“中茶108”，“软枝乌龙”。将根部用纯水清洗干净后（注意不要损伤新根），定植于容量为4 L的水桶中。对照组为小西茂毅营养液培养，处理组为小西茂毅营养液及200 g PEG培养。处理5天后取样，取样时使用超纯水将处理后的茶苗根部冲洗干净洗去培养液，用纸吸去多余水分后，分别取茶苗新根及嫩叶与冻存管中。取样后立即置于液氮中，待取样完成后将样品储存于-80 ℃超低温冰箱，用作实时荧光定量PCR检测。

 

图 2.1干旱处理不同品种茶苗。

A、B为“中茶108”处理0 d和5 d；C、D为“软枝乌龙” 处理0 d和5 d。

Fig. 2.1 Drought treatment of different varieties.A and B were treated with “zhong cha 108” for 0 d and 5 d;C and D is “soft branch oolong” treatment 0 d and 5 d.

2.2.1.3 ABA处理茶苗

茶苗长出新根后，挑选长势一致，生长状态良好的 “舒茶早”，根部用超纯水清洗干净（注意不要损伤新根）。培养在含有0.25 mM ABA的小西茂毅营养液中，在0 h，0.5 h，2 h，6 h，24 h时间点取样。取样时将茶苗根部用超纯水冲洗干净，分别取茶苗新根及嫩叶。取样后立即置于液氮中，待取样完成后将样品储存于-80 ℃超低温冰箱。每次处理每个时间点最少用5株茶苗，共重复三次处理。

图 2.2ABA处理水培茶苗示意图

Fig. 2.2 ABA treatment of hydroponic tea seedlings

2.2.2茶树ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s全基因组筛选

利用拟南芥基因注释组数据库TAIR（http://www.arabidopsis.org/），水稻基因组注释数据库RCAP（http://rice.plantbiology.msu.edu/）以及NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上获得的拟南芥，水稻及其他物种中经过验证的PYL，PP2CA，SnRK2基因序列作为检索依据在茶树基因组数注释据库TPIA（http://tpia.teaplant.org/）中进行Blast同源序列检索，获得茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因的基因序列、CDS序列和氨基酸序列。

2.2.3茶树ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s生物信息学分析

2.3.3.1基因结构分析

将获得的茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因的基因序列及对应的CDS序列提交到基因结构在线分析网站Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)进行基因结构分析。

2.3.2.2系统进化树的构建

为了分析茶树中CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族的系统发育进化情况，通过使用MEGA 7.0软件中的neighbor-joining模式，与拟南芥中的AtPYL1-13，AtPP2CA1-9，AtSnRK2.1-10序列构建系统进化树。

2.3.2.3蛋白理化性质

为了分析茶树中CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族的理化性质，利用在线工具ExPasy (http://web.expasy.org/compute_pi/) 对所有的氨基酸序列进行了氨基酸数目（aa），分子量（KDa），理论等电点（pI）的分析。

2.3.2.4亚细胞定位分析

对获得的茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因的氨基酸序列提交到亚细胞定位预测在线网站Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）进行亚细胞定位预测。

2.2.4总RNA的提取和cDNA的合成

2.2.4.1总RNA的提取

茶树总RNA的提取使用the RNAprep pure plant kit (polysaccharide & polyphenolic rich) 试剂盒，来自天根公司，产地上海。实验中使用的玻璃器皿经180 ℃烘6 h，其余实验器皿使用0.1% DEPC水浸泡处理。

2.2.4.2cDNA的合成

茶树cDNA的合成采用TAKARA公司PrimeScriptTMRT reagent Kit 试剂盒及PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒。前者合成的cDNA用于qRT-PCR，后者合成的cDNA用于茶树基因的克隆。

（1）PrimeScriptTMRT reagent Kit反应组分：

5×PrimeScript RT Master Mix	2 μl
Total RNA	500 ng
RNase Free dH2O	up to 10 μl

缓慢混匀后，使用PCR仪进行反应，反应程序如下：

37 ℃	15 min
85 ℃	5 sec
4 ℃	∞

完成后保存于-20 ℃冰箱。

（2）PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反应组分：

Oligo dT Primer	1 μl
dNTP Mixture	1 μl
Template RNA	500 ng
RNase Free dH2O	up to 10 μl

65℃保温 5 min 后，冰上迅速冷却。

上述变性后反应液	10 μl
5X PrimeScript Buffer	4 μl
RNase Inhibitor	0.5 μl
PrimeScript RTase	1 μl
RNase Free dH2O	up to 20 μl

缓慢混匀后，使用PCR仪进行反应，反应程序如下：

30 ℃	10 min
42 ℃	30-60 min
95 ℃	5 min

完成后保存于-20 ℃冰箱。

2.2.5目的片段的克隆及原核表达

2.2.5.1目的基因的获取

基于茶树基因组数注释据库，筛选获得茶树中PYR1 / PYL，PP2CA和SnRK2的CDS序列。使用引物设计软件Primer Premier 5对目的基因进行特异性引物设计。采用TOYOBO公司的高保真酶KOD-Plus-Neo进行扩增。

KOD-Plus-Neo扩增体系为：

10Xpcr Buffer for KOD-Plus-Neo	5 μl
2 mM dNTPs	5 μl
25 mM MgSO4	3 μl
Primer-F	1 μl
Primer-R	1 μl
cDNA	200 ng
KOD-Plus-Neo	1 μl
RNase Free dH2O	up to 50 μl

缓慢混匀后，使用PCR仪进行反应，反应程序如下：

94 ℃	2 min
98 ℃	10 sec
60 ℃	30 sec
68 ℃	1 min
68 ℃	10 min
4 ℃	∞

将获得的PCR产物用浓度为2.0% 的琼脂胶，90 V电压下进行凝胶电泳。在紫外照射灯下小心切下含有目的基因片段的凝胶，放入1.5 ml离心管中，计算凝胶净重，并按照天根公司胶回收试剂盒进行目的片段的胶回收。将纯化后的目的片段与pEasy Blunt Zero 克隆载体的连接：取目的片段胶回收产物4.5 µL（10~50 ng），加入0.5 µL pEasy Blunt Zero 克隆载体，在PCR仪上，37 ℃ 连接10 min。将连接产物转入克隆菌株Transt-T1 感受态细胞中，涂布于含有Ampr抗性的固体LB上，37℃倒置培养10小时左右。挑取平板上的单克隆菌株，先进行PCR验证，挑取有单一条带且明亮的菌株送通用测序公司进行测序验证。待测序结果返还后进行序列比对，比对正确的则为目的基因。

2.2.5.2原核表达

（1）表达载体线性化

采用NEB公司限制性内切酶进将表达载体进行线性化。200 μl离心管中加入1 µg表达载体，1 μl所选酶切位点对应的内切酶，5 μl最适缓冲液，最后用无核糖核苷酸水补足至50 μl。在37 ℃恒温酶切30 min以上。

（2）载体重组

采用通用生物公司的2×GenRec 重组试剂盒进行表达载体的重组构建。200 μl离心管中加入200 ng目的片段，200 ng线性化载体，10 μl 重组酶，最后用超纯水补足至20 μl，轻轻混匀，55 ℃连接50 min。

（3）转化及验证

将重组载体转入表达菌株Rosetta 感受态细胞中，涂布于含有Chlr、Ampr抗性的固体LB上，37℃倒置培养10小时左右。然后挑取固体平板上的单克隆菌株，进行菌落PCR验证。并送通用测序公司进行测序验证。待测序结果返还后进行序列比对，比对正确的则为目的基因成功插入表达载体。

