IRF9下调SIRT1在急性胰腺炎发生发展中的作用及机制研究

1.引言

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是由胰腺的急性炎症所引发的一种疾病。该病在临床上常见，国内外均报道具有很高的发病率和死亡率，发病过程中涉及多器官功能紊乱及细胞因子释放增加[1,2]。近年来AP的发病率呈升高趋势[3]，约20%～30%的AP患者可发展为SAP。该病死亡率高达15%～30%，导致局部及全身并发症，且预后不良，严重威胁到人类生命健康[4,5]。

AP[6]的起源被认为是胰腺腺泡细胞，发病原因是过度激活的胞内胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶消化胰腺组织，胰腺水肿或坏死而致胰腺炎。1896年，Chiari[7]发现十二指肠中的胰蛋白酶可活化为胰蛋白酶而激活其他酶，以此提出酶过早激活消化胰腺的概念。

敲除胰蛋白酶原7基因的小鼠被用来研究蛋白酶原的作用，该类小鼠早期腺泡内胰蛋白酶原的激活功能病理学缺失。该类小鼠对于研究胰蛋白酶原的激活可影响胰腺损伤过程。该小鼠与雨蛙素AP小鼠相比[8]，细胞死亡数明显降低、腺泡坏死率降低50%。腺泡细胞的死亡与腺泡内胰蛋白酶原的活化有不可分割的作用，但该实验却缺乏腺病毒介导的活化胰蛋白酶在腺泡内表达引发小鼠的胰腺炎的机制说明。还有实验研究[9]显示，腺泡细胞的死亡，与腺病毒介导的活化胰蛋白酶原的表达具有重要联系，但其中的机制模糊不清。

IRF(interferonregulatory factor)对病毒诱导的IFN-α和IFN-β基因表达具有调节作用。后来发现IRF还能调控II型和III型干扰素基因的表达。迄今为止，已经发现了9种IRF：IRF1～9[10]。在过去数十年里，有足够多的的实验证明[10,11,12,13]显示IRF对转录调控、免疫调控、细胞因子信号转导、自稳平衡等多方面发挥着不可替代的作用。IRF参与多种疾病的发生过程，包括炎症性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥症以及肿瘤发生及心血管疾病等[10,11,14,15,16]。

IRF9是干扰素刺激基因因子3的组成部分，参与启动多个干扰素刺激基因，产生抗病毒应答作用。它在治疗疾病、病原体分离中具有十分重要的作用，但目前对于其功能机制研究，仅局限于STAT1和STAT2。对于其对转录、翻译的调控机制以及促进和减少炎症功能可作为未来研究方向。此外亦有研究证明[17]，c-Myc原癌基因上调了IRF9的表达，表明在肿瘤发生中有IRF9的参与作用。IRF9可在胰岛素分泌以及损伤修复中发挥重要作用，但是其在AP的发挥的作用和机制暂未见相关文献报道。

SIRT1是sirtuin家族蛋白之一，是依赖于NAD+的HDAC，主要位于细胞核内。近期有文献报道在急性胰腺炎小鼠模型中，SIRT1的表达显著下调，乙酰化酶活性下降，p53及NF-κB的酰化水平增加。SIRT1的敲低诱导了炎症反应及细胞死亡，加重胰腺炎病程[18]。近年来有文献报道IRF9能够直接下调组蛋白去乙酰化酶SIRT1的表达，抑制SIRT1的去乙酰化酶活性，增加下游靶蛋白，例如p53，NF-κB等蛋白的乙酰化水平，从而参与炎症反应、细胞凋亡、增殖以及迁移等过程[19,20,21,22,23,24,25]。例如，在AML患者中，IRF9表达下调，SIRT1表达上调，p53乙酰化水平下降且下游靶基因的表达下调；敲低IRF9能够上调SIRT1的表达，促进细胞克隆、增殖形成；过表达IRF9则有着相反的结果。IRF9是SIRT1的一个负调节因子，能够靶向下调SIRT1的表达，增加p53的乙酰化水平，促进p53靶基因的表达，阻制细胞生长，诱导细胞凋亡，阻止AML的进一步发展[25]。因此IRF9靶向下调SIRT1参与了细胞死亡、繁殖、迁移以及炎症反应等过程，调节着多种疾病的发生发展过程。

在急性胰腺炎中，IRF9是否通过下调SIRT1的表达来调节细胞凋亡、增殖和迁移等过程，进一步影响细胞内炎症反应，国内外未见相关报道。本实验内容在于探究IRF9基因在AP中所起的效用，研究可能存在的分子机制。故本实验将大鼠AR42J胰腺腺泡细胞系作为研究对象,选用雨蛙素诱导AR42J胰腺腺泡细胞，结合qRT-PCR、WesternBlot、流式细胞术、MTT法、Transwell等手段，敲低IRF9后检测SIRT1、p53及乙酰化P53水平，检测细胞凋亡、增殖及迁移等情况，进一步探讨IRF9靶向下调SIRT1在AP的发生发展中的分子机制，通过对靶基因功能的理解,对疾病诊断和治疗提供理论指导。

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1.主要仪器与试剂

2.2方法

2.2.1细胞培养:

培养基（DMEM培养基100：胎牛血清10：青链霉素1），培养箱环境为37℃、5%CO2，2天更换培养基一次。

验收：在超净台中严格无菌操作，静置2h，而后镜下观察，以80%汇合度为界限，未达到80%需要去除旧培养基添加新鲜培养基再次培养。复苏：取出冻存的细胞，迅速于37℃水浴锅中摇晃解冻，超净台中移入离心管并加入5ml培养基，以1000r/min离心5min，于超净台中倒出上清液，而后添加6ml新培养基，轻轻吹打制造细胞悬液，而后移入培养瓶，放入培养箱中培养24h，视细胞状态，考虑传代。3）传代：按如下步骤进行传代：

　　4）冻存：

收集状态良好的细胞（细胞汇合度达到80%），离心除去旧培养基，用含10%DMSO的血清使细胞重悬，同时转存冻存管中病加入细胞冻存液（含异丙醇），在-80℃稳定冻存，或移入液氮罐冻存。

2.2.2.细胞模型的构建及效果评价:

①细胞模型构建：取对数生长期的AR42J细胞接种于6孔板中，待其细胞密度达到60%-80%时，分为空白对照组和实验组，每组设置3个复孔，空白对照组加入正常培养基，实验组加入含100nmol/L雨蛙素培养基,分别培养0、2、6、12、24、48小时。

②模型效果评价：分别提取不同时间段后的蛋白,用Western Blot法检测各组TNF-α蛋白的表达。另收集不同时间段的细胞上清用ELISA法检测炎症因子水平。蛋白提取步棸及Western Blot法下文会详细叙述，在此详细介绍ELISA实验方法。

ELISA法检测AMY、TNF-α、IL-1β浓度：

准备试剂以及微孔板；使用1x洗液洗板，洗液在微孔板中持续浸泡30s；而后倒出洗液，而后立即使用微孔板；标准品2倍稀释，设置复孔空白孔并加入100μl稀释标准品；使用移液枪将20μl样本加入样本孔并加入80μl1x检测缓冲液；5）抗体稀释，每孔中加入50μl稀释抗体；

