医学检验技术在新型冠状肺炎检测中的进展

　摘要

2019年12月在湖北武汉出现不明原因的肺炎，发生了一定规模程度的感染，出现了不同程度聚集性传入，最终被专家均明确诊断为病毒性肺炎和肺部感染，世界卫生组织将该病毒命名为2019新型冠状病毒（2019-nCoV），SARS-CoV-2是β属冠状病毒。该病毒传染性强，隐蔽性高，主要通过接触传播和飞沫传播，患者初期会出现全身发热，干咳，乏力及呼吸困难等症状，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。因此，选择合适的检测技术和方法可以做出准确，快速的鉴定，在发生大规模的聚集性疫情和疫情多区域爆发流行提供更好的检测方法，同时应尽量减少外出活动并避免去疾病正在流行的地区，新型冠状病毒可以在人与人之间传播，通常是在与被感染的患者密切接触或接触被污染的物品而所造成的感染，在出现发热，乏力，呼吸困难和与发病病例接触后，应及时去医院规定的发热门诊就诊，不可乘坐公共交通工具，避免造成二次感染。

　关键词：肺炎；新型冠状；病毒检测；检测技术

引言

新型冠状病毒为β种属冠状病毒，为单链正股RNA病毒[1]，它与2002年在中国广东省首次发生的严重急性呼吸综合征，2012年在沙特阿拉伯暴发的中东呼吸综合征都属于同一种病毒。它的表面为圆形或椭圆形，并且有向外突起的包膜，新型冠状病毒的直径为40-160nm。病毒的表面有三种蛋白,S蛋白.M蛋白.E蛋白，S蛋白可以与宿主表面受体相结合[2]，M蛋白参与病毒包膜和人体细胞包膜相融合的过程。该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克。该病毒已确认存在人传人现象，且潜伏期具有传染性。新型冠状病毒总体上来说它的结构非常简单，并且没有完整的细胞结构，需要通过人、动物等宿主吸取宿主本身的营养去进行生存，所以在自然界中的病毒十分脆弱，我们可以通过高温高压紫外线照射和乙醇来进行室内消毒，可以通过改变新型冠状病毒的理化性质，采取实际的方法进行日常消毒，同时及时接种疫苗可以有效预防新型冠状病毒型肺炎。

　1新型冠状病毒的检测技术

　　1.1实时荧光定量PCR（RT-PCR)

实时荧光定量PCR属于第二代PCR技术，也称聚合酶链式反应技术，可以对核酸进行定量检测，该方法利用核酸扩增时产生的扩增曲线来对初始浓度进行定量计算[3]，通过聚合酶链式反应，在体外对病毒的RNA进行扩增，通过观察Y荧光来判断人体内含有的病毒，感染者本身病毒量很少，需要进行扩增才可以观察到病毒RNA，CT值即病毒RNA在体外扩增的次数。SARS-CoV-2实时荧光RT-PCR法试剂盒检测主要分为开放阅读框1ab(openreadingframe1ab，OＲF1ab)基因、核壳蛋白基因N片段和包膜蛋白基因E片段3个靶点或ORF1ab和N片段2个靶点已有研究证实，SARS－CoV-2基因组结构自上而下依次由５′非翻译区（UTR）、转录酶复合物（orf1ab）、S基因、E基因、M基因、N基因和３′UTR及几个未知非阅读编码框序列组成[4]。根据理论上，检测的位点越多，其准确度就约高，但在实际的操作应用中，目的点越多，引物和探针的设计就越复杂，因此现有的核酸检测试剂盒分为单个位点，双位点和三位点[5]，位点设计的不完全，还会导致检测阳性率下降，造成检测结果的不准确，新型冠状病毒的遗传物质为单链RNA。在进行核酸检测的过程中包括逆转录和PCR扩增两部分，在逆转录酶的作用下被逆转录为cRNA,然后在DNA聚合酶的作用下对cDNA进行扩增，通过对扩增曲线ct值，可以判断出是否含有病毒和病毒的载量。根据最新的防疫政策，将新冠病毒阴性诊断标准从CT值＞40调整到CT值＞35，实际上是下调了核酸检验阳性的敏感度，可以很大的减少了定点医院的收治压力，优化了医疗资源的分配，也是为了让感染者尽早回归正常的生活，CT值＞35病毒载量较低，并不会导致传染，或者是已治愈的新冠患者在恢复期内也可能存在这种状况。如果标本中的RNA数量很低可能影响最终的扩增效果，导致结果呈假阴性[6]，尽管实时荧光定量RT-PCR技术检测针对于病毒的保守区域进行设计，但由于RNA病毒本身易于出现基因变异，引物，探针和目标序列之间由于病毒改变了基因位点而造成检测性能的下降而造成假阴性的后果，用于检测新型冠状病毒的标本类型有上呼吸道吸物.支气管灌洗液.肺泡灌洗液.深咳痰液.眼结膜拭子.粪便标本和抗凝血标本，根据目前进行大规模核酸采集和快速检测的方向，咽拭子和鼻咽拭子为最佳选择。