（4）诱导表达

挑取已验证正确的阳性单克隆菌株于含有Chlr、Ampr抗性的5 ml液体LB培养基中，在恒温振荡器以转速200-220 rpm，培养10-12h，温度设为37 ℃。取200 μl培养过的菌液，以1:1000的比例，至200 ml的LB液体且含有相同抗性的培养基中进行扩大培养，在37 ℃恒温振荡器以转速200-220 rpm，培养至菌液OD600=0.6-0.8。取2 ml菌液备用。剩余培养液中，加入诱导剂IPTG，设定恒温振荡器为16 ℃，200-220rpm诱导24 h。取诱导后菌液2 ml。剩余菌液利用冷冻离心机，转速设为4000 g，温度为4℃，时间为15 min，去除上层液体培养基。进行诱导后菌体的收集。

（5）诱导后蛋白SDS-PAGE检测

将2 ml诱导前和诱导后的菌液进行SDS-PAGE电泳样品制备。离心机12000 rpm， 5 min，弃去上清，加入80 μL 超纯水悬浮后，再加20 μL 5 ×protein Buffer，100 ℃，5 min。将制备好的样品进行蛋白含量测定，上样量为10 μL。使用10%的分离胶和5%的浓缩胶对样品进行SDS-PAGE电泳检测。电泳程序为：80 V，30 min，待溴酚蓝成一条直线后，改电压为120 V电泳，至染料印记到达分离胶底部后，即可将电泳停止。

SDS-PAGE蛋白胶配方为：

表2.3SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方

Table 2.3 SDS-PAGE separation glue – concentrated glue formula

组分	分离胶	浓缩胶
ddH2O	4 ml	2.92 ml
Tris- HCl（pH = 8.8）	2.5 ml
Tris- HCl（pH = 6.8）		1.25 ml
30％Acr-Bis	3.3 ml	0.8 ml
10％APS	100 μl	50 μl
TEMED	10 μl	8 μl

2.2.6融合蛋白的纯化

将0.5 mM IPTG诱导24 h后的菌液利用冷冻离心机，4000 g，4 ℃，离心时间15 min，弃去上层培养基，收集菌体。每克菌体用5~10 ml binding buffer重悬后，使用超声破碎仪将菌体进行破碎。破碎时间10 min（功率200 W，超声2 s，停歇3 s），破碎完成后用低温冷冻离心机5000 rpm，4 ℃，离心15 min，收集上层清液用于蛋白纯化。蛋白纯化步骤如下：

（1）将树脂轻轻搅拌几次，使树脂完全悬浮。用移液管将树脂液转移到重力流柱中。静置一段时间，使树脂沉降，储存缓冲液从管中排出。

（2）用10倍树脂体积的Binding/wash buffer平衡柱子。以0.5~1 ml/min的速度，使缓冲液完全流出。

（3）将破碎后的上清加入到柱子中并将树脂与液体混匀，在4 °C低温条件下让目的蛋白与树脂充分结合0.5-1h，使目的蛋白与树脂充分结合后。将废液以0.5~1 ml/min的速度缓慢流出。

（4）加入5~10倍柱体积的Binding/wash buffer冲洗树脂，将杂蛋白洗脱干净。

（5）用2倍柱体积的蛋白洗脱液将目的蛋白洗脱至离心管中。洗脱分三次完成，每一次洗脱液分别保存。

2.2.7转录组数据分析

从NCBI获得了干旱，低温和盐碱处理下茶树中PYR1/PYL，PP2CA和SnRK2三个基因家族成员的转录组数据。将数据归一化处理后，使用Multiple Array Viewer软件进行热图分析。

2.2.8实时荧光定量PCR

（1）引物设计

基于茶树基因组数注释据库，筛选获得茶树中PYR1/PYL，PP2CA和SnRK2的CDS序列。选取茶树GAPDH基因作为内参基因，根据qRT-PCR引物设计原则，利用在线网站primer 3.0 plus (http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计目标基因和内参基因的特异性引物，送至安徽通用生物股份有限公司合成。引物列表如下：

表2.4CsPYLs/PP2CAs/SnRK2sqRT-PCR引物

Tab 2.4 CsPYLs PP2CAs/SnRK2sqRT – PCR primers

Gene name	Primer name	Primer sequence 5’-3’	Length	Start	Product Size
CsPYR1	CsPYR1-F	TCGCCGAAGAAAACCAACAATC	22	26	134
	CsPYR1-R	TGAGTTGACTTGGTAGGTGTGG	22	159
CsPYR2	CsPYR2-F	ACCTTCGAGCCCAAACCAAA	20	940	193
	CsPYR2-R	GGAGTCCCGAGACAACTGTG	20	1096
CsPYR3	CsPYR3-F	ACCTTCGAGCCCAAACCAAA	20	406	161
	CsPYR3-R	CTCCCAACACCTCCATCACC	20	566
CsPYR4	CsPYR4-F	GGCAGCGACATCAATTGCAA	20	79	232
	CsPYR4-R	TGACATGGCAGCTCTTGAGG	20	310
CsPYR5	CsPYR5-F	ACCCACAAGCGTACAAGCA	19	245	255
	CsPYR5-R	ACTCCACAACCACCGTTCC	19	499
CsPYR6	CsPYR6-F	CTCTCCGGGAAGTGAACGTC	20	356	294
	CsPYR6-R	TCTCGTCGATCTGAGCAAGC	20	649
CsPYR7	CsPYR7-F	GCCACTACCAGCACCGAA	18	253	293
	CsPYR7-R	GGCTCAGTCCTGTCCTGC	18	545
CsPYR8	CsPYR8-F	CTTCCAGCGACAACAAGCAC	20	232	194
	CsPYR8-R	TTCCCTTCAGGCACATCCAC	20	425
CsPYR9	CsPYR9-F	TCCTGCGACAACCAGCAC	18	174	278
	CsPYR9-R	CTGCCAACCGCTCTGACA	18	451
CsPYR10	CsPYR10-F	GCCACAATGAGCACCGAAAG	20	304	187
	CsPYR10-R	TTCCATCAGGCACATCCACC	20	490
CsPYR14	CsPYR14-F	GCACGTCACAGGGTTCAGTA	20	387	144
	CsPYR14-R	TTCCCTTCTGGCACATCCAC	20	530
CsPYR15	CsPYR15-F	CCTCCCTTTCCCTCCCAGA	19	113	177
	CsPYR15-R	CGTGGCAGCTCTTGAGGAA	19	289
CsSnKR2.1	CsSnKR2.1-F	ATTTCGGTGTGGCGAGGC	18	41	294
	CsSnKR2.1-R	TCAGTCTTGGTGCTGGGC	18	334
CsSnKR2.2	CsSnKR2.2-F	TTGTAGCTGACCCTGCCAAG	20	269	131
	CsSnKR2.2-R	GGGTTGATCGGGCTCTTCAA	20	399
CsSnKR2.3	CsSnKR2.3-F	CCGTCAAGTACATCGAGCGA	20	149	213
	CsSnKR2.3-R	AGCGAGCCTCATCCTCACTA	20	361
CsSnKR2.4	CsSnKR2.4-F	TGGATGCGACCAACTGCT	18	663	112
	CsSnKR2.4-R	TCCAGCACCTGTGGCTTG	18	774
CsSnKR2.5	CsSnKR2.5-F	CAGTTGGCACTCCTGCGTA	19	413	276
	CsSnKR2.5-R	TGCTGATCCTCCTGGACGA	19	688
CsSnKR2.6	CsSnKR2.6-F	GTGCCGCCATCTGATCTCA	19	522	160
	CsSnKR2.6-R	CATGGGTTGTTCGGGCTCT	19	681
CsSnKR2.7	CsSnKR2.7-F	TGTTGCATTCCCAACCCAAATC	22	305	113
	CsSnKR2.7-R	AACCCCACAAGACCAAACATCT	22	417
CsSnKR2.8	CsSnKR2.8-F	TGTCCGAATTTCCATCGAGTGT	22	447	222
	CsSnKR2.8-R	GAAGGTTTCATCGCCTCCTGTA	22	668
CsPP2CA1	CsPP2CA1-F	GGCACGGAGGGTCAAGAG	18	284	235
	CsPP2CA1-R	CCGCAATTGGCAACCACC	18	518
CsPP2CA2	CsPP2CA2-F	CATCGTCTCCAACTGCGGT	19	993	266
	CsPP2CA2-R	TCAAACACTCGTCCTCCGC	19	1258
CsPP2CA3	CsPP2CA3-F	GTGGCCCGAATGTGTCTCA	19	1067	103
	CsPP2CA3-R	TGTCGCCATGTTCTTCCCC	19	1171
CsPP2CA4	CsPP2CA4-F	TAGAGCACGATAACGCCGTC	20	470	213
	CsPP2CA4-R	TCCGCCTACCACAAACTGAC	20	682
CsPP2CA5	CsPP2CA5-F	ATCTCGCCCCTCCATTTCTTC	21	415	202
	CsPP2CA5-R	CTGCCTCTGTCACAACCTCAT	21	616
CsPP2CA6	CsPP2CA6-F	AGGATTGAAAGTGCGGGAGG	20	967	282
	CsPP2CA6-R	TTGTGCTGCGGGAATCTCAT	20	1248
CsPP2CA7	CsPP2CA7-F	GCAGTCAAGCTTCAAATGGCA	21	704	207
	CsPP2CA7-R	CTTTCTCCCACTGTTCCTCCC	21	910
CsPP2CA8	CsPP2CA8-F	GTGATGGGTTGTGGGACGT	18	1220	174
	CsPP2CA8-R	CCTTTTGGAGGGCGAGCA	18	1393