6）封板振荡（300 r/min），室温孵育2h；

7）倒出液体，再次洗板，重复6次；

8）加入100μl稀释链霉亲和素至每个孔；

9）所有操作流程过后，封板震荡，而后静置45min；

10) 再次洗板6次；

11) 加入100μl显色底物，并避光，室温下静置30min；

12) 加入100μl终止液，孔中颜色需由蓝变黄。

13）检测OD值：30分钟内检测450nm以及570nmOD值；校准OD值=OD450-OD570。

14）计算出数值。横坐标：标准品浓度，纵坐标：校准OD值，使用EXCEL软件制作标准曲线以及计算回归方程，而后将校准OD值代入计算样本浓度。

2.2.3.IRF9-siRNA转染AR42J细胞：

沉默IRF9：使用Lipo2000 TM转染IRF9沉默的si-RNA，空载作阴性对照。

按如下步骤进行转染：

胰酶消化；消化后将细胞均匀接种到6孔板中（密度一致）；加入2ml不含双抗的培养液到6孔板中；待细胞贴壁后，弃培养液，PBS洗2次；避光向6孔板中加入1500ul Opti-MEM(x1）；设置分组，分为六组，上面3个孔分别为不用雨蛙素诱导的：正常的胰腺AR42J细胞为空白对照组,N-siRNA转染的胰腺AR42J细胞为阴性对照组，siIRF9转染的胰腺AR42J细胞为实验组，下面3个孔分别为雨蛙素诱导的：急性胰腺AR42J细胞，N-siRNA转染的胰腺AR42J细胞为阴性对照组，siIRF9转染的胰腺AR42J细胞为实验组。分别将每组孔的药加好：取6个无酶EP管，先加无雨蛙素诱导组的3个孔：空白对照组：每孔加入250μl Opti-MEM，其中一管中加5μlLipofectamine2000，另一管不加。阴性实验组：一管加5μlliop2000，另一管加5μl N-siRNA。阳性实验组：其中一管加5μl Lipofectamine2000，另一管加5μl siIRF9充分混匀。有雨蛙素诱导组的3个孔：空白对照组、阴性实验组和阳性实验组三个孔加药方法同无雨蛙素诱导的三个孔加药方法一致；加药后避光静置5min，药物混匀再避光静置20min；分别将这6组药加入分组为无雨蛙素诱导和有雨蛙素诱导的空白组、阴性实验组以及阳性实验组的板孔中；加药结束后，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养6h，培养结束后使用PBS洗2次，再换上2ml细胞培养基(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J细胞)，培养24h。此种siIRF9转染AR42J细胞实验重复无三次。

注意事项：

1）适当进行细胞传代，以提高转染效率、稳定性并减少毒性，所有细胞传代次数需要一致；

2）为防止局部复合物浓度过高乃至高细胞毒性，不可使用其他试剂稀释核酸或转染试剂，直接将核酸及转染试剂混匀。复合物以及培养基混匀后，静置六孔板；

3）使用无双抗的opti培养基混合复合物，37℃恒温培养6h拍照，而后更换普通培养基。若首次转染效率不佳，可在转染24h后再次添加复合物转染，提升转染率。

2.2.4.qRT-PCR检测IRF9-siRNA对胰腺AR42J细胞中IRF9mRNA、SIRT1mRNA相对表达量的影响：

细胞成功转染24h后，进一步提取RNA,检测IRF9mRNA、SIRT1mRNA的表达。步棸如下：

提取总RNA：

超净台操作，使用移液器吸出六孔板中培养基，1ml PBS冲洗2次，而后吸净残留，加入1ml TRIzol试剂，置于摇床上慢摇10min，需低温放置，促使其充分裂解。使用移液枪将六孔板中混合试剂转移至1.5ml 无酶EP管中，再加入TRIzol试剂体积的五分之一即200μl氯仿，加入完成后，上下摇晃15次，使其充分混匀。而后置于冰上静置5min，待分层完全后放置于离心机（4℃，13200r/min）离心15min。使用移液枪小心转移200μl上层水相至另一个1.5ml 无酶EP管中，同时加入等体积异丙醇，15次上下振荡，充分混匀后于-20℃冰箱中静置30min，然后取出，于低温离心机（4℃，13200r/min）离心15min。弃上清，使用提前配好的75%乙醇1ml将所得RNA沉淀物洗涤，于低温离心机（4℃，13200r/min）离心5min，而后弃上清，并将吸水滤纸剪成长条状，伸入EP管中吸出可见的液体。将EP管静置30min，需倒置放于吸水滤纸上，干燥至一定程度（切忌不能完全干燥）后将20μlDEPC水加入其中，充分振荡混匀，保存于-80℃冰箱，处理后的样本可于-80℃冰箱中长期保存。

逆转录步骤：

从-80℃冰箱取出已经经过处理的样本总RNA，使用定量PCR检测仪对总RNA实施定量检测。取200μl无酶EP管一只，依靠定量检测而后计算RNA溶液所需量，同时加DEPC水，总容量需至8μl，而后将2ul Takara逆转录试剂盒中的Mix试剂加入其中，总体系容量需要达到10μl，而后将100ul DEPC水加入其中，并将混合物充分振荡混匀。将混合所有试剂的EP管放置于逆转录使用仪器中，启动逆转录程序，逆转录程序条件如下：37℃预热16min，90℃解链5秒钟，5℃退火12min。所有逆转录程序结束后，将逆转录所得cDNA放置于-80℃冰箱中保存。

qRT-PCR步骤：

引物配制：实验中所需要使用到的引物其序列如下图所示。将装有引物粉末的EP管放置于离心机（3000r/min）离心1min，尽量使其不沾壁，而后取出后轻轻开启EP管管盖，根据引物说明书，将适量DEPC水加入到EP管中进行稀释，而后盖上瓶盖，放置于振荡仪上振荡，使其充分混匀。再另取一200μl无酶EP管，将190ul DEPC水加入其中，并使用移液枪吸取出5μl正义引物及5μl反义引物加到无酶EP管中，标记并且放置在振荡仪上，充分混匀后将其置于-20℃冰箱中保存。

取出逆转录后得到的合格的cDNA样品，在超净台中严格无菌操作，取无酶100μl八联排管，按表中反应体系制作反应试剂，而后将准备好的10μl体系全部置于八联排管中，使用迷你离心机使其振荡充分混匀，而后将把脸排管置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应，反应设置的条件为：：95℃ 加热10min，95℃变性 15s，60℃ 退火30s，此程序循环次数为45次。反应体系如下：

整个PCR反应流程约需要2小时，待反应结束后，可依靠仪器获取目的基因的CT值，使用2-△△Ct法可计算出目的基因相对表达值，计算出表达值后，使用电脑软件绘制柱状图。

注意事项：

避免反复冻融所提取的RNA、cDNA以及逆转录试剂，可避免RNA的降解以及降低酶的活性。使用前将逆转录试剂及相关PCR反应试剂上下颠倒以充分混匀其中各种试剂成分，可避免反应体系的总体积与实际不符，确保定量结果的准确性。此外，使用过程中吹打力度需要轻缓，若试剂产生泡沫，需要再次放于离心机中离心至无泡才可使用试剂。

3）PCR试剂盒中含有荧光染料SYBR Green I，此物质遇光易挥发，故配制混合体系时应避光操作。

4）空气中微量DNA气溶胶可能会导致灵敏度高的实验试剂受到污染，从而导致实验结果出现偏差甚至错误，为避免这种实验试剂受到污染，应在超净台中配制相应反应体系，严格按照无菌操作流程操作。另外，使用的相关器材需要保证无菌无霉。

2.2.5.Western Blot法检测IRF9-siRNA对胰腺AR42J细胞中IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53蛋白表达的影响：

Western Blot法分别检测无雨蛙素诱导的和有雨蛙素诱导的空白对照组、N-siRNA组、siIRF9转染24h后的胰腺AR42J细胞中的IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53蛋白的表达情况。

细胞蛋白提取：

将胰腺AR42J细胞消化后，以相同的数量接种到6孔板中，待细胞贴壁，弃培养液，PBS洗2次，加入培养基至空白对照组(DMEM配的培养基用于AR42J细胞)，阴性实验组加入N-siRNA，阳性实验组加入沉默siIRF9处理4h-6h后用PBS洗2次，再换上细胞培养基：(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J细胞)，每孔加2ml，培养24h。PBS清洗细胞，在培养板中加入蛋白裂解液裂解细胞，上离心机进行离心13200r/min，4℃,20min，上清液就是所要的蛋白液；提取的蛋白液要用BCA试剂盒检测蛋白浓度后再分装保存。根据测定的不同的蛋白浓度，加入5×load-ingbuffer(比例为4∶1)和相应体积的总蛋白样品，混匀，蛋白液要在干浴锅中煮100℃10min，变性后才能用，煮好的蛋白样本放在－20℃冰箱中保存。