　1.2基因测序技术

基因测序技术通过对病毒全基因组的序列，可以帮助人们去了解病毒的遗传信息，指导研究核酸检测产品开发新的治疗方法和研究疫苗，研究病毒的进化或阻止疫情大规模爆发和控制疫情的发展起到了至关重要的作用。宏基因组二代测序(mNGS)主要是用来对微生物基因组序列进行高通量的测序，无须再分离培养微生物，mNGS可以直接从原始临床样本中调查感染微生物[7]，但在未知病原体是何类型病毒时，基于RNA的mNGS方法可以揭示生物体内的整个感染情况，包括DNA病毒RNA病毒、细菌、真菌等[8]，而且错误率低，对新型冠状病毒分析和鉴定的完成，明确病毒的起源和进化，对疾病的控制、预防和针对性治疗有重大意义，但基因测序的时间长，对操作人员和仪器设备的要求高，不适合用于在发生大规模的聚集性疫情和疫情多区域爆发流行进行检测。同时，新型冠状病毒会产生不断发生变异，如果病毒的校对机制较为完整和严格，上下代的基因会保持完全一致。但是新型冠状病毒属于RNA病毒，在复制的过程中校对机制相对不严格，所以会产生变异，如最近由外国传入我国的德尔塔新冠肺炎病毒和奥秘克戎新型冠状病毒，已经出现了不同程度的变异，我们应及时对病毒进行基因分析，可为后续该病毒研究新的治疗方法和检测较为稳定的保守区设计试剂盒。如果试剂盒的靶点相对应的基因位点发生突变，有可能造成检测结果的不准确，还有可能会使新冠病毒的传染性加强，甚至使现有的疫苗效果变差，具体还需要通过基因测序技术进行分析。

　1.3特异性抗体检测

在一般情况下，机体受到病毒的侵害时，会诱发固有免疫应答。机体针表面因子产生的特异性的T细胞和B细胞，病毒的表面因子与细胞表面受体相结合，感染初期IgM抗体大量产生，并且迅速达到峰值，但维持的时间短，是急性感染期的重要诊断指标，之后IgG抗体为主要，IgG持续时间长[9]，可在痊愈后的一段时间内高水平维持，提示感染后期或有既往感染史。目前，已经有大量关于抗体检测方法的报道。SARS-CoV-2IgM抗体的胶体金免疫层析试剂盒[10]，据介绍只需一滴血15分钟就可以出结果，该测对场所及人员的限制，缩短检测用时，已经与核试剂盒检测具有简单高效的特点，打破了现有检验。例如，钟南山院士指导研发的基于检测血液中酸检测等技术联合用于一线病毒感染的监测评估[11]。近期针对奥秘克戎的传播特点，推广抗原筛查、核酸诊断的监测模式，有利于早发现，提高监测灵敏度，隔离观察场所是抗原检测最重要的应用场景，可以减轻核酸检测人员的压力，同时减少核酸检测人员感染的风险，对特定人群筛查起到了重要的作用。

特异性抗体检验最重要的是获得病毒感染后T细胞产生特异性应答所产生的抗体，由于抗体的产生和消失是一个动态过程，选择合适的采样时机非常重要，但是由于对SARA-Cov-2免疫问题缺乏深入的研究，对SARS-CoV-2的抗体试剂研发也带来了极大的困难，并且血液中的有些成分如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等可能存在假阳性的结果。化学发光法灵敏度高准确度好，但由于需要对被检测人员进行抽血，离心，还有需要全自动化学发光仪，在面对规模的聚集性疫情和疫情多区域爆发流行进行检测时无法快速检测出结果，需要的试剂也较为昂贵，所以不太适用于大规模检测，免疫胶体金法灵敏度高准确度好，结果判定明显，并且不需要特殊的设备和仪器，操作方法易短时间掌握，较为适合与基层检验及大批量检测等，但只能进行单个检测，劣于实时荧光定量RT-PCR方法。

　1.4化学发光法检测

化学发光法是将免疫反应的高灵敏性与化学发光的高灵敏性结合起来，建立的一种用于检测微量抗原，抗体，激素，酶等的新型免疫学分析方法，通过新冠病毒抗原的磁珠与血清样本中的IgG/IgM抗体结合为抗原抗体复合物，复合物浓度和化学发光的信号强度成线性关系，通过线性关系可以计算出抗体浓度，可以用于临床标本的检测。