（2）定量PCR引物特异性及扩增效率的检测

将初始浓度为500 ng/μl 的cDNA模板按2倍稀释成一系列浓度制作标准曲线，确定引物的扩增效率。根据熔解曲线中峰的单一性，判断引物是否形成二聚体或是否存在非特异性。

（3）qRT-PCR扩增

采用TAKARA公司TB Green® Premix Ex Taq TM Ⅱ试剂盒，Thermo Fisher Scientific公司348孔光学反应板及光学透过膜，实验仪器为QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific，Singapore）。三次生物学重复三次技术重复验证。相对表达量采用2−∆CT法计算。

qRT-PCR反应体系（10 µL）：

SYBR® Premix Ex Taq TM Ⅱ	5 µL
Primer-F	0.5 µL
Primer-R	0.5 µL
cDNA	4 µL

qRT-PCR反应条件：

95 ℃	30 sec
95 ℃	5 sec
60 ℃	30 sec
72 ℃	30 sec

Melt Curve 65.0 ℃ to 95.0 ℃， increment for 0:05

2.2.9酵母双杂交

2.2.9.1载体构建

使用的酵母双杂交诱饵载体为pGADT7和捕获载体为pGBKT7。使用NEB公司限制性内切酶（EcoR 1与BamH1）进将表达载体进行线性化。使用通用生物公司的2×GenRec重组试剂盒进行表达载体的重组构建。

2.2.9.2酵母感受态的制备

（1）将保存于-80 ℃的Y2H Gold菌种取出，接种于YPDA平板上。30 ℃恒温培养箱中倒置培养3天左右，直到长出的单克隆大小为2~3 mm。

（2）挑取一个已活化的酵母单克隆接种于3 ml的YPDA液体培养基中（15 ml灭菌的离心管）；在30 ℃摇床以230~250 rpm转速振荡培养 8 h~10 h；

（3）吸取5 ul酵母菌液至50 ml YPDA液体培养基中（250 ml 三角瓶），在30 ℃摇床以230~250 rpm转速振荡培养16-20 h，直至OD600=0.15~0.3。室温条件下700 g，离心5 min收集菌体；

（4）倒去上清并用100 ml新鲜YPDA液体培养基重悬酵母菌体；在30 ℃摇床以230~250 rpm转速振荡培养3~5 h，直至OD600= 0.4~0.5；

（5）室温700 g，离心5 min以收集菌体，倒去上清并用60 ml无菌去离子水重悬酵母；

（6）室温700 g，离心5 min以收集菌体，倒去上清并用3 ml 1.1X TE/LiAc 溶液重悬酵母；将重悬液分装于2个1.5 ml的离心管中；高速离心15 s；

（7）倒去上清并将酵母重悬于600 µL1.1X TE/LiAc 溶液。

2.2.9.3酵母感受态细胞的转化

（1）按照下表将待转化的质粒载体分装到1.5 ml无菌离心管中，轻柔混匀；

表格 2.5酵母双杂质粒转化表

Tab 2.5 Yeast double impurity conversion table

阳性对照	阴性对照	实验组	添加量
pGBKT7-53	pGBKT7-Lam	pGBKT7-CsPYL	100 ng
pGADT7-T	pGADT7-T	pGADT7-CsPP2CA	200 ng

（2）每管反应中加入50 ul 重悬酵母感受态细胞，5 μl预变性的Carrier DNA（100 ℃水浴5 min变性），300 μl 1 x TE /LiAc/PEG4000，轻柔混匀。

（3）30℃水浴0.5 h，每隔10 min将离心管上下颠倒混匀一次。

（4）每管加入20 μl 二甲亚砜，混匀。

（5）42 ℃水浴15 min，每隔5 min进行晃动一次。700 g离心5 min。弃掉上清。

（6）用1 ml YPD Plus液体培养基重新悬浮。在30 ℃摇床以230–250 rpm复苏培养约1小时。

（7）高速离心15 s，弃掉上清。用1 ml 0.9 %的氯化钠溶液重新悬浮细胞。 将重悬细胞稀释100倍后， 取100 ul 涂布于选择性SD培养基固体平板上。 30℃倒置培养 3-5 天左右，直到单克隆大小为2-3 mm。

（8）挑取培养好的单克隆于SD/-Ade-His-Leu-Trp/X-α-Gal/AbA固体平板上培养，观察是否长斑，观察酵母生长以及变蓝情况。

2.2.10数据处理与绘图软件

显著性分析及相关性分析使用SPSS 22软件。Heatmap图使用Multiple Array Viewer软件进行绘制。层次关系图使用Cytoscape v3.3.0软件进行绘制。

3结果与分析

3.1茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s的鉴定及生物信息学分析

3.1.1茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s的鉴定

以拟南芥AtPYR1/PYL，PP2CA，SnRK2基因家族，水稻OsPYR1/PYLs，PP2CAs，SnRK2s基因家族以及其他物种中经过功能验证的PYR1/PYLs，PP2CAs，SnRK2s基因为查询序列，在茶树基因组数注释据库TPIA（http://tpia.teaplant.org/）中进行Blast同源序列比对，CsPYLs基因检索到15个，将其命名为CsPYL1-15，其中有3个基因有大片段缺失（CsPYL11-13）被认为可能不具备功能；CsPP2CAs基因检索到8个，分别命名为CsPP2CA1-8；CsSnRK2s基因检索到8个，命名为CsSnRK2.1-8。