细胞蛋白Western Blot方法：

1）SDS-PAGE电泳 将已经过处理且变性的蛋白样品使用移液器转移至含有浓缩胶的孔中，而后将5μlmarker添加至另一个样品加样孔中。接通电泳仪电源，第一阶段电泳：将电泳仪电压设置为80V恒定电压，电泳时间设置为30分钟；第二阶段：第一阶段结束后，将电泳仪电压调整为120V恒定电压，持续电泳90分钟。第二阶段电泳持续到marker提示目的蛋白已于凝胶上分离，然后停止电泳。

2）转膜 电泳结束后，自电泳仪中小心取出凝胶，使用超纯水将凝胶表面电泳液清洗干净，注意保持凝胶完成性；事先需要准备好容器，并向容器中添加足量的转膜液，而后将凝胶以及转膜夹放入容器中浸泡；使用直尺及其他切胶器具将目的蛋白以及marker的凝胶切下，使用直尺测量其大小，而后裁剪大小相当的PVDF膜覆盖在胶条上（注意：PVDF膜在使用之前需要使用甲醇溶液浸泡30s激活），而后依次将凝胶和PVDF膜放在正负极明显的转膜夹中，转膜夹需要设置6层，从阴极侧到阳极侧分别为海绵垫片、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫片（注意每一步都需要去除气泡），放置好后将转膜夹扣紧并转入有足量转膜液的电泳槽中，转膜过程应保持低温，故应在电泳槽周围放入足量的冰渣，维持转膜过程中的低温环境，而后接通电源并将电流设置为200mA恒流，转膜时间设置为120min。

3）封闭 转膜结束后，回收转膜液，小心将转膜夹取出，而后细心取出PVDF膜，放置于容器中（注意，条带摆放不宜过于集中，最好一格一个条带），使用1 x TBST溶液将转膜液洗4次，洗涤过程中将容器放于摇床上，每次震荡5分钟。而后使用TBST溶液与脱脂奶粉混合（脱脂奶粉5g，TBST溶液100ml），两者混合后，使用震荡仪使其充分混匀，然后将处理干净的PVDF膜放置于混合物中开始封闭，室温摇晃封闭1.5h。

4）抗体孵育：①一抗孵育：封闭结束后，小心将PVDF膜取出，用1 x TBST溶液将转膜液洗4次，洗涤过程中将容器放于摇床上，每次震荡5分钟。洗涤结束后，将一抗IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53以及内参抗体β-actin分别足量添加到入目的条带中，然后将其放置于摇床上，于4℃环境下震荡孵育24h。

②二抗孵育：一抗孵育结束后，小心取出PVDF膜，使用1 x TBST溶液将留滞在PVDF膜表面的一抗洗去，洗4次，洗涤过程中将容器放于摇床上，每次震荡5分钟。洗涤结束后，将稀释的二抗（使用TBST，稀释比为1:5000）足量放入条带中，然后在室温下摇晃震荡60min。

5）显影 再次将条带使用1 x TBST溶液洗涤4次，期间放在摇床上快摇，5min每次，将二抗溶液洗去。按照ECL发光试剂盒使用说明书制备显影剂。而后取数个培养皿，将目的条带逐个放入培养皿中，并向培养皿中的条带滴加足量显影剂（操作过程需要避光进行），而后将滴加足量显影剂的条带放入自动凝胶成像系统中进行自动曝光，同时保留图像，使用Imaje-J处理拍摄的图像，分析目的蛋白的灰度值。

注意事项：

1) 显色液必须要新鲜配置使用。

2) 配胶时注意操作，有致癌液体，避免溅在身上。

2.2.6.流式细胞仪检测IRF9-siRNA对胰腺AR42J细胞凋亡的影响：

把胰腺AR42J细胞消化，按1×106接种到6孔板中，待细胞贴壁，弃培养液，PBS洗2次，分为雨蛙素诱导和无雨蛙素诱导的：空白对照组加入培养基，阴性实验组加入N-siRNA，阳性实验组加入沉默siIRF9,处理4h-6h后用PBS洗2次，再换上细胞培养基：(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J细胞)，每孔加2ml，培养24h。用不含EDTA的胰酶消化细胞，用15ml离心管收集，上离心机，离心500g，5min，弃上清液，用1mlPBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于105）然后500g离心5min，收集细胞。继而加入400ulBinding Buffer重悬细胞，再加入5ulAnnexin V-FITC/PI，所有操作需要轻缓，室温避光孵育染色15min。最后加入10ulPI染色，轻轻混匀冰浴避光5min。

注意事项：

操作时注意避光，反应完毕后尽快在1小时内检测。检测细胞数量需要达到1×106个，但不宜过多。不足量细胞的样本流动量大，检测时会相应增加变异系数，导致实验结果出现偏差甚至错误。同时，细胞数量过多，会导致按量配制的抗体或其他试剂相对不足，影响实验结果。在实验过程中，在确保实验科学性以及准确性前提下，可适当缩减实验工序。

      2.2.7.MTT试验

取转染成功后的AR42J细胞,细胞分组同上，每组处理设三个重复，将细胞在培养箱中常规培养，待细胞处于对数生长期时用0.25%胰蛋白酶常规消化，配置细胞悬液，分别加入96孔板中每孔加入100μl500个细胞，放入CO2（5%）培养箱中37C下培养以贴壁。按照实验需要，进行培养并给与10μl雨蛙素诱导。待24小时后，每孔加入20μl MTT工作液，在细胞培养箱内继续孵育4小时。四小时后待孔板底部出现少量紫色结晶并且40倍镜下观察细胞周围也出现时，实验课停止。而后吸取上清溶液（注意留存紫色结晶），待吸出干净，加入100μlDMSO。37℃孵育15min，待紫色结晶溶解完毕。在570nm测定吸光度。

注意事项：

细胞的接种密度一定不能太大，一般每孔500-1000个左右就够了，宁少勿多。尤其对于肿瘤细胞。10000/孔太多了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力，所以要熟练、快些上板。

     2.2.8.Transwell实验

取转染后细胞，细胞分组同上（分为6组），实验步棸如下：

1）消化，而后终止消化并离心弃培养液，PBS洗2次，无血清培养基（含BSA）重悬，细胞密度为3×105。

2）接种：

取200μl细胞悬液到Transwell小室；向24孔板下室加入600μl的培养基（含15%FBS）；培养24h。3）固定染色

取出Transwell小室，弃去孔中培养液。用PBS洗2遍，再用甲醛固定30分钟。后清洗风干，取800μl结晶紫于孔中，将小室放在上面25分钟。最后清洗显微镜下拍照。

计数：取若干个视野计数细胞个数，本实验选取3个视野，都是随机选取。注意事项：

1）细胞重悬时，个人认为不要超过5×105，具体实验室采用密度要自己摸索，因为不同细胞其侵袭能力有别，细胞量过多过少都会导致难以计数；

2）细胞数目差异会对实验结果产生影响，故对细胞应该同时计数；

3）细胞一般常规培养12-48h，主要依据侵袭能力而定。本实验采用的最佳培养时间为24h。

4）固定染色擦洗应擦净膜表面上未迁移的细胞，但避免擦除膜底细胞，保证计数准确。

2.2.9.荧光素酶基因实验

1 于转染前24h将细胞接种于12孔板中（1×105/孔），每孔细胞汇合度应达到60%，每组样品3个重复。

2 转染前半小时将完全培养基换无血清培养基0.5ml。

3 A液，按照实验需求进行分组，各三个复孔，各加入50μl无血清培养基，轻轻混匀，室温静置5min。

其中过表达质粒1μg，启动子质粒 1μg， pRL-SV40质粒0.2μg

4 B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体4ul与50μl无血清培养基混匀，室温放置5min；

5 将A液、B液混合，然后放置在震荡仪上震荡，使其充分混匀，而后室温放置15min。放置结束后，将混合液均匀滴加至12孔板中；

6将12孔板放置于37℃恒温箱中培养6h，然后用完全培养基替换无血清培养，再次放入培养箱中培养；

7萤光素酶报告基因检测：在转染后48h后，裂解细胞，使用双萤光素酶检测试剂盒，在化学发光仪上进行检测。

8在以Renilla萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的LUC值除以Renilla萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到比值来比较转录因子对启动子的活性。