1.5免疫胶体金法检测

免疫胶体金法属于快速病毒诊断技术，它的主要原理是通过微孔滤膜来作为病毒主要的固相载体，并且将血清中的新型冠状病毒抗体与胶体金标记的新型冠状病毒抗原结合形成复合物，如果该复合物与抗体结合成复合物，就会有特殊的显色反应，判断是否阳性，此方法方便快捷，结果判定明显，并且不需要特殊的设备和仪器，操作方法易短时间掌握，较为适合与基层检验及大批量检测等。

2新型冠状病毒的预防

做好新型冠状病毒的预防至关重要。新型冠状病毒是传染性非常强的呼吸道感染性疾病，它的流行范围广，传入能力强，目前全球各地已经出现不同程度的蔓延，我国疫情防控有着丰富的经验和严格的措施，需要做好个人的自我防护。出门一定要戴口罩；不参加聚集性活动；不接触外来人员，尽量减少人员流动，支持就地过年，这是个人卫生的防护。在家时要经常注意保持家中的整洁。手不要直接触摸电梯、门把手等容易病毒携带的地方，外出回家时必须及时洗手，不要触摸粘膜和伤口，因为手在外有机会接触病菌，而这些部位可以导致病毒很容易的直接侵入人体，做好自我的卫生防护。新型冠状病毒的传播方式有飞沫传播和密切接触传播，长时间在空气不流通的高浓度气溶胶情况下，会加大感染几率。我国现在目前最大的威胁来自国外输入人员和物品，面对变种的奥秘克戎和德尔塔毒株存在潜伏期长的状况，入境人员应当按照要求配合落实健康管理措施。我国也发生几起入境物品携带病毒而导致人员造成感染的事例，说明病毒在离开宿主后，在自然环境中仍然存在感染的风险，所以在出入境商品的港口和机场应及时进行消杀，可采取0.5%的过氧乙酸和84消毒液。同时也应及时接种疫苗，保护易感人群。在社会中，比疫情更可怕的是谣言，我们更需要在疫情下保持理智，不要过度恐慌，保持清醒的状态，也不要以谣传谣，造成社会恐慌。从目前的疫情形势来看，全球疫情形势依然严峻复杂，国内疫情呈多点散发，局部爆发，我们更不能有丝毫的麻痹和松懈，坚持外放输入，内放反弹的政策，科学精准的做好疫情防控工作。

总结

实时荧光定量PCR检测技术目前还有一定的缺陷，目前经常使用的实时荧光定量PCR法，其原理主要是根据对病毒的特异性基因进行识别，如果病毒的目的基因序列发生突变，或由于PCR抑制而造成的模板和引物无法匹配，进而影响扩增，就会造成假阴性的后果。同时，采集时间，部位、方法的不同，或者样品处理前操作不当，还有可能患者在疾病初期，本身病毒载量小而造成的漏检，比如，临床上发现部分患者咽拭子检测为阴性，而其下呼吸道分泌物、肺部灌洗液或者血液中核酸检测为阳性，SARA-CoV-2本身作为RNA病毒，其核酸本身较易降解，若在采集过程中，保存、运输中出现问题，均可使RNA降解从而造成假阴性的结果，所以，咽拭子需要在保存液中保存，可使病毒在常温下保存较长时间，内含有高浓度的胍盐可以有效灭活病毒，能够有效组织新冠核酸快速检测操作员的二次感染。基因测序技术可以帮助人们了解病毒的遗传信息，判断出新型冠状病毒的种属，并且根据遗传信息设计出检验病毒靶点的试剂盒，虽然基因测序技术灵敏度好准确度高，但需要先进的仪器设备并且依赖操作人员的专业程度，而且检验时间过长，故不适用于大规模检验。特异性抗体检验最重要的是获得病毒感染后T细胞产生特异性应答所产生的抗体，由于抗体的产生和消失是一个动态过程，选择合适的采样时机非常重要，但是由于对SARA-Cov-2免疫问题缺乏深入的研究，对SARS-CoV-2的抗体试剂研发也带来了极大的困难，并且血液中的有些成分如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等可能存在假阳性的结果。化学发光法灵敏度高准确度好，但由于需要对被检测人员进行抽血，离心，还有需要全自动化学发光仪，在面对规模的聚集性疫情和疫情多区域爆发流行进行检测时无法快速检测出结果，需要的试剂也较为昂贵，所以不太适用于大规模检测，免疫胶体金法灵敏度高准确度好，结果判定明显，并且不需要特殊的设备和仪器，操作方法易短时间掌握，较为适合与基层检验及大批量检测等，但只能进行单个检测，劣于实时荧光定量RT-PCR方法。综上所述，实时荧光定量PCR检测法的灵敏度和特异性较高，人员可以在短时间内学习并应用，费用低，并且需要学习时间短，故可以在大规模的聚集性疫情和疫情多区域爆发流行进行检测，并且我们需要研究更加先进的检测方法，提高准确率和缩减检验时间，需要在不同的情况下选择最为合适的检测方法，可以帮助我们更好的预防和应对新型冠状病毒肺炎的发生。

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