3.1.2茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族系统进化树分析

选取拟南芥和茶树的CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因的蛋白序列，通过使用MEGA 7.0软件中的neighbor-joining模式分别构建系统进化树，结果如图3.1所示。

茶树CsPYLs基因家族成员被分为三个亚家族，其中CsPYL1-3,14属于同一亚家族，CsPYL4-10,15属于同一亚家族，CsPYL11-13属于同一亚家族。根据CsPYL与AtPYL家族成员的进化关系我们可以推测CsPYL1-3，CsPYL14与CsPP2CAs互作时依赖ABA，其他的ABA受体蛋白和CsPP2CAs互作时不依赖ABA。茶树CsPYL家族成员与PP2CAs互作的方式可能存在不同。

茶树CsPP2CAs基因家族成员被分为两个亚家族，其中CsPP2CA1-3，5属于同一亚家族，CsPP2CA4,6-8属于同一亚家族。已知拟南芥AtPP2CAs 9个家族成员中有 6 个成员被报道能参与 ABA 信号转导途径，基于系统进化树分析的结果分析，CsPP2CAs家族部分成员能够参与ABA信号的传递。

SnRK2家族保守性高，基于系统进化树分析的结果，茶树CsSnRK2基因家族成员被分为三个亚家族，其中CsSnRK2.1，CsSnRK2.5属于同一亚家族，CsSnRK2.4，CsSnRK2.7-8属于同一亚家族，CsSnRK2.2-3，CsSnRK2.6属于同一亚家族。

图 3.3CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族系统进化树

Fig. 3.1 CsPYLs/PP2CAs/SnRK2sgene family phyletic evolution tree

3.1.3茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因结构分析

为了进一步了解茶树PYL/PP2CA/SnRK2基因家族，对茶树的15个CsPYLs基因，8个CsPP2CAs基因和8个CsSnRK2s基因的基因组序列及对应的CDS序列进行了外显子和内含子分析。如图3.2所示。

在茶树PYLs基因家族中，大部分家族成员比较保守，没有内含子或内含子较少。其中CsPYL4-6，CsPYL11-12，CsPYL14-15没有内含子也不包含非翻译区，CsPYL1，CsPYL3有1个内含子，CsPYL7-9，CsPYL13有2个内含子，CsPYL2和CsPYL10有5个内含子。只有3条家族成员有非翻译区，CsPYL8在下游有非翻译区，CsPYL7和CsPYL9在两端都有非翻译区。

茶树PP2CAs基因家族每个成员都含有多个内含子和非编码区，且基因结构相似。其中CsPP2CA1有2个内含子，CsPP2CA3，CsPP2CA5，CsPP2CA8有3个内含子，CsPP2CA2，CsPP2CA4，CsPP2CA6有4个内含子，CsPP2CA3有5个内含子。CsPP2CA2、CsPP2CA6、CsPP2CA8无上游非翻译区。

茶树SnRK2s基因家族的基因结构分析结果表明CsSnRK2s基因家族基因结构差异较大。CsSnRK2s基因家族每个成员都含有多个内含子，除CsSnRK2.2无上游非翻译区外，其余全部成员均含有上下游非翻译区。其中CsSnRK2.1和CsSnRK2.5有7个内含子，CsSnRK2.2有3个内含子，CsSnRK2.3有14个内含子，CsSnRK2.4、CsSnRK2.7有6个内含子，CsSnRK2.6和CsSnRK2.8有6个内含子。基因结构差异表明其在进化过程中的复杂性与多样性。

图3.2 CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族基因结构分析

Figure 3.2 Gene structure analysis of CsPYLs/PP2CAs/SnRK2sgene family

3.1.4茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s理化性质及亚细胞定位分析

利用ExPasy在线网站 (http://web.expasy.org/compute_pi/) 分析了茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s氨基酸序列组成及理化特性。通过Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在线程序对CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族进行亚细胞定位预测。结果如表3.1所示。

CsPYLs基因家族CDS序列的长度从414 bp(CsPYL11-12)到1386 bp(CsPYL3)不等，编码蛋白质137aa(CsPYL11-12)到461aa(CsPYL3)。预测蛋白质分子大小约为25 kDa左右，其中CsPYL12分子量最小为15.39kDa， CsPYL2分子量最大为52.65kDa。理论等电点(pI)为5.20(CsPYL1) ~9.37(CsPYL8)，其中只有CsPYL6， CsPYL8的理论等电点>7。理论等电点分析结果显示CsPYL s家族富含酸性蛋白。亚细胞定位预测结果表示CsPYLs基因家族在细胞核，细胞质，叶绿体内都有分布，其中CsPYL14的预测定位结果在细胞核，细胞质内均有。

CsPP2CAs基因家族CDS序列的长度从1026 bp(CsPP2CA1)到1629 bp(CsPP2CA7)不等，编码蛋白质341aa(CsPP2CA1)到542aa(CsPP2CA7)。预测蛋白质分子大小约为50 kDa左右，其中CsPP2CA1分子量最小为37.64kDa， CsPP2CA7分子量最大为58.61kDa。理论等电点(pI)为4.62(CsPP2CA8) ~5.87(CsPP2CA2)，理论等电点分析结果显示CsPP2CA s编码酸性蛋白。亚细胞定位预测结果显示CsPP2CAs基因家族定位在细胞核，叶绿体内。CsPP2CA1-3，CsPP2CA6，CsPP2CA8定位在细胞核，CsPP2CA4，CsPP2CA7定位在叶绿体，CsPP2CA5的预测定位结果显示在细胞核，细胞质内均有。

CsSnRK2s基因家族CDS序列的长度从576bp(CsSnRK2.2)到1767 bp(CsSnRK2.3)不等，编码蛋白质191aa(CsSnRK2.2)到588aa(CsSnRK2.3)。预测蛋白质分子大小范围约为30 kDa左右，其中CsSnRK2.3分子量最大为66.75kDa。理论等电点(pI)为4.17(CsSnRK2.2) ~6.13(CsPP2CA2)，理论等电点分析结果显示CsSnRK2s编码酸性蛋白。亚细胞定位预测结果显示CsSnRK2s基因家族定位在细胞核和细胞质内。其中CsSnRK2.2定位在细胞质内，其余家族成员定位在细胞核。

表3.1 CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族基本信息

Tab. 3.1 Basic information of CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s gene family