注意事项：

基因在检测过程中易受到细胞及载体状态、转染及裂解效率、加样精度等多重因素的影响，同批次样品检测值可因这些因素出现浮动。故实验需要设置3个或3个以上复孔，同时使用其他基因作内参。培养细胞的时间宜在12-36小时之间，不宜过长，长时间细胞培养可能会导致细胞难以裂解。选择目标基因萤光虫荧光素酶：选取pGL-3或pGL-4载体或自身构建载体；海肾荧光素酶：选取phRL-TK或pGL-4代载体或自身构建载体。此外海肾载体不应使用诸如V40、CMV等强启动子，应选用TK等中等强度的启动子；20-22℃为最佳的反应温度，实验时细胞裂解产物、底物工作液等试剂的添加等操作都宜在适宜温度下操；细胞裂解产物在常温下保存不宜超过6h，-20℃环境下不宜超过30天，-80℃环境下不宜超过180天；手动快速使裂解产物与底物混合，并且混合的时间需要一致，以免荧光素酶衰变影响实验结果的准确性以及真实性；7）检测结果：样品检测OD值实际上应该比仪器背景值大得多，若样品OD值与仪器背景值过于接近，表明荧光素酶在样本中含量过少，可从转染量、转染效率、裂解效率等相关因素进行考虑。

2.3统计处理

实验检测数据均采用SPSS16.0软件分析。计量资料以均数±标准差(x±s)显示结果，使用独立样本t检验，检验标准为a=0.05。

3、结果

       3.1.细胞模型构建成功：ELISA测定结果表明,AMS的水平,IL-1β和TNF-α增加(图1 a、1 b和c)。

Western Blot实验结果提示：不同时间段雨蛙素诱导胰腺AR42J细胞与空白对照组相比，诱导24小时后的AR42J细胞TNF-α升高明显(图1 d)，各组间差异明显，具有有统计学意义（P<0.05），这些结果表明，体外成功构建了急性胰腺炎细胞模型。

图1各炎症因子水平

3.2.qRT-PCR检测结果：

qRT-PCR检测结果显示与空白对照组相比，雨蛙素诱导后IRF9的mRNA水平明显升高、SIRT1的mRNA水平下降。siIRF9转染后IRF9的mRNA表达水平与空白对照组相比降低，较雨蛙素诱导组也降低，SIRT1的mRNA表达水平升高,各组间差异具有统计学意义。（P<0.05）（图2）。即siIRF9转染后IRF9的mRNA表达水平较雨蛙素诱导后IRF9的mRNA表达能力降低，SIRT1的mRNA表达水平较诱导前升高。

　　图2 雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9基因沉默的AR42J细胞IRF9及SIRT1的mRNA表达的影响

3.3.Western Blot结果：

用N-siRNA转染24h后的胰腺AR42J细胞内的IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53蛋白的表达与空白对照组比较无明显变化，差异无统计学意义，用siIRF9转染胰腺AR42J细胞后蛋白表达与空白对照组相比：IRF9蛋白表达降低，SIRT1蛋白水平升高、乙酰化p53/p53的表达水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)（图3）。

　　图3 Western blot 法检测雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9沉默的AR42J细胞IRF9、SIRT1、P53及ace-P53蛋白的表达水平

3.4.沉默的IRF9基因对AR42J细胞凋亡的影响:

AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测的结果表明：无雨蛙素诱导的三组结果：空白组凋亡率是12.473±0.353,N-siRNA实验组凋亡率是8.826±0.348,沉默IRF9实验组凋亡率是7.440±0.647。有雨蛙素诱导的三组结果：空白对照组凋亡率19.257±1.668，N-siRNA实验组凋亡率是16.228±2.471,沉默IRF9实验组凋亡率是14.817±3.069。与空白对照组和N-siRNA转染24h后的胰腺AR42J细胞比较，siIRF9转染24h后的胰腺AR42J细胞的凋亡率是明显降低的（图4）。

　　图4 雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9沉默后各组AR42J细胞凋亡率

3.5.沉默的IRF9基因对AR42J细胞增殖的影响：

MTT实验结果显示:N-siRNA组与空白对照组相比，差异无统计学意义，siIRF9组的OD值较空白对照组及阴性对照组下降，差异有统计学意义（P<0.05）（图5）,这说明siIRF9组细胞数明显下降，细胞生长受到明显抑制，siIRF9组细胞自我复制能力下降。

　　图5 雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9沉默后各组AR42J细胞的吸光度

3.6.IRF9基因沉默对AR42J细胞侵袭迁移的影响：

采用transwell法检测AR42J细胞的迁移。结果显示，IRF9沉默组AR42J细胞活力明显低于空白对照组，差异有统计学意义(p<0.05)(图6)。与空白对照组和阴性对照组相比，IRF9沉默组的迁移明显减少。阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。IRF9基因沉默抑制AR42J细胞的迁移。

图6雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9沉默后各组AR42J细胞的迁移率

3.7.双荧光素酶报告基因实验结果显示：结果显示IRF9抑制了SIRT1的启动子活性(图7)。IRF9对SIRT1具有调控作用。

　　图7 IRF9-SIRT1表达

4.讨论

AP的主要特征是胰腺局部炎症或伴有全身多器官损伤，但其病理机制不明［26］。AP可分为MAP(轻度AP）以及SAP(重度AP)。其中SAP的病死率较高［27,28］，达到17%～30%。目前SAP无特异性治疗方法，需要依靠重症监护。为降低病死率以及增加治疗效果，应尽早对AP病情程度进行预判。轻度AP为自限性疾病，但若治疗不佳，会迁延不愈甚至成为SAP[29]。SAP伴有胰腺坏死及全身性炎症反应，甚至会引起脓毒症及器官功能障碍[30]。AP的发病机制研究是影响其防治方案以及致死率的一个重要影响因素[31]。为解决这些问题，需要大力投入对AP发病机制研究。

IRF同族首先被鉴定为I型转录调节因子

干扰素系统。在哺乳动物中，这个家族由9名成员组成，从IRF1到IRF9。在过去几十年来，越来越多的证据揭示了IRF家族在免疫反应，病理过程等方面的功能，包括癌变和心血管疾病[32]。IRF家族的功能人类AML也有报道。IRF3在人类AML中有着主要影响通过靶向miR-155[33]。IRF9是IRF家庭成员的另一名成员。IRF9介导先天免疫通过激活干扰素介导的靶基因转录反应[34]。此外，IRF9展出通过诱导针对干扰素诱导的p53依赖性细胞凋亡的抗增殖作用。IRF9还涉及抗肿瘤药物耐药性并促进细胞生长[19,35]。IRF9参与细胞增殖、肿瘤形成、炎症以及自身免疫性疾病等病理过程[36,37,38]。有研究表明[39]，IRF9与STAT1可形成复合物，其复合物的促炎作用作用结肠炎。IRF9在人类AP中的机制意义仍然未知。

