肉苁蓉活性成分和药理作用的研究

　　摘要

肉苁蓉为沙生名贵的滋补中药材，具药用和食用价值。主要化学成分有苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类。木脂素及其苷类、多糖等，其中苯乙醇苷类为主要药效物质。该文对肉苁蓉化学成分进行总结，阐述肉苁蓉的药理作用，从亲缘性及特有性、传统药效、新的药效、传统药性、代谢转化、可测性，分析可作为其质量标志物的成分，为肉苁蓉的临床用药提供更精准明确的依据，制定更加科学的质量标准。

　　关键词：肉苁蓉，管花肉苁蓉，肉苁蓉炮制

　　第一章肉苁蓉概述

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉和管花肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎，通常在春、秋季进行采挖《经史证类备急本草》曰：“五月五日采。五月恐已老不堪，故多三月采之”

有研究表明，肉苁蓉总寡糖、去半乳糖醇总寡糖和半乳糖醇是肉苁蓉发挥通便作用的主要成分。药理学研究结果表明，肉苁蓉具有抗衰老、免疫调节、抗病毒、促进造血、改善脾虚、提高学习记忆能力等多种作用；此外，其还可用于治疗良性前列腺增生、急慢性肝损伤及肝纤维化等症。产地采收加工是中药材生产的第一个环节，也是最关键的一步，而炮制是药材成为饮片的最重要一步，合理的产地采收加工及炮制方法是影响药材品质的关键。

传统肉苁蓉干燥的过程不仅费时、费力，而且随着时间的推移及二次闷润，使得不少有效成分流失，从而影响了药材的品质。随着肉苁蓉研究的不断深入和一些新技术的不断发展，逐渐出现了产地加工蒸制后干燥、冷冻干燥技术等新的干燥技术，这些技术均在一定程度上提高了肉苁蓉的干燥效率，并保证了有效成分尽可能少的流失。如，春天采挖的肉苁蓉通过半埋半露晒干的方式，干燥后即得“甜苁蓉”或“甜大芸”；而秋天采挖的肉苁蓉一般要先块大者放入盐湖中腌1～3年，干燥后则得“咸苁蓉”或“盐大芸”。在产地采收加工的过程中，任何一个环节的因素，如不同采收期、不同蒸制时间、不同的初加工方式等均会影响药材的品质。

　　第二章肉苁蓉的活性成分研究

苯乙醇苷类为肉苁蓉的主要成分之一，具多种药理活性。其结构为：内侧糖为葡萄糖与苷元直接相连。苏娅等[1]从肉苁蓉中分离鉴定出毛蕊花糖苷成分，并确定了其最佳的纯化工艺。李瑞燕[2]等采用一测多评法从肉苁蓉中准确测定了松果菊苷、管花苷A类叶升麻苷、异类叶升麻苷和乙酰毛蕊花糖苷的含量。高妍等[3]检测出松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷和管花苷B肉苁蓉水提液中测定松果菊苷的含量，建立了准确、稳定、重现性好的含量测定方法。采用RPLC-HILICMS/MS发现松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、肉苁蓉苷A管花苷A、2′-乙酰毛蕊花糖苷和红景天苷7个苯乙醇苷类成分。等从肉苁蓉中分离出顺式管花苷B、顺式肉苁蓉苷K、顺式肉苁蓉苷J、顺式异肉苁蓉苷C4种顺式苯乙醇苷类成分。采用HPLC可同时准确的测定肉苁蓉中主要药效成分松果菊苷、麦角甾苷的含量。

　　2.1环烯醚萜及其苷类

环烯醚萜类是一类特殊的单萜，多与糖结合成环烯醚萜苷类，其结构为：C1-OH半缩醛结构，多与葡萄糖结合成苷，C4，C8位多连甲基或氧化状态。分离出环烯醚萜苷类8-表去氧马钱酸；采用RPLC-HILICMS/MS发现6-去氧梓醇、8-表马钱子酸和格鲁苷3个环烯醚萜苷类成分。采用HPLC建立准确的京尼平苷酸含量测定的分析方法。