Name	Position	Nucleotide length	CDS	Intron	Protein (aa)	MV(kDa)	pI	Subcellular localization	Unigene
CsPYL1	Scaffold2655:287835-288738+	903	756	1	251	28.29	5.20	Nucleus	CssPBTrans065218
CsPYL2	Scaffold2348:558297-568184+	9887	1386	5	461	52.65	5.76	Cytoplasm	CssPBTrans065218
CsPYL3	Scaffold106:1016663-1029632+	12969	888	1	295	32.75	5.22	Cytoplasm	CssPBTrans074451
CsPYL4	Scaffold737:1514977-1515636-	659	660	0	219	23.73	6.39	Cytoplasm	CssPBTrans033696
CsPYL5	Scaffold411:5386996-5387619-	623	624	0	207	22.36	6.88	Cytoplasm	CssPBTrans065218
CsPYL6	Scaffold685:864244-864909-	665	666	0	221	23.89	7.10	Cytoplasm	CssPBTrans016924
CsPYL7	Scaffold4:444944-448580+	3636	561	2	186	21.27	6.24	Nucleus	CssPBTrans033696
CsPYL8	Scaffold10492:1024860-1032243+	7383	546	2	181	20.56	9.37	Chloroplast	CssPBTrans065218
CsPYL9	Scaffold5448:574776-577818+	3042	486	2	161	17.96	5.59	Nucleus	CssPBTrans033696
CsPYL10	Scaffold513:295543-315930+	20387	1167	5	388	44.58	5.19	Chloroplast	CssPBTrans065218
CsPYL11	Scaffold875:1167707-1168120-	413	414	0	137	15.47	5.91	Nucleus	CssPBTrans033696
CsPYL12	Scaffold875:1159451-1159864-	413	414	0	137	15.39	6.82	Cytoplasm	CssPBTrans065218
CsPYL13	Scaffold344:519360-520523-	1163	648	2	215	24.42	6.75	Cytoplasm	CssPBTrans016924
CsPYL14	Scaffold1989:1615565-1616197-	632	633	0	210	23.67	5.42	Cytoplasm Nucleus	CssPBTrans016924
CsPYL15	Scaffold572:282484-283128+	644	645	0	214	23.47	6.92	Cytoplasm	CssPBTrans016924
CsPP2CA1	Scaffold597:280518-288667-	8149	1026	2	341	37,64	5.74	Nucleus	CssPBTrans019691
CsPP2CA2	Scaffold3157:484150-486126+	1976	1512	4	503	55.26	5.87	Nucleus	CssPBTrans019691
CsPP2CA3	Scaffold1167:1360434-1362900+	2466	1275	3	424	46.07	5.76	Nucleus	CssPBTrans032651
CsPP2CA4	Scaffold2358:329497-331911-	2414	1557	4	518	55.95	4.92	Chloroplast	CssPBTrans019691
CsPP2CA5	Scaffold217:1170250-1186084+	15834	1170	3	389	42.2	4.83	Chloroplast Nucleus	CssPBTrans044930
CsPP2CA6	Scaffold126:1204550-1215778+	11228	1359	5	452	49.18	5.11	Nucleus	CssPBTrans044930
CsPP2CA7	Scaffold2547:1114563-1124180-	9617	1629	4	542	58.61	4.94	Chloroplast	CssPBTrans058101
CsPP2CA8	Scaffold776:361199-366511-	5312	1464	3	487	53.21	4.62	Nucleus	CssPBTrans065929
CsSnRK2.1	Scaffold946:213720-218337-	4617	993	7	330	38.16	5.67	Nucleus	CssPBTrans027789
CsSnRK2.2	Scaffold16544:617506-621053+	3547	576	3	191	21.5	4.17	Cytoplasm	CssPBTrans058823
CsSnRK2.3	Scaffold4603:758671-775286+	16615	1767	14	588	66.75	4.98	Nucleus	CssPBTrans047103
CsSnRK2.4	Scaffold660:4900886-4906729-	5843	852	6	283	31.82	6.13	Nucleus	CssPBTrans034840
CsSnRK2.5	Scaffold3726:1194547-1199463+	4916	993	7	330	37.57	5.78	Nucleus	CssPBTrans039844
CsSnRK2.6	Scaffold9064:625054-629787-	4733	861	5	286	32.2	4.56	Nucleus	CssPBTrans037373
CsSnRK2.7	Scaffold2091:922266-929497-	7231	918	6	305	34.14	4.54	Nucleus	CssPBTrans034840
CsSnRK2.8	Scaffold6255:411006-418591-	7585	783	5	260	29.24	5.17	Nucleus	CssPBTrans029767

3.2 CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s不同组织器官表达模式分析

为了研究CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个基因家族在不同组织中的表达特性，从茶树转录组数据库（TPIA）获得CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s在8个组织器官（芽、嫩叶、成熟叶、老叶、根、花、种子）的转录组数据，将获得数据标准化处理后，绘制为Heatmap图。如图3.3所示，A为CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族各个基因在茶树不同组织器官中的表达情况；B为茶树一个组织器官中CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族各基因的表达情况。

CsPYLs家族中除3个基因有大片段缺失（CsPYL11-13）被认为可能不具备功能外，其他11个基因在各个组织器官均有表达且呈现多样性。根据CsPYLs各个基因在茶树八大器官中的基因表达量结果分析，CsPYL1在新梢部位和根部表达量较高，CsPYL2和CsPYL9的表达情况相似，在老叶和花中表达量较高，CsPYL3和CsPYL4表达情况相似，在成熟叶及根中表达量较高，其中CsPYL3在根部最低；CsPYL7，CsPYL8，CsPYL10在茶籽中的表达量相对略高，而CsPYL5和CsPYL6则在成熟叶部表达量较高；CsPYL14在根及花中表达量交高，CsPYL15则在根部及种子中表达量较高。根据茶树一个组织器官中各个基因的表达结果分析，与家族其他成员相比，CsPYL1-2，CsPYL14-15在各个组织器官中的表达量较低。在成熟叶，老叶，茎及根部，CsPYL4的表达量是CsPYL家族成员中最高的；在芽，嫩叶及花中，CsPYL5的表达量是CsPYL家族成员中最高的；在种子中，CsPYL9的表达量是CsPYL家族成员中最高的。

CsPP2CAs家族中8个基因在各个组织器官均有表达。根据CsPP2CAs各个基因在茶树八大器官中的基因表达量结果分析，CsPP2CA1-6在地上部位表达量较低，其中CsPP2CA1-3，CsPP2CA6在根部和种子中表达量较高；CsPP2CA4-5在花和种子中的表达量较高；而CsPP2CA7则在茶树嫩梢部位表达量较高；CsPP2CA8在花中表达量交高，在根中表达量较低。根据茶树一个组织器官中各个基因的表达结果分析，与家族其他成员相比，CsPP2CA4在各个组织器官中的表达量较高；而CsPP2CA1则在各个组织器官中的表达量较低。在根部，CsPP2CA3的表达量是CsPP2CA家族成员中最高的。

CsSnRK2s家族中8个基因在各个组织器官均有表达且呈现差异性。根据CsSnRK2s各个基因在茶树八大器官中的基因表达量结果分析，CsSnRK2.1与CsSnRK2.8在茎中表达量较高，CsSnRK2.2和CsSnRK2.4的表达情况相似，在老叶和根中表达量较高，CsSnRK2.3和CsSnRK2.5表达情况相似，在根、茎及花中表达量较高；CsSnRK2.6-7，则在种子中的表达量较高。根据茶树一个组织器官中各个基因的表达结果分析，与家族其他成员相比，CsSnRK2.3与CsSnRK2.8在各个组织器官中的表达量较高；而CsSnRK2.1，CsSnRK2.7则在各个组织器官中的表达量较低。

图3.3 CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个基因家族在各个器官中的表达谱（A）为茶树各组织中各基因的表达模式（B）为茶树一个组织器官中所有基因的表达模式

Fig. 3.3 Expression profiles of three gene families, CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s, in various organs. (A) The heatmap shows the expression patterns of each gene in each tissue of tea tree. (B)The heatmap shows the expression patterns of all genes in a tissue and organ of tea tree.