本实验采用体外培养大鼠急性胰腺炎细胞AR42J作为研究对象。通过siRNA干扰技术成功敲减了AR42J细胞的IRF9基因，通过qRT-PCR和Western Blot发现雨蛙素诱导后，IRF9基因的mRNA及蛋白水平升高，SIRT1基因的mRNA及蛋白水平均较雨蛙素诱导前降低；乙酰化p53/p53蛋白水平较雨蛙素诱导前明显上调，说明发生急性胰腺炎时IRF9基因、乙酰化p53/p53的表达水平均上调，而SIRT1基因的表达水平下调。流式细胞实验、MTT实验及Transwell实验显示：雨蛙素诱导后IRF9沉默组细胞的凋亡率、迁移能力及增殖能力降低。双荧光素酶基因实验结果示：IRF9抑制了SIRT1的启动子活性。

这些结果表明AP发生时IRF9抑制SIRT1表达和增加了p53的乙酰化，促进AR42J细胞凋亡、增殖及转移扩散。沉默IRF9基因能够上调SIRT1，降低p53的乙酰化水平，抑制了细胞凋亡、增殖及转移扩散。我们猜测IRF9是SIRT1的负调节因子，通过抑制SIRT1的表达促进了p53的乙酰化，促进细胞凋亡、增殖及转移扩散。这暗示着IRF9通过SIRT1-p53信号通路在AP病情进展中有着主要作用。综上所述，AP发生时IRF9基因可能通过IRF9-SIRT1-P53信号通路下调SIRT1的表达，增加P53乙酰化水平，提高细胞的增殖和转移能力，进一步引起炎症反应的发生。以IRF9为靶点有望在研究急性胰腺炎发生发展上获得新的认识，为寻找更好的临床治疗方法提供新的方向。

5.结论：

体外AP模型中IRF9蛋白表达上升，而SIRT1表达下降，p53乙酰化水平升高。细胞凋亡增加、增殖及转移扩散能力升高。沉默IRF9基因能够抑制SIRT1的表达，增加P53乙酰化水平，促进AR42J细胞发生凋亡，提高细胞的增殖和转移能力，IRF9蛋白可通过调控SIRT1/p53信号通路进而参与AP的发生发展。IRF9可能是治疗AP的一个潜在的药物靶点。参考文献：

[1] Zhaorigetu S,Yang Z,Toma I,McCaffrey TA,Hu CA. Apolipoprotein L6, induced in atherosclerotic lesions, promotes apoptosis and blocks Beclin 1-dependent autophagy in atherosclerotic cells. J Biol Chem, 2011, 286 (31): 27389-27398.

[2] Cao Y,Yang W,Tyler MA,Gao X,Duan C,Kim SO,Aronson JF,Popov V,Takahashi H,Saito H,Evers BM,Chao C,Hellmich MR,Ko TC. Noggin attenuates cerulein-induced acute pancreatitis and impaired autophagy. Pancreas, 2013.,42 (2): 301-307.

[3] Yadav D, Lowenfels AB. The epidemiology of pancreatitis and pancreatic cancer. Gastroenterology, 2013, 144 (6): 1252-1261

[4] Peery AF,Dellon ES,Lund J,Crockett SD,McGowan CE,Bulsiewicz WJ,Gangarosa LM,Thiny MT,Stizenberg K,Morgan DR,Ringel Y,Kim HP, Dibonaventura MD,Carroll CF,Allen JK,Cook SF,Sandler RS,Kappelman MD,Shaheen NJ. Burden of gastrointestinal disease in the United States. Gastroenterology,2012; 143 (5):1179-1187.

[5] Gravante G,Garcea G,Ong SL,Metcalfe MS,Berry DP,Lloyd DM,Dennison AR. Prediction of mortality in acute pancreatitis: a systematic review of the published evidence. Pancreatology, 2009, 9 (5): 601-614.

Sah R P , Garg P , Saluja A K . Pathogenic mechanisms of acute pancreatitis. Current Opinion in Gastroenterology, 2012, 28(5):507-515.Chiari H. About the digestion of the human pancreas (in German). Zeits- chriftfu¨ rHeilkunde 1896; 17:69–96.Dawra R , Sah R P , Dudeja V , et al. Intra-acinar Trypsinogen Activation Mediates Early Stages of Pancreatic Injury but Not Inflammation in Mice With Acute Pancreatitis. Gastroenterology, 2011, 141(6):2210-2217.e2.Ji B , Gaiser S , Chen X , et al. Intracellular Trypsin Induces Pancreatic Acinar Cell Death but Not NF-κB Activation. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17488-17498.

[10] Matta B,Song S,Li D,Barnes BJ. Interferonregulatoryfactorsignaling in autoimmune disease. Cytokine,2017, 98:15-26.

[11] Marsili G, Perrotti E, Remoli AL, Acchioni C, Sgarbanti M, Battistini A. IFNRegulatoryFactors and Antiviral Innate Immunity: How Viruses Can Get Better.

JInterferonCytokine Res, 2016, 36 (7): 414-432.

[12] Abrams SI, Netherby CS, Twum DY, Messmer MN. Relevance ofInterferonRegulatoryFactor-8 Expression in Myeloid-Tumor Interactions.JInterferonCytokine Res, 2016, 36(7): 442-453.

[13] Chen YJ, Li J, Lu N, Shen XZ. Interferonregulatoryfactors: A key to tumour immunity.Int Immunopharmacol. 2017, 49: 1-5.

[14] Zhang Y, Li H. ReprogrammingInterferonRegulatoryFactorSignaling in Cardiometabolic Diseases.Physiology (Bethesda), 2017, 32 (3): 210-223.

[15] Alsamman K,El-Masry OS. Interferonregulatoryfactor1 inactivation in human cancer. Biosci Rep,2018, 38 (3). pii: BSR20171672.

[16] Chen HH,Stewart AFR. Interferonregulatoryfactor2 binding protein 2: a new player of the innate immune response for stroke recovery. Neural Regen Res,2017, 12 (11): 1762-1764.

[17] Fujii Y , Shimizu T , Kusumoto M , et al. Crystal structure of an IRF-DNA complex reveals novel DNA recognition and cooperative binding to a tandem repeat of core sequences[J]. Embo Journal, 1999, 18(18):5028-5041.

[18] Shen A,Kim HJ,Oh GS,Lee SB,Lee SH,Pandit A,Khadka D,Choe SK,Kwak SC,Yang.SH,Cho.EY,Kim.HS,Kim.H,Park.R,Kwak.TH,So.HS..NAD+augmentationamelioratesacutepancreatitisthroughregulationofinflammasomesignalling. Sci Rep,2017, 7 (1): 3006.

[19] LukerKE, PicaCM, SchreiberRD, Piwnica-WormsD. Overexpression.of.IRF9.confers.resistance to antimicrotubule agents in breast cancer cells. Cancer.Res, 2001,61 (17):6540-7.

[20] Wang PX, Zhang R, Huang L, Zhu LH, Jiang DS, Chen HZ, Zhang Y,Tian S,Zhang XF,Zhang XD,Liu DP,Li H. Interferon regulatory factor 9 is a key mediator of hepatic ischemia/reperfusion injury. J Hepatol, 2014, 62 (1): 111–120.

[21] Zhang SM, Zhu LH, Chen HZ, Zhang R, Zhang P, Jiang DS, GaoL,TianS,WangL,ZhangY, WangPX,ZhangXF, ZhangXD, LiuDP, Lia HL. Interferon regulatory factor 9 is critical for neointima formation following vascular injury. Nat Commun , 2014, 5: 5160.https://doi.org/10.1038/ncomms6160.

[22] Wan W,Ding Y,Xie Z,Li Q,Yan F,Budbazar E,Pearce WJ,Hartman R,Obenaus A,Zhang JH,Jiang Y,Tang J. PDGFR-β modulates vascular smooth muscle cell phenotype via IRF-9/SIRT-1/NF-κB pathway in subarachnoid hemorrhage rats. J Cereb Blood Flow Metab,2019,39(7):1369-1380.