　　2.2木脂素及其苷类

分离出木脂素苷类丁香树脂酚葡萄糖苷采用发现阿拉善苷A和松脂素单甲基醚苷2个木脂素类成分。

　2.3糖类

采用气相色谱法测定出肉苁蓉多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖以摩尔比为2.01∶5.72∶2组成。采用HPLC-ELSD可准确测出甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。采用RPLC-HILIC-MS/MS发现蔗糖和甘露糖醇2个糖类成分。

　　2.4其他

肉苁蓉还包含有许多其他成分，如甜菜碱等生物碱类，烟酸、琥珀酸和阿魏酸等有机酸类，鸟苷、肌苷、尿苷和腺苷等核苷，苯丙氨酸等氨基酸。

　　第三章肉苁蓉药理作用的研究

　　3.1保肝

研究表明肉苁蓉苯乙醇总苷在0.46~117.79mg/L浓度范围内各个浓度水平均可降低磷酸化p38丝裂原活化蛋白酶（p-p38）蛋白的表达，且随药物浓度升高，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）[4]、Ⅰ型胶原和活化转录因子2（ATF-2）mRNA水平显著下降，对血小板衍生生长因子（rrPDGF-BB）诱导的大鼠肝星状细胞（HSC）增殖起到抑制作用，从而产生抗肝纤维化的作用。研究表明肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体可下调α-SMA、I型胶原酶（collagenI）、III型胶原酶[5]（collagenⅢ）mRNA水平的表达，降低磷酸化氨基末端蛋白激酶（p-JNK）蛋白的表达，抑制大鼠肝星状细胞（HSC-T6）的增殖且诱导其凋亡，并推断其作用可能与抗肝纤维化有关。研究表明肉苁蓉苯乙醇总苷能升高血清白介素2（IL-2）含量，降低甲胎蛋白（AFP）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量，从而降低肝癌H22荷瘤小鼠肝脏损伤，抑制肿瘤生长。研究发现肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs）及其单体毛蕊花糖苷和松果菊苷对HSC-T6细胞的增殖抑制率与浓度成正比，并且可以增加HSC-T6[6]细胞中兔抗人单克隆抗体（Bax）蛋白表达，降低B细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白（Bcl-2）的表达，证明了它们具抗肝纤维化的作用，效果为：毛蕊花糖苷>CPhGs>松果菊苷.GUOY等研究发现肉苁蓉分离出的多糖（CDP-C）在体外研究中，表明CDP-C促进HepG2细胞活性，在体内研究中CDP-C改善了酒精引起的改变，包括血清学指标[丙氨酸转氨酶、酸性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶和甘油三酯（TG）][7]和肝脏指标[超氧化物歧化酶、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽S-转移酶]和TG，并缓解了肝脏中明显的微泡脂肪变性和轻度坏死，减少MDA和TG的含量，表明CDP-C具有抗酒精诱导的慢性肝损伤的肝保护活性。YOUSP等研究表明[8]肉苁蓉的苯乙醇类不影响乳酸脱氢酶（LDH）的释放，增加Smad家族（信号传递受体）中Smad7的mRNA水平和蛋白表达,降低Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3的mRNA水平，阻止肝星状细胞（HSC）的活化，肝纤维化。总结可知，肉苁蓉苯乙醇苷类为发挥抗肝纤维化作用的药效物质基础，其中毛蕊花糖苷和松果菊苷为主要活性成分。