3.3CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s不同非生物胁迫表达模式分析

ABA信号转导家族作为参与植物抗逆过程中重要的一部分，为了研究CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个基因家族在不同非生物胁迫处理下的表达特征，我们从NCBI获得CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s在干旱，盐碱，低温冷害处理下的转录组数据，将获得的数据进行标准化处理后，绘制为Heatmap图。结果如图3.4所示，A为CsPYLs家族在不同非生物胁迫处理下的表达结果，B为CsPP2CAs家族在不同非生物胁迫处理下的表达结果，C为CsSnRK2s家族在不同非生物胁迫处理下的表达结果。

CsPYLs家族在不同非生物胁迫处理下的表达呈现差异性。在干旱处理下，CsPYLs基因家族的表达呈现不同的表达模式，除CsPYL3无转录组数据外；CsPYL2，CsPYL4-6，CsPYL14呈现下调表达，其中CsPYL14基因对干旱处理的负响应最强烈，且随着干旱时间的增加，响应值越低。CsPYL1，CsPYL8-10，CsPYL15基因呈现上调表达，CsPYL15对干旱处理的正响应最高。在盐碱胁迫下，CsPYL3，CsPYL7-10，CsPYL14呈现下调表达，其中CsPYL3基因对盐碱处理的负响应最强烈，随着氯化钠处理时间的延长，基因响应越强。CsPYL1，CsPYL4-6，CsPYL15基因呈现上调表达，且响应程度相似。CsPYL2则随着处理时间的增加，由正响应转为负响应的过程。在低温处理下，除CsPYL2和CsPYL15无转录组数据外，CsPYLs基因家族大部分呈现下调表达，其中CsPYL4，CsPYL5的负响应最强烈；只有CsPYL1和CsPYL14为上调表达，且CsPYL1的正响应强烈。

CsPP2CAs基因家族在不同非生物胁迫处理下的表达呈现差异性。在干旱处理下，CsPP2CAs基因家族成员全体呈现上调表达，且干旱处理时间越长，表达量越高；其中CsPP2CA1的响应值最高。在盐碱胁迫下，CsPP2CAs基因家族呈现不同的表达模式，其中CsPP2CA3的基因表达量逐渐上升，且随着处理时间的延长，响应值越高；CsPP2CA基因家族其他成员均呈现为先下降后上升的表达模式，CsPP2CA6在处理的1-2天内的表达量迅速下降，而在第3天又回到初始水平。在低温胁迫下，除CsPP2CA1无转录组数据外，CsPP2CA基因家族成员大部分呈现上调表达，其中CsPP2CA5-6对低温胁迫的正响应最高。而CsPP2CA4在低温处理下，随着处理时间的变化，基因表达量为先上升又下降。

CsSnRK2s基因家族在不同非生物胁迫处理下的表达同样呈现差异性。在干旱胁迫处理下，CsSnRK2s基因家族成员大多数为下调表达，其中CsSnRK2.2，CsSnRK2.5-7的表达量降低最多。CsSnRK2.4则呈现为正响应，在干旱处理第二天达到最高点。在盐碱处理下，CsSnRK2s基因家族基本呈现下调表达，其中CsSnRK2.5随着处理时间的增加，表达量逐渐降低；CsSnRK2.3，CsSnRK2.6的表达量呈现先下降后上升的趋势。在低温处理下，CsSnRK2.2，CsSnRK2.4-5呈现为正响应，其他家族成员则不显著。

图3.4 不同非生物胁迫处理下CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因表达热图

Fig.3.4 Heatmap of gene expression of CsPYLs/PP2CAs/SnRK2sunder different abiotic stresses

3.4干旱处理下，不同品种茶树中CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s表达情况分析

为研究不同茶树品种在应对干旱处理下的调节机制，ABA信号转导家族是否承担不同功能。根据实验室张显晨老师课题组前期实验筛选出茶树干旱耐受型与敏感型品种，其结果选择了干旱耐受型：“中茶108”；干旱敏感型：“软枝乌龙”两个品种为研究对象，对照组培养液为小西茂毅营养液，处理组培养液为小西茂毅营养液及200 g PEG，处理5天后取样。分别取根部和叶部然后取相同部位的叶片及新发的嫩根，进行CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因的表达量检测。结果如图3.5所示，A为不同品种CsPYLs家族在干旱处理下的表达结果，B为为不同品种CsPP2CAs家族在干旱处理下的表达结果，C为为不同品种CsSnRK2s家族在干旱处理下的表达结果。

不同品种的CsPYLs基因家族成员在干旱处理下表达呈现差异性，且在不同器官也出现表达差异性。CsPYL1在干旱耐受型“中茶108”中，叶部的表达量显著下调，而在根部则变化不显著；在干旱敏感型“软枝乌龙”中，叶部的表达量明显的上升，在根部却略微下调。CsPYL2和CsPYL3的表达模式呈现一致性，在“中茶108”中，两个组织器官的表达量略有上升或无明显变化；而在“软枝乌龙”中两个组织器官则是显著下调表达。CsPYL4在不同品种不同器官均出现差异表达，在“中茶108”中，叶部表达量无显著变化，在根部则增长一倍表现为正响应；在“软枝乌龙”中，叶部表达量呈正响应且成倍数增长，在根部则呈现负调控。CsPYL6、CsPYL7、CsPYL9在“中茶108”中无显著变化，在“软枝乌龙”中叶部表达量显著上调，在根部无显著变化。CsPYL5、CsPYL8较稳定，在两个品种两个组织器官均无显著变化。CsPYL14未测出。CsPYL15在叶部未测出，在“中茶108”中根部为上调表达，而在“软枝乌龙”中则为下调表达。

不同品种的CsPP2CAs基因家族成员在干旱处理下表达呈现差异性，且在不同器官也出现表达差异性。在干旱敏感型“软枝乌龙”中，CsPP2CAs基因家族成员在根部和叶部均为上调表达，且CsPP2CAs基因家族成员在叶部的响应值远高于在根部的响应值。在干旱耐受型“中茶108”中则出现差异性，CsPP2CA1、CsPP2CA3-4、CsPP2CA6在叶部表达量呈下调表达，在根部则为上调表达。CsPP2CA2、CsPP2CA5在叶部位下调表达，在根部则无显著变化。

不同品种的CsSnRK2s基因家族成员在干旱处理下表达呈现差异性，且在不同器官也出现表达差异性。CsSnRK2.1-2，CsSnRK2.4的表达模式相似，在干旱耐受型“中茶108”中，根部与叶部两个器官表达量均无显著变化，在干旱敏感型“软枝乌龙”中，叶部表达量显著增加，根部则表现为下调表达。CsSnRK2.3在“中茶108”中，两个组织部位的表达模式呈现一致性，在干旱处理下均为上调表达；在“软枝乌龙”中，两个组织器官的表达量均无显著性变化。CsSnRK2.5在干旱耐受型“中茶108”中则表现为下调表达；在干旱敏感型“软枝乌龙”中，叶部表达量略微上升，根部则为显著的下调表达。CsSnRK2.6-7在“中茶108”中，根叶两个组织器官的表达量均略微上升，在“中茶108”中则表现为下调表达。CsSnRK2.8在两个品种，根部和叶部均为上调表达。

图3.5 干旱处理下，不同品种茶树中CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s家族基因相对表达的变化

Fig.3.5 Relative expression changes of CsPYLs/PP2CAs/SnRK2sfamily genes in different tea varieties under drought treatment

3.5 ABA处理下，CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s表达情况分析

为了研究CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个基因家族对ABA响应的表达模式，我们选择“舒茶早”为实验材料，在的小西茂毅营养液中培养，待长出新根后，用0.25 mM ABA分别处理0 h，0.5 h，2 h，6 h，24 h，然后取相同部位的叶片及新发的嫩根，进行CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因的表达量检测。结果如图3.6所示，A为CsPYLs家族在ABA处理下的表达结果，B为CsPP2CAs家族在ABA处理下的表达结果，C为CsSnRK2s家族在ABA处理下的表达结果。