[23] Chen HZ, Guo S, Li ZZ, Lu Y, Jiang DS, Zhang R, Lei H,Gao L,Zhang X,Zhang Y,Wang L,Zhu LH,Xiang M,Zhou Y,Wan Q,Dong H,Liu DP,Li H. A critical role for interferon regulatory factor 9 in cerebral ischemic stroke. J Neurosci, 2014, 34 (36): 11897-11912.

[24] Zhang Y, Liu X, She ZG, Jiang DS, Wan N, Xia H, Zhu XH,Wei X,Zhang XD,Li H.. Interferon regulatory factor 9 is an essential mediator of heart dysfunction and cell death following myocardial ischemia/reperfusion injury. Basic Res Cardiol 2014, 109 (5): 434.

[25] Tian WL,Guo R,Wang F,Jiang ZX,Tang P,Huang YM,Sun L. TheIRF9-SIRT1-P53 axis is involved in the growth of human acute myeloid leukemia. Exp Cell Res,2018, 365 (2): 185-193.

［26］GravantG，GarceaG，ONG SL, Metcalfe MS, Berry DP, Loyd DM, Dennison AR. Prediction of mortalityin.acute.pancreatitis:.a.systematic.review of the published evidence.Pancreatology，2009，9( 5) :601 －614．

［27］Banks PA，Freeman ML，Practice Parameters Committee of the

AmericanCollegeofGastroenterology. Practiceguidelinesinacutepancreatitis．Am J Gastroenterol，2006，101 ( 10 ) :2379 -2400．

［28］Zhou HH，Lin LJ， Zheng CQ,et al.Significance of BISAPcombined with coagulation parameters in predicting the severity ofacute pancreatitis．World Chin J Dig，2012，20( 18):1638 -1643.

[29]FrossardJL, SteerML, PastorCM. Acute pancreatitis. Lancet, 2008, 371(9607):143-52.

[30]Singh V K , Wu B U , Bollen T L , et al. Early Systemic Inflammatory Response Syndrome Is Associated With Severe Acute Pancreatitis. CLINICAL GASTROENTEROLOGY AND HEPATOLOGY, 2009, 7(11):1247-1251.

[31]Wan J , Chen J , Wu D , et al. Regulation of Autophagy Affects the Prognosis of Mice with Severe Acute Pancreatitis. Digestive Diseases and Sciences, 2018.

[32] IkushimaH,NegishiH, TaniguchiT. The IRF family transcriptionfactorsattheinterfaceofinnate and adaptive immune responses.Cold SpringHarbSympQuantBiol, 2013, 78,105-16.

［33］ TianW.L, JiangZX,WangF,GuoR,TangP,HuangYM, SunL.IRF3isinvolvedinhuman acute myeloid leukemia through regulating the expressionofmiR-155. BiochemBiophysResCommun, 2016, 478(3):1130-1135.

[34]KimuraT, KadokawaY, HaradaH, MatsumotoM, SatoM, KashiwazakiY, TarutaniM, TanRS, TakasugiT, MatsuyamaT, Mak TW, Noguchi S, Taniguchi T. Essential and non-redundant roles of p48 (ISGF3 gamma) and IRF-1in both type I and type II interferon responses, as revealed by gene targeting studies. Genes Cells, 1996,1 (1):115-124.

[35] TakaokaA, HayakawaS, YanaiH, StoiberD, NegishiH, KikuchiH, SasakiS, ImaiK, ShibueT, HondaK, Taniguchi T. Integration of interferon-α/βsignallingtop53responsesintumoursuppression and antiviral defence. Nature, 2003,424 (6948), 516-523.

[36] Rauch I , Rosebrock F , Hainzl E , et al. Noncanonical Effects of IRF9 in Intestinal Inflammation: More than Type I and Type III Interferons[J]. Molecular and Cellular Biology, 2015, 35(13).

[37] Smith, Siobhán, Fernando T , Wu P W , et al. MicroRNA-302d targets IRF9 to regulate the IFN-induced gene expression in SLE[J]. Journal of Autoimmunity, 2017, 79(Complete):105-111.

[38] Huber M , Suprunenko T , Ashhurst T , et al. IRF9 prevents CD8(+) T cell exhaustion in an extrinsic manner during acute LCMV infection.[J]. Journal of Virology, 2017, 91(22).

[39] Rauch I , Rosebrock F , Hainzl E , et al. Noncanonical Effects of IRF9 in Intestinal Inflammation: More than Type I and Type III Interferons[J]. Molecular and Cellular Biology, 2015, 35(13).

致谢

时光如箭，匆匆而过，眨眼间已经过了3年。一路走来，其中酸甜苦辣，幸得良师益友可分享其中。三年来，所得甚多，为人处世之道、科研之道、临床阅历无不得以拓宽。

恩师以其独特的人格魅力、如海渊博之专业知识、严谨的处事风格引导我。师恩大于天，需铭记于心。恩师之关心，与我于学习、生活、工作，无微不至。其之恩，言语无以为复。

同时感谢同门，犹记得那时，在实验的无数日日夜夜，共探讨，共进步。因学业而认识，因实验而熟悉，感谢陪伴。感谢实验中心各位老师在实验上的的帮助与指导，谢谢你们。

特别感谢家人的默默支持，于我求学之际，对我的精神鼓励和经济支持，余生无以为报，唯有铭记于心，抱之以歌。

综述

IRF9靶向下调SIRT1在多种疾病发生发展中的作用研究

摘要：越来越多的研究发现，干扰素调节因子IRF9能够抑制组蛋白去乙酰化酶SIRT1的表达，调控下游信号通路，参与炎症反应、细胞凋亡、增殖及迁移等过程。近年来多篇文献报道提示IRF9靶向下调SIRT1参与多种疾病的发生发展过程，包括炎症性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥症，以及肿瘤发生及心血管疾病等[1,3,6,7,8]。本文对国内外关于IRF9靶向下调SIRT1在多种疾病发展过程中的作用及进展做一综述，探讨IRF9靶向下调SIRT1在疾病发生发展中的作用和机制，以期为相关疾病的治疗和预防提供更加可靠的理论依据。

关键词：多种疾病；IRF9；SIRT1；靶向下调

IRF蛋白有着非常保守的结构特点。所有的IRF家族成员都有一个高度保守的N末端DNA结合结构域，该结构域被称为干扰素诱导响应元件ISRE，包含120个氨基酸左右，能够结合GAAANNGAAAG/CT/C核心识别序列[2]。在过去数十年里，众多实验数据证明IRF参与转录调控、应激反应、细胞因子信号转导、自稳平衡等方面都有着重要的作用[1,3,4,5]。IRF9可抑制SIRT1的表达来调控下游信号通路，参与炎症反应、细胞凋亡、增殖及迁移等过程。本文就IRF9靶向下调SIRT1在多种疾病发展过程中的作用意义及机制作一综述。

1.IRF9靶向下调SIRT1通路

近年来有文献报道IRF9能够直接下调组蛋白去乙酰化酶SIRT1的表达，抑制SIRT1的去乙酰化酶活性，增加下游靶蛋白，例如p53，NF-κB等蛋白的乙酰化水平，从而参与炎症反应、细胞凋亡、增殖以及迁移等过程[9,10,11,12,13,14,15]。IRF-9(Imerferonregulatoryfactor-9，IRF-9)作为IRF同族成员中一个重要的转录调节因子，在天然免疫、细胞信号转导、细胞凋亡及增殖、肿瘤发生等过程中有着重要意义[16,17]。IRF9参与JAK-STAT信号通路，与STA1和STAT2形成三元复合物ISGF3结合到启动子的ISRE位点，启动下游抗病毒蛋白的转录，参与免疫反应[18]。IRF9通过刺激p53依附的细胞死亡来应答干扰素的诱导[19]；IRF9还参与肿瘤细胞耐药性及促进细胞生长等过程[9]。