　　3.2改善肠胃功能

从肉苁蓉中分离出多糖和松果菊苷成分，并作用于SAMP8小鼠，结果表明肉苁蓉多糖单用及与松果菊苷联合均可提高SAMP8小鼠的生存率[9]并通过提高拟杆菌、变形菌数量，降低厚壁菌门数量，改善其紊乱的肠道菌群。研究表明肉苁蓉总提取物可增强结肠收缩功能，提高血清胃动素和血管活性肠肽水平，从而发挥润肠通便的作用。发现肉苁蓉总寡糖、半乳糖醇显著增加小鼠排便粒数及排便干重，发挥润肠通便的作用。JIAYM等将肉苁蓉中分离的松果菊苷成分，作用于右旋糖酐硫酸钠（DSS）引起的结肠炎模型，结果表明其可保护小肠上皮免受炎性损伤，但对炎性细胞浸润的影响较小，尚可上调转化生长因子（TGF-β1）和患病结肠中Ki67+增殖细胞的数量，并增加小鼠小肠上皮（MODE-K）细胞伤口愈合，均表明了肉苁蓉中分离的松果菊苷成分可以缓解结肠炎。总结可知，肉苁蓉糖类和苯乙醇苷类为发挥改善肠胃功能的药效物质基础，其中松果菊苷、总寡糖、半乳糖醇、多糖为主要活性成分。

　　3.3抗骨质疏松

ZHANGB等研究表明肉苁蓉提取物可下调TRAF6、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、RANK、核转录因子κB（NF-κB）、IκB激酶β（IKKβ）、T细胞核因子2（NFAT2）水平，上调磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K），蛋白激酶B（AKT），骨保护素配体（osteoprotegerin），转录因子c-Fos的表达，改善绝经后骨质疏松症。通过骨密度测量、Micro-CT扫描和血清白介素IL-1β、TGF-β1水平证明肉苁蓉水提液可抑制骨折大鼠血清IL1β、TGF-β1的产生，从而改善骨质疏松。通过网络药理学筛选发现肉苁蓉中毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸13个主要成分可通过成骨分化特异性转录分子2（RUNΧ2）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素6（IL-6）、骨生长蛋白因子（BGP）、TNF等靶点，WNT、VEGF、TNF等信号通路治疗骨质疏松。研究发现肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷可与雌激素受体α（ERα）、Erβ结合，上调雌激素应答元件荧光素酶ERE的活性，从而产生雌激素的作用，对骨质疏松的治疗和预防提供依据。LIANGHD等将肉苁蓉提取物作用于去卵巢（OVX）大鼠骨质疏松症模型，结果表明与假手术组相比，给药作用90d后，升高OVX大鼠血清骨钙素（BGP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、促卵泡素（FSH）和黄体生成素水平，而降低E2、Smad1、Smad5、TGF-β1和TIEG1mRNA及蛋白表达水平表明肉苁蓉提取物可以调节一些与骨骼代谢相关的基因。总结可知，肉苁蓉苯乙醇苷类、生物碱、环烯醚萜苷类成分为发挥抗骨质疏松作用的药效物质基础，其中毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸、松果菊苷为主要活性成分。