CsPYLs基因家族成员在ABA处理下表达呈现差异性，且在不同器官也出现表达差异性。其中CsPYL6基因两个组织部位在ABA处理下均呈现下调表达，在叶部随着处理时间的增加，表达量持续下降。CsPYL1基因则刚好相反，两个组织部位在ABA处理下均呈现上调表达，在叶部，处理2 h时后表达量升至最高点。CsPYLs其他家族成员在ABA处理下则呈现空间差异性。在根部，CsPYLs基因大部分呈现下调表达；其中CsPYL2、CsPYL4和CsPYL15的表达量下降幅度较大，且随着ABA处理时间的增加，表达量持续下降。CsPYL7和CsPYL9的表达量在ABA处理2 h时下降至最低点，而后略有上升基本不变；而CsPYL8和CsPYL14则为上调表达，其中CsPYL14的响应最高。在叶部，CsPYLs基因大部分呈现上调表达，且基本为先上升至最高值而后下降。其中CsPYL1和CsPYL5对ABA处理正响应值较高。而CsPYL6和CsPYL14则为下调表达， CsPYL6随着ABA处理时间的增加，表达量持续下降，CsPYL14则在ABA处理2 h时下降至最低点，而后略有上升。

CsPP2CAs基因家族成员在ABA处理下呈现差异性表达。部分家族成员出现空间差异性，CsPP2CA7在叶部为上调表达，随着ABA处理时间的增加，表达量呈现先上升而缓慢下降在上升的趋势但始终高于0 h；在根部则为下调表达，在处理24 h后才呈现正响应。CsPP2CA5和CsPP2CA8则刚好相反，在根部为上调表达，且随处理时间的增加，表达量持续上升；在叶部，表达量表现为先下降而又维持稳定。CsPP2CA1在根部和叶部均为正响应，其中在根部的响应较强烈，且随ABA处理的时间增加，表达量持续增加。CsPP2CA2、CsPP2CA4在根部和叶部均为负响应。

CsSnRK2s基因家族成员在ABA处理下表达同样呈现差异性。CsSnRK2.4、CsSnRK2.5在根部叶部均为正响应，且随处理时间的增加，表达量持续上升，在处理24 h到达最高点；在叶部，CsSnRK2.4表现为先上升后下降的趋势，在处理24 h时表达量与0 h无显著差异，CsSnRK2.5则在处理0.5 h后上升又维持稳定表达。CsSnRK2.1在ABA处理下表达量呈现时空差异性，在根部CsSnRK2.1为先下降后上升的表达模式，在叶部则为先上升后下降的表达模式。CsSnRK2.6在根部及叶部均呈现负调控，在处理6 h后，根部表达量逐渐上升至初始水平。CsSnRK2.3，CsSnRK2.8表达模式相似，在根部呈负调控，在叶部表达量交稳定。

图3.6外源ABA处理对茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因相对表达的变化

Fig. 3.6 Changes of relative expression of CsPYLs/PP2CAs/SnRK2sgene in tea trees after ABA treatment

3.6 ABA家族互作网络研究与验证

3.6.1 ABA信号转导家族相关性分析与互作网络图

茶树对于干旱的调控机制依赖于对信号的感知与传导，为研究ABA信号在茶树体内接收传导过程，将ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s在外源ABA处理下，根和叶两个组织器官在0 h，0.5 h，2 h，6 h，24 h五个时间点的表达量使用SPSS软件进行相关性分析。如图3.7所示。将相关性大于0.8的基因挑出，使用Cytoscape v3.3.0软件进行绘制ABA信号转导层级图。共挑出三组，CsPYL4、CsPYL7、CsPYL9、CsPYL15与CsPP2CA2，CsPP2CA2与CsSnRK2.8为一条信号传递路线；CsPYL2、CsPYL3与CsPP2CA1，CsPP2CA1与CsSnRK2.7、CsSnRK2.8为一条信号传递路线；CsPYL6、CsPYL14与CsPP2CA8，CsPP2CA8与CsSnRK2.6为一条信号传递路线。如图3.8所示。

图3.7外源ABA处理对茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因相对表达相关性分析

Fig. 3.7 Correlation analysis of relative expression of CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s gene in tea trees after ABA treatment

图3.8 ABA信号转导层级图

Fig.3.8 Hierarchy diagram of ABA signal transduction

3.6.2CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s部分基因的克隆及表达

为了进一步验证CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s之间的相互关系，根据ABA处理表达量的相关性分析结果，将相关性大于0.8的基因进行克隆。基于从TPIA网站上获取的CDS序列，克隆出了CsPYL4，CsPYL6，CsPYL7，CsPP2CA2，CsSnRK2.8五条基因。其中CsPP2CA2克隆所得全长为1254 bp，CsSnRK2.8克隆所得全长为1254 bp，与从基因组获得CDS序列略有偏差。如图3.9所示，1为CsPYL4（660bp）；2为CsPYL7（561bp）；3为CsSnRK2.8（1014bp）；4为CsPP2CA2（1254bp）；5为CsPYL6（666bp）。

图3.9PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

Fig.3.9Agarose gel electrophoresis of PCR products

将得到的目的片段使用与pGEX-4T-1、pET-32a表达载体进行连接诱导表达，并使用SDS-PAGE方法对诱导表达的蛋白进行验证，在表达菌株Rosetta中， CsPYL7、CsPYL6、CsPP2CA2、CsSnRK2.8均表达出相应蛋白。如图3.10所示。

图3.10SDS-PAGE电泳验证蛋白表达

Fig 3.10SDS-PAGE Electrophoresis to Verify Protein Expression

3.6.3 酵母双杂

为了验证CsPYLs和CsPP2CAs，CsPP2CAs和CsSnRK2s之间的互作关系，采用了酵母双杂交实验进行验证。使用In-Fusion的方法将目的片段间接表达载体pGADT7（AD）及pGBKT7（BD），共转酵母Y2H Gold，然后将转化后的酵母感受态分别涂抹在二缺培养基（SD/-Leu/-Trp）上，待二缺培养基上长出单菌落后，再将菌落稀释成10倍、100倍打点培养在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-GAL/AbA培养基上，研究正常情况下CsPYLs 和 CsPP2CAs 、CsPP2CAs和CsSnRK2s之间的互作；同时，将稀释成不同浓度的酵母菌落涂抹在添加10 μM ABA的SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-GAL/AbA培养基上，研究ABA存在的情况下，CsPYLs 和 CsPP2CAs 、CsPP2CAs和CsSnRK2s 之间的互作关系。采用的阳性对照为pGADT7-T、pGBKT7-53，阴性对照为pGADT7-T、pGBKT7-Lam。3-4天后观察实验结果，结果图3.10所示。

实验组、阳性对照、阴性对照在SD/-Trp/-Leu培养基上均能生长，且菌落大小，形状一致，说明AD载体与BD载体均成功转入Y2H Gold酵母中。阴性对照在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-GAL/AbA平板上没有出现菌落，而阳性对照在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-GAL/AbA平板上可以生长，且菌落颜色变为蓝色。CsPP2CA2与CsSnRK2.8在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-GAL/AbA培养基上能够正常生长，说明CsPP2CA2与CsSnRK2.8存在相互作用；但在添加ABA与不添加ABA的情况下，生长状况一致，说明CsPP2CA2与CsSnRK2.8之间的相互作用不依赖ABA。CsPYL4，CsPYL7与CsPP2CA2在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-GAL/AbA培养基上能够正常生长，其中在添加了ABA的培养基上的生长状态明显比不添加ABA的培养基生长状态要好，相互作用更强，说明CsPYL4，CsPYL7与CsPP2CA2之间的相互作用依赖ABA。而CsPYL6与CsPP2CA2在SD/-Trp/-Leu培养基上能够正常生长，但在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-GAL/AbA培养基上不能够正常生长，说明CsPYL6与CsPP2CA2不存在相互作用。证明了ABA信号转导家族信号传导路线的准确性。