SIRT1是sirtuin同族蛋白之一，是依附于NAD+的HDAC，主要位于细胞核内。SIRT1是sirtuin同族中研究最多的一个成员，可依靠去乙酰化酶的活性而作用多种转录调节子,如p53、NF-κB等[20, 21]。SIRT1可与不同的物质发生反应，产生不同的生物学功能（表1）。

表1 SIRT1的作用底物与相应的生物学作用

2.IRF9过表达与敲低对肝脏I／R损伤影响：

肝脏I/R损伤以缺氧细胞损害和炎症介质的产生为特征，导致肝实质细胞死亡。干扰素调节因子（IRFs）的激活与肝脏I/ R损伤有关。肝脏I/ R期间IRF9增加导致肝损害，IRF9在多种病理生理过程中受转录调控[22,23]; 在肝脏手术过程中，IRF9过表达加重了肝脏I/R损害，而IRF9的敲低减少了肝脏坏死的面积，降低了血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平，下调炎症细胞因子水平，减少肝脏细胞的凋亡，使得肝脏I/R损伤的症状得到了减缓。同时在IRF9敲除鼠模型中发现SIRT1表达显著上调，p53乙酰化水平下降，细胞凋亡减少；同时SIRT1启动子区域荧光素酶报告基因实验显示，IRF9能够结合SIRT1基因的启动子区域，抑制SIRT1的表达及去乙酰化酶活性。这些结果证明IRF9通过下调SIRT1的表达，增加p53的乙酰化水平，诱导了肝脏细胞凋亡，增加了炎症细胞因子水平[4]。该研究表明IRF9是一种重要的细胞,具有诱导肝细胞的新功能，肝脏I/R损害后细胞凋亡通过降低SIRT1表达和凋亡增加乙酰-β水平，通过沉默SIRT1表达导致肝脏I/ R损害的介质，导致p53乙酰化水平升高和上调p53介导的肝细胞死亡功能。IRF9缺失可防止肝脏I/ R期间的肝细胞死亡。IRF9可能是潜在的改善肝脏手术后缺血性肝损伤的策略。

3.IRF9表达与下调对血管平滑肌新生内膜形成的影响：

在血管平滑肌细胞的新生内膜形成过程中IRF9的表达是增加的，IRF9的敲除抑制了细胞迁移与增殖以及新生内膜的形成，改善了内膜增厚的现象；相反，IRF9的回补促进了细胞的迁移与增殖及新生内膜的形成，加重了动脉狭窄。进一步的机制研究显示，IRF9直接抑制了SIRT1的转录从 而促进了血管平滑肌细胞的增殖以及新生内膜的形成[18]。另外有研究发现虹网膜下出血时IRF9表达上升，SIRT1下调，NF-κB乙酰化水平升高，影响血管平滑肌细胞的增殖与迁移。IRF9/SIRT1/NF-κB通路在虹网膜下出血时血管平滑肌细胞的表型转换过程中起着重要作用，该通路的抑制使得血管平滑肌细胞维持收缩型，因而改善了虹网膜下出血后的神经系统功能[24]。

4.IRF9－SIRT1－p53通路对急性髓性白血病发展的影响：

更多的研究说明IRF家族在致癌过程起着关键功能[25]。该IRF家族在人类白血病中有着重要的意义。人类AML中IRF9和蛋白质水平下降，暗示IRF9可能参与人类AML的发展。IRF9通过抑制SIRT1-p53途径抑制AML的发展。首先进行了甲基纤维素集落形成细胞试验，结果显示IRF9敲低增加OCI / AML-2和OCI / AML-3细胞的集落数。此外，还用慢病毒在OCI / AML-2细胞中过表达IRF9。展示了自第4天起，IRF9过表达降低了OCI / AML-2细胞的增殖速率。这些发现提示IRF9抑制AML细胞的生长和集落形成。其次探讨了IRF9是否影响OCI / AML-2和OCI / AML-3的细胞存活，结果表明，IRF9敲低显著降低了细胞凋亡的基本水平，IRF9过表达诱导OCI / AML-2和OCI / AML-3细胞凋亡。我们发现IRF9是SIRT1的上游调节因子。SIRT1确实在人类AML中过表达。 SIRT1的表达呈负相关与人类AML中的IRF9水平相同。此外，我们发现IRF9结合SIRT1启动子抑制OCI / AML-2和OCI / AML-3细胞中的SIRT1表达。这些结果表明IRF9起作用作为SIRT1启动子的转录抑制因子。这些发现表明在AML细胞中IRF9结合SIRT1启动子并抑制SIRT1的转录。肿瘤阻抑因子p53在调节人类AML中起着重要意义[25,26]。IRF9通过抑制SIRT1的表达促进p53的乙酰化以诱导活性 SIRT1使p53去乙酰化以抑制其活性和其基因的表达。总之，在AML患者中，IRF9表达下调，SIRT1表达上调，p53乙酰化水平下降且下游靶基因的表达下调；敲低IRF9能够上调SIRT1的表达，促进细胞克隆、增殖形成；过表达IRF9则有着相反的结果。IRF9是SIRT1的一个负调节因子，能够靶向下调SIRT1的表达，增加p53的乙酰化水平，促进p53靶基因的表达，阻制细胞生长，诱导细胞凋亡，阻止AML的进一步发展[7]。在这项研究中，我们将IRF9鉴定为人类AML中的肿瘤抑制因子。 IRF9表达在人AML中下调，它阻制AML细胞生长并导致细胞死亡。研究表明IRF9调节人AML中的SIRT1-p53途径。 因此，IRF9可作为AML治疗的潜在目标。

5. IRF9在脑中风发病中的作用

还有研究证实IRF9在脑中风发病过程中有着重要作用，IRF9直接介导了小鼠神经元死亡过程；缺血/再灌注时IRF9在神经元中的表达增加。IRF9的敲除极大地缓解了脑中风后神经元死亡及神经功能缺陷；相反IRF9的过表达则使得神经元更容易死亡。具体机制则是IRF9下调了SIRT1的表达，抑制了SIRT1的去乙酰化酶活性，使得p53乙酰化水平升高，最终诱导了乙酰化p53介导的细胞死亡信号[13]。

6.IRF9-SIRT1-p53轴在心肌细胞缺血/再灌注损伤中调控：在心肌I/R损害中IRF9的表达上调，IRF9敲除保护心脏免于I/R诱导的心肌细胞死亡，炎症反应的进一步发展以及心脏功能的缺陷。相反IRF9的过表达加重了心肌再灌注损害及炎症反应。在缺血/再灌注时IRF9负调控SIRT1-p53轴，IRF9的敲除缓解了SIRT1表达的下调以及由缺血/再灌注诱导的下游凋亡相关信号级联反应，而IRF9的过表达则是相反的结果。这预示着IRF9通过调节SIRT1-p53轴调控着心肌细胞I/R[14]

7.小结与展望

因此IRF9靶向下调SIRT1参与了细胞死亡、繁殖、迁移以及炎症反应等过程，调控着各种疾病的发生发展过程。在急性胰腺炎中，IRF-9是否通过下调SIRT1的表达来调节细胞凋亡、增殖和迁移等过程，进一步影响细胞内炎症反应，国内外未见相关报道。IRF在AP中的作用报道的并不多，目前仅有IRF-2的作用被研究过。研究发现IRF-2对胰腺腺泡细胞AR42J的胞外分泌功能具有调节作用，影响淀粉酶的分泌。这种调节作用是不依赖于I型干扰素信号的，IRF具有整合因子的功能[27]。

IRF9是有效转录因子干扰素刺激基因因子3的组成部分之一，可启动数百个干扰素刺激基因，从而产生抗病毒应答。IRF9在病原体分离以及治疗疾病中具有十分重要的作用，但目前对于其功能机制研究，仅局限于STAT1和STAT2。对于其对转录以及翻译的调控机制，以及在促进和减少炎症方面的功能需要更多研究。此外亦有研究证明，c-Myc原癌基因上调了IRF9的表达，表明在肿瘤发生中有IRF9的参与作用。IRF9可在胰岛素分泌以及损伤修复中发挥重要作用，但是其在AP的发挥的作用和机制暂未见相关文献报道。以后计划构建体外AP细胞模型，检测AP发生时IRF9、SIRT1的转录及表达水平。然后通过双荧光素酶报告基因实验、过表达/下调IRF9，检测SIRT1转录及表达水平、下游靶基因p53及NF-κB等的乙酰化水平，炎症细胞因子水平；同时检测细胞的迁移、凋亡及增殖等过程。从而阐述IRF9靶向下调SIRT1在AP发病过程中作用机制，以期能够对疾病诊断和治疗提供理论指导,从而实现科学研究到临床实践中。

参考文献：

Matta B,Song S,Li D,Barnes BJ. Interferonregulatoryfactorsignaling in autoimmune disease. Cytokine,2017, 98:15-26.