　　3.4保护神经系统

肉苁蓉总苷可通过降低病人血清异常磷酸化蛋白水平，改善血管性痴呆病人的认知能力。研究发现肉苁蓉苯乙醇苷可使小鼠海马脑区Aβ1~42、Aβ1~40蛋白表达下降，从而影响Aβ级联反应以保护神经元，产生抗阿尔茨海默病（AD）作用，表明苯乙醇苷为抗AD的主要药效物质基础。蔡克瑞等研究发现肉苁蓉多糖可使小鼠脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量增高，MDA含量降低，减少神经细胞的凋亡，增加DNA损伤和凋亡相关基因Bcl-2表达，从而保护D半乳糖致衰小鼠的脑神经细胞。苗鑫等研究表明肉苁蓉中毛蕊花糖苷可增强腺苷效应元件结合蛋白（p-CREB蛋白）表达，提高激酶A（PKA）、环磷酸腺苷（cAMP）、脑源性神经营养因子（BDNF）和SOD水平，降低MDA和LDH水平，从而保护D半乳糖诱导的大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞（PC12）的损伤。研究表明肉苁蓉苷可促进神经干细胞的增殖，促进神经康复。研究证明肉苁蓉水煎液可抑制丝氨酸/苏氨酸激酶（GSK-3β）、p-β-连环蛋白（p-β-catenin）的表达，增加β-catenin蛋白表达，激活Wnt信号通路，保护帕金森神经元，从而治疗帕金森病。WANGDF等研究表明在小鼠尾部悬吊试验，与对照组相比，应激组小鼠不动的时间增加了27.4%，但与应激组相比，高、中剂量的肉苁蓉水煎液减少小鼠不动时间41.9%、44.1%，结果表明肉苁蓉水煎液显著减少小鼠静止期；在莫里斯水迷宫测试中，用肉苁蓉水煎液处理后改善了小鼠空间学习和记忆能力；肉苁蓉水煎液下调单胺氧化酶（MAO）活性和皮质酮（CORT）的血清浓度，增加多巴胺（DA）释放，表明肉苁蓉水煎液可改善小鼠神经兴奋性和降低压力，并通过HPLC色谱图显示肉苁蓉水煎液主要的活性物质是苯乙醇苷类。总结可知，肉苁蓉苯乙醇苷类和多糖类成分为发挥保护神经作用的药效物质基础，其中毛蕊花糖苷为主要活性成分。

　　3.5改善肺损伤

肉苁蓉苯乙醇总苷使大鼠全血中性粒细胞百分比和右肺中叶湿/干重比值降低，降低肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-6含量，减轻右肺后叶组织炎症反应，使血清中SOD和GSH活性含量升高，MDA和一氧化氮（NO）含量降低，可能从抗氧化、减轻肺水肿和减少炎症因子的释放来抑制急性肺损伤。研究证明肉苁蓉苷A可抑制放射诱导的凋亡小体的形成，使肺匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、总抗氧化能力（T-AOC）及SOD的浓度升高，降低MDA浓度及炎症因子IL-6和IL-1β浓度，促进IL-10分泌减少，并减少肺组织TGF-β1的阳性表达，降低TGF-β1、VEGF和VEGFR2的蛋白表达水平，抑制肺损伤小鼠肺部的氧化应激和炎症反应。总结可知，肉苁蓉苷类为发挥改善肺损伤作用的药效物质基础，其中肉苁蓉苷A为主要活性成分。

　　3.6抗疲劳

研究表明肉苁蓉多糖可降低血清尿素氮（BUN）及乳酸（LA）含量，增加肝糖原及肌糖原的含量，提高肝组织SOD及GSH-Px的活性，降低MDA活性，对D-半乳糖致衰老小鼠产生抗疲劳的作用。

　　3.7免疫调节

研究表明肉苁蓉低分子糖可通过调节Fcγ受体依赖的吞噬作用，TNF-α、NF-κB信号通路，糖酵解/糖原异生以及柠檬酸（TCA）循环和呼吸电子运输等通路，激活巨噬细胞，产生免疫调节作用。张雨荷等研究表明肉苁蓉低分子糖和多糖均可提高RAW264.7细胞的吞噬活性，促进RAW264.7细胞释放NO，仅肉苁蓉低分子糖可通过激活IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路，促进TNF-α和IL-6蛋白的表达，进而激活细胞的免疫吞噬功能，对活性成分筛选时发现，甘露醇可显著激活巨噬细胞吞噬活性，故甘露醇可作为低分子糖中激活巨噬细胞的关键成分。ZHANGK等将肉苁蓉提取物作用于衰老加速的小鼠倾向性亚型SAM-P8，发现其可增加外周初始T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞），且降低记忆T细胞，从而逆转与年龄有关的免疫衰老，此外肉苁蓉提取物能够抑制周围淋巴细胞的坏死和促炎细胞因子IL-6的水平，肉苁蓉提取物除引起老年免疫系统改变外，也延长了老年SAM-P8小鼠的寿命。总结可知，肉苁蓉糖类成分为发挥免疫调节作用的药效物质基础，其中甘露醇为主要活性成分。