图3.11CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s酵母双杂互作结果

Fig. 3.11Double hybrid interaction results of CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s yeast,

4讨论

ABA是一种天然的、植物自身合成的关键植物激素，参与调控植物生命活动的各个方面，也是一种抗胁迫激素，响应各种生物和非生物胁迫[1, 2]。关于ABA信号在植物体内的接收、传导一直是研究的热点。但对于ABA信号在茶树体内的接收、转导，ABA信号转导家族的调控表达还不清楚。本论文通过研究茶树ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族的表达模式、在逆境胁迫中的表达模式、相互之间的互作关系来更好的诠释和解析茶树ABA 信号转导通路，为进一步研究和完善ABA信号转导通路提供参考。

4.1 CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因结构分析

关于ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s的研究在拟南芥[48][57, 58]，水稻[50][61]，大豆[51]，小麦[75]等植物中均有报道。在拟南芥中含有14个CsPYL基因[48]，9个CsPP2CA[64]，10个CsSnRK2基因[77]。本实验通过与拟南芥水稻CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s进行序列比对，检索到15个CsPYL基因，其中有3个基因有大片段缺失（CsPYL11-13）被认为可能不具备功能；8个CsPP2CA基因，8个CsSnRK2基因。经过系统进化树分析茶树CsPYL基因家族成员被分为三个亚家族，茶树CsPP2CAs基因家族成员被分为两个亚家族，茶树CsSnRK2基因家族成员被分为三亚家族。基因结构分析结果发现CsPYLs、PP2CAs结构保守，每一亚家族内含子数量相似。蛋白质理化性质分析基因序列与蛋白分子量大小相似。CsSnRK2s基因家族结构差异较大，其中CsSnRK2.2有3个内含子，CsSnRK2.3有13个内含子，蛋白分子量最大为67kD。而拟南芥，小麦，马铃薯等植物中SnRK2成员内含子均为8个，蛋白分子量大小为40kD[75]。推测可能是因为基因组拼接出现冗余导致的结果不一致性。这一结果表明CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族和其他植物的同源基因在进化过程中高度保守，说明他们可能发挥同样的功能。

4.2CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族具有多样化的表达模式

为分析ABA信号转导家族的表达模式，从TPIA及NCBI网站获得了CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族不同组织器官及非生物胁迫的转录组数据，以及对水培茶苗施加0.25mM ABA处理，并对茶树根与叶部的CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因表达水平进行检测。将获得的数据均一化处理后，发现CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s呈现多种不同的表达模式，存在明显的时空特异性响应。

CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因的表达具有组织偏好性。CsPYL1在新梢部位和根部表达量较高，CsPYL2/9在衰老叶和花中表达量高，CsPYL14在根及花中表达量交高，CsPYL15在根及种子中表达量较高，其中，CsPYL3在根中表达量最低。CsPP2CA3/6在根部表达量较高；而CsPP2CA7则在茶树嫩梢部位表达量较高；CsPP2CA4在各个组织器官中的表达量较高；CsPP2CA1在各个组织器官中的表达量都低。CsSnRK2.1/8在茎中表达量较高，CsSnRK2.3在各个组织器官中的表达量都高。CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因对胁迫的响应（如干旱，低温，盐胁迫）表现出主次性，有些基因受胁迫的诱导，如CsPYL1，CsPYL4/5，CsPYL15，CsPP2CA1，CsPP2CA3，CsPP2CA5/6，CsSnRK2.4/5；有些基因不受胁迫诱导，如CsPYL7，CsPYL9，CsPP2CA2，CsPP2CA8，CsSnRK2.8。说明CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s应对胁迫施行不同的功能，有些基因起主要作用，有些基因起辅助作用或不发挥功能。CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因对ABA的响应表现出多样性，有些基因受ABA上调表达，有些基因受ABA下调表达。CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因多样化的表达模式说明其在茶树生长和发育过程中发挥着多种不同的生物学功能。

4.3 ABA信号在CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族中传递存在选择性

ABA在植物受到胁迫时，发挥功能依赖于ABA信号转导家族PYLs/PP2CAs/SnRK2s，田晓杰研究发现在水稻中OsPYLs与OsPP2Cs之间的互作存在选择性[1, 7]。为探究ABA信号在茶树体内的传递过程，将ABA处理下CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族表达结果进行相关性分析，并根据相关性分析结果进行了ABA信号转导网络图预测。酵母双杂互作实验发现，同属于一条网路的CsPYL4、CsPYL7与CsPP2CA2之间存在互作，CsPP2CA2与CsSnRK2.8存在相互作用。而CsPYL6与CsPP2CA2之间则不存在互作。这一结果说明ABA信号在CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因家族中传递存在选择性，ABA信号转导网络图具有可参考性。

5结论

利用茶树基因组数据库，鉴定出了15个茶树CsPYLs基因，8个茶树PP2CAs基因，8个茶树SnRK2s基因，分别命名为CsPYL1-15，CsPP2CA1-8，CsSnRK2.1-8。完成了CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s进化树的构建，并进行基因结构分析与蛋白理化特性分析。其中CsPYL11-13三个基因有大片段缺失被认为可能不具备功能。三个家族（除CsPYL11-13）在不同组织器官均有表达，且表现出差异性。CsPYL4在成熟叶及根茎中表达量高，CsPYL5在嫩叶及花中表达量较高，CsPYL9在茶籽中表达量较高。CsPP2CA3在根中表达量较高，CsPP2CA8在地上部位表达量较高，CsPP2CA4在所有组织器官中表达量都较高。CsSnRK2.3在所有组织器官中表达量都较高，CsSnRK2.8在叶部表达量较高。

根据NCBI网站获取的CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s在干旱，盐碱，低温冷害处理下的转录组数据，进行分析。CsPYL家族在干旱、盐碱和低温胁迫下呈现差异性，CsPYL1对低温胁迫的正响应值最高；CsPP2CA家族对干旱的响应呈现一致性，干旱处理下CsPP2CA家族成员呈现上调表达，CsPP2CA1的响应值最高。CsSnRK2家族则大多为下调表达。从结果来看，三个基因家族应对不同非生物胁迫表达量不同，说明各个家族成员应对胁迫发挥的功能不同。

干旱处理下，不同品种茶树的ABA信号转导家族CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s基因表达呈现不同的响应模式。其中干旱敏感型品种“福云6号”中，CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个家族的响应程度明显高于干旱耐受型品种“中茶108”。结果表明不同茶树品种的耐旱分子机理呈现差异性。

根据ABA处理后，茶树CsPYLs/PP2CAs/SnRK2s三个家族的荧光定量结果的相关性分析情况，绘制出三条茶树ABA依赖型信号转导途径。CsPYL4、CsPYL7、CsPYL9、CsPYL15与CsPP2CA2，CsPP2CA2与CsSnRK2.8为一条信号传递路线；CsPYL2、CsPYL3与CsPP2CA1，CsPP2CA1与CsSnRK2.7、CsSnRK2.8为一条信号传递路线；CsPYL6、CsPYL14与CsPP2CA8，CsPP2CA8与CsSnRK2.6为一条信号传递路线。成功克隆出CsPYL4，CsPYL6，CsPYL7，CsSnRK2.8，CsPP2CA2五条基因。并将得到的基因连接酵母双杂载体进行酵母双杂交，CsPYL4、CsPYL7与CsPP2CA2之间存在互作，CsPYL6与CsPP2CA2之间不存在互作，CsPP2CA2与CsSnRK2.8存在相互作用。结果表明ABA信号在茶树体内传递过程中有选择性。