[2] Escalante CR,Yie J,Thanos D,Aggarwal AK. Structure of IRF-1 with bound DNA reveals determinants of interferon regulation. Nature,1998, 391(6662):103-206.

[3] Marsili G, Perrotti E, Remoli AL, Acchioni C, Sgarbanti M, Battistini A. IFNRegulatoryFactors and Antiviral Innate Immunity: How Viruses Can Get Better.JInterferonCytokine Res, 2016, 36 (7): 414-432.

[4] Abrams SI, Netherby CS, Twum DY, Messmer MN. Relevance ofInterferonRegulatoryFactor-8 Expression in Myeloid-Tumor Interactions.JInterferonCytokine Res, 2016, 36(7): 442-453.

Chen YJ, Li J, Lu N, Shen XZ. Interferonregulatoryfactors: A key to tumour immunity.Int Immunopharmacol, 2017, 49: 1-5.

[6]ZhangY,Li H. ReprogrammingInterferonRegulatoryFactorSignaling in Cardiometabolic Diseases.Physiology (Bethesda), 2017, 32 (3): 210-223.

[7] Alsamman K,El-Masry OS. Interferonregulatoryfactor1 inactivation in human cancer. Biosci Rep,2018, 38 (3). pii: BSR20171672.

Chen HH,Stewart AFR. Interferonregulatoryfactor2 binding protein 2: a new player of the innate immune response for stroke recovery. Neural Regen Res,2017, 12 (11): 1762-1764.

[9] Luker KE, Pica CM, Schreiber RD, Piwnica-Worms D. Overexpression of IRF9 confers resistance to antimicrotubule agents in breast cancer cells, Cancer Res, 2001, 61, 6540-6547.

[10] Wang PX, Zhang R, Huang L, Zhu LH, Jiang DS, Chen HZ, Zhang Y,Tian S,Zhang XF,Zhang XD,Liu DP,Li H. Interferon regulatory factor 9 is a key mediator of hepatic ischemia/reperfusion injury. J Hepatol, 2014, 62 (1): 111–120.

[11] Zhang SM, Zhu LH, Chen HZ, Zhang R, Zhang P, Jiang DS, GaoL,TianS,WangL,ZhangY, WangPX,ZhangXF, ZhangXD, LiuDP, Lia HL. Interferon regulatory factor 9 is critical for neointima formation following vascular injury. Nat Commun 2014,5:5160.

[12] Wan W,Ding Y,Xie Z,Li Q,Yan F,Budbazar E,Pearce WJ,Hartman R,Obenaus A,Zhang JH,Jiang Y,Tang J. PDGFR-β modulates vascular smooth muscle cell phenotype via IRF-9/SIRT-1/NF-κB pathway in subarachnoid hemorrhage rats. J Cereb Blood Flow Metab,2018 Feb 26:271678X18760954. doi: 10.1177/0271678X18760954. [Epub ahead of print]

[13] Chen HZ, Guo S, Li ZZ, Lu Y, Jiang DS, Zhang R, Lei H,Gao L,Zhang X,Zhang Y,Wang L,Zhu LH,Xiang M,Zhou Y,Wan Q,Dong H,Liu DP,Li H. A critical role for interferon regulatory factor 9 in cerebral ischemic stroke. J Neurosci, 2014, 34 (36): 11897-11912.

[14] Zhang Y, Liu X, She ZG, Jiang DS, Wan N, Xia H, Zhu XH,Wei X,Zhang XD,Li H. Interferon regulatory factor 9 is an essential mediator of heart dysfunction and cell death following myocardial ischemia/reperfusion injury. Basic Res Cardiol 2014, 109 (5): 434.

[15] Tian WL,Guo R,Wang F,Jiang ZX,Tang P,Huang YM,Sun L. TheIRF9-SIRT1-P53 axis is involved in the growth of human acute myeloid leukemia. Exp Cell Res,2018, 365 (2): 185-193.

[16] Suprunenko T, Hofer MJ.The emergingroleofinterferonregulatoryfactor9 in the antiviral host response and beyond.Cytokine GrowthFactorRev, 2016, 29:35-43.

[17] FlemingSB. Viral Inhibition of the IFN-Induced JAK/STAT Signalling Pathway: Development of Live Attenuated Vaccines by Mutation of Viral-Encoded IFN-Antagonists. Vaccines (Basel). 2016, 4(3): 23.

[18] Sandhya Rani MR, Croze Ed, Wei T, Shrock J, Josyula A, Kalvakolanu DV, Ransohoff Richard M. STAT-Phosphorylation–Independent Induction of Interferon Regulatory Factor-9 by Interferon-β. J Interferon Cytokine Res,2010, 30 (3): 163-170.

[19] Takaoka A, Hayakawa S, Yanai H, Stoiber D, Negishi H, Kikuchi H, Sasaki S, Imai K, Shibue T, Honda K, Taniguchi T. Integration of interferon-α/β signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence, Nature, 2003, 424, 516-523.

[20] Lu SP, Lin SJ. Regulation of yeast sirtuins by NAD（+）metabo⁃lism and calorie restriction. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804: 1567-1875.

[21] Thakur BK, Chandra A, Dittrich T, Welte K, Chandra P. Inhibition of SIRT1 by HIV-1 viral protein Tat results in activation of p53 pathway. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 424: 245-250.

[22]Wang XA,Zhang R,Jiang D,Deng W,Zhang S,Deng S,et al. Interferon regulatory factor 9 protects against hepatic insulin resistance and steatosis in male mice.Hepatology, 2013, 58:603-616.

[23]Bieche I,Asselah T,Laurendeau I,Vidaud D,Degot C,Paradis V,et al.Molecular profiling of early stage liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C virus infection. Virology, 2005, 332:130-144.

[24] Zhang Y, Li H. ReprogrammingInterferonRegulatoryFactorSignaling in Cardiometabolic Diseases.Physiology (Bethesda), 2017, 32 (3): 210-223.

[25]. IkushimaH, NegishiH,Taniguchi,T. The IRF family transcription factors at the

interface of innate and adaptive immune responses.Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2013, 78:105-16.

[26].Liu Y, Chen C, Xu Z, Scuoppo C, Rillahan CD, Gao J, Spitzer B, Bosbach B,

Kastenhuber ER, Baslan T, Ackermann S, Cheng L, Wang Q, NiuT, Schultz N, LevineRL,MillsAA,Lowe SW. Deletions linked to TP53 loss drive cancer through p53-independent mechanisms.Nature,2016, 531,471-475.

[27] Mashima H,Sato T,Horie Y,Nakagawa Y,Kojima I,Ohteki T,Ohnishi H. Interferon regulatory factor-2 regulates exocytosis mechanisms mediated by SNAREs in pancreatic acinar cells. Gastroenterology,2011,141 (3): 1102-1113.

IRF9下调SIRT1在急性胰腺炎发生发展中的作用及机制研究

价格 ¥9.90 发布时间 2023年5月20日

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