　　3.8其他

研究表明肉苁蓉多糖可下调大鼠血液中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）的表达，升高雌二醇（E2）含量，调节下丘脑-垂体-卵巢轴（HPOA）的功能，改善内分泌，发挥改善更年期症状。研究表明肉苁蓉多糖和松果菊苷可干扰K562白血病细胞的细胞周期而抑制细胞的生长，从而发挥抗白血病的作用。研究发现肉苁蓉苯乙醇苷可降低H2O2诱导的细胞凋亡，减少LDH释放，抑制葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、应激活化蛋白激酶（JNK）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）的mRNA表达，证明肉苁蓉苯乙醇苷可改善H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡和损伤。SHIMODAH等将肉苁蓉乙醇水提物（CTE）作用于高胆固醇喂养的小鼠模型，结果表明CTE可以降低血清中的胆固醇含量，增加极低密度脂蛋白（VLDL）受体和细胞色素P450侧链裂解酶（SCC）的mRNA表达，同时还发现CTE主要成分毛蕊花糖苷增加HepG2细胞中载脂蛋白B、VLDL受体和SCCmRNA的表达，NANZD等证明肉苁蓉乙醇水提物有降低小鼠胆固醇的作用。等研究表明肉苁蓉中的8-表马钱子酸可以抑制脂多糖（LPS）刺激BV-2小鼠小胶质细胞的NO产生，证明了其有抗炎活性。

　第四章肉苁蓉的炮制方法研究

明代对肉苁蓉的炮制方法有较为详细的记载，李时珍《本草纲目》曰：“凡使先须清酒浸一宿，至明以棕刷去沙土浮甲，劈破中心，去白膜一重，如竹丝草样”。可见，明代对肉苁蓉的净制已相当考究，其净方法也是现代肉苁蓉最常用的处理方式。肉苁蓉炮制大多采用的辅料是酒，酒的种类有白酒、黄酒、清酒、烧酒、无灰酒等。

　　4.1肉苁蓉的现代炮制方法

肉苁蓉的炮制品种在2015年版《中国药典》（一部）

正式收载的有两种，即肉苁蓉片和酒苁蓉。此外，还有黑豆复制法和四蒸四晒法

　　4.2肉苁蓉的现代炮制研究

肉苁蓉经酒浸后苯乙醇苷类成分含量明显提高，且辅料酒的种类对其有很大影响。刘雯霞等[26]的研究结果表明，用不同种类的酒处理肉苁蓉，其中松果菊苷的含量由高到低依次为米酒＞黄酒＞白酒，但由于米酒成本较高，且米酒和黄酒炮制品质差别不大，因此通常采用黄酒炮制。段哲等的研究结果表明，随着黄酒酒精度的增加，肉苁蓉润肠通便的作用亦有所增强，这可能是由于半乳糖醇的含量提高所致。一项关于不同酒蒸时间对苯乙醇苷类成分影响的研究结果表明，随着酒蒸时间的延长，苯乙醇苷类成分含量降低，提示可能存在向其他成分转化的质的变化，但具体机制有待进一步的研究。黄林芳等的研究结果表明，酒炙后肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的含量相比生品均有明显增加。范亚楠等]的研究结果表明，肉苁蓉能明显改善便秘大鼠的便秘症状，增强润肠通便作用，且生品的效果强于酒制品、水提液的效果强于粉末。通过酒制后的肉苁蓉其抗氧化能力及免疫功能明显增强，但具体的机制还有待进一步研究和探讨。

　　结论

传统肉苁蓉产地干燥主要以自然晾干为主，但该过程可能会导致苯乙醇苷类成分的损失且不卫生，因此科学合理的产地加工方法对肉苁蓉品质及疗效的保证具

有重要意义。目前肉苁蓉多采用先蒸制后晾晒的产地加工方法，不仅可起到杀酶、保苷的作用，提高有效成分的含量，同时还有助于缩短肉苁蓉的干燥时间。蒸制时间的不同也会影响肉苁蓉活性成分的含量，故应根据具体需要进行加工处理。此外，结合干燥新技术，如“冷冻干燥技术”、“气体射流冲击技术”、“超声真空干燥技术”也大大提高了干燥效率，提升了药材品质。

肉苁蓉的炮制主要以酒制为主，通过酒制可明显提高有效成分的含量，增强其温补肾阳、抗氧化及免疫等功能。但目前的文献研究大都报道酒制对4种苯乙醇苷类成分的变化影响，较少涉及到其他成分的研究，对于引起质变的成分转化的机制研究尚未见有相关阐述。此外，关于肉苁蓉炮制品的研究，我认为目前多集中在临床前动物研究阶段，对于主要成分的量效及药动关系研究则较少，仍有待进行更深入的临床研究及活性成分的追踪。

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　　致谢

窗外日光弹指过，席间花影坐前移。经历了半个月的努力，我最后完成了论文的写作，从开始接到论文题目到系统的实现，再到论文文章的完成，每走一步，对我来说都是新的尝试与挑战，这也是我在大学期间独立完成的最大的项目。

首先我要感谢一下韩继新老师，本论文在韩继新老师的细心指导下和严格要求下完成的。从课题选取，论文的完成，无不凝聚着韩老师的心血和汗水。在三年的专科学习和生活期间也始终感受着老师的精心指导和无私的关怀，我受益匪浅，在此向韩继新老师表示深深的感谢和崇高的敬意。

其次感谢我的各位同学，是你们的无私帮助，让我感受到校园的温暖，在我的论文写作过程当中，多位同学给我带来了信息支持，在此表示深深的感谢。

最后最后感谢我的家人在此期间给予我的包容，关爱和鼓励，正是由于他们的支持，我才能安心学习并顺利完成我的学业。最后唯愿双亲快乐安康

毕业设计总结

时间过得太快了，转眼间，我马上就要成为一名即将迈向人生下一个阶段的毕业生。在这个过度阶段，标志过渡完成的就是毕业论文的完成了。书写毕业论文，一是对学生专业的知识能力进行一次全面的考核；二是培养学生综合运用所学知识独立地分析问题和解决问题的能力。这次论文写作到现在基本接近了尾声，论文的写作是一个长期的过程，需要不断地进行修改，不断地去研究各方面的文献，认真总结。为期半个月的写作真的是紧张充实。一开始选择论文题目时因为和别的同学选择重复了，当时的心情很烦躁，但是在经过和老师的沟通之后，自己选择了一个自己感兴趣的题目，最后带着探索研究的心情开始了大量的资料查询。我的题目是肉丛蓉的活性成分和药理作用的研究，一开始拿到题目之后，老师让我们整理出论文的大纲，这样在进行写论文正文的时候会很清楚明了。大纲的整理对我来说还是比较顺利的，在进行未完成的课业学习的同时我的大纲就顺利的通过了。着手就开始就行大量的论文材料的搜索，但是面对浩瀚的知识海洋，瞬间让自己迷失了。但是最后由韩继新老师的讲解，解决了这一个大麻烦，开始了论文的正式写作。我对肉苁蓉的理解并不是很多于是开始了在网上查询肉丛蓉的作用，以及它的药理机制。同时还查询了肉丛蓉可以作用于哪些药物。后发现肉苁蓉是一味补肾益精的药物，具有抗疲劳，抗氧化，调节免疫力等作用。希望在未来科学技术的飞速发展，肉丛蓉可以有更高的应用，也可以作用于更广的